Alta sensibilidad detección de micrometástasis de GFP Lentivirus-transduced organitas cultivados de un Tumor de Colon paciente derivado

Resumen

Para permitir la detección altamente sensible de lo cáncer colorrectal humano difundiendo células (CRC) colonizando los tejidos, aquí mostramos un protocolo para la transducción eficiente de partículas lentivirales proteína fluorescente verde (GFP) en células de organoides derivados de PDX CRC antes de su inyección en ratones receptores, con observación en el microscopio estéreo-fluorescencia.

Resumen

A pesar de avances en el tratamiento del cáncer colorrectal (CRC), muy pocas terapias radicales son efectivas para las etapas finales de la Convención. Para superar este desafío clínico, modelos de ratón tumores xenoinjerto usando muchos Ratón transgénico han desarrollado modelos con tumores y líneas celulares de carcinoma humano de larga trayectoria como modelos preclínicos. Parcialmente mímico las características de los carcinomas humanos, pero a menudo no recapitular los aspectos clave de las malignidades humanas incluyendo la invasión y metástasis. Por lo tanto, modelos alternativos que mejor representan la progresión maligna en el CCR humano han sido esperados durante mucho tiempo.

Mostramos en la presente generación de xenoinjertos tumorales derivados del paciente (PDXs) mediante implantación subcutánea de pequeños fragmentos CRC disecados quirúrgico de un paciente. El colon PDXs desarrollar e histopathologically se asemejan a la CRC en el paciente. Sin embargo, pocos micrometástasis espontáneas son perceptibles en perfiles convencionales de afectados órganos distantes en el modelo PDX. Para facilitar la detección de diseminación metastásica a órganos distantes, extrae las células tumorales de organoide de las PDXs colon en cultura e infectados con lentivirus GFP antes de la inyección en altamente inmunodeficientes Shi/NOD-scid IL2Rγ null Ratones (NOG). Orthotopically inyectan derivados de PDX CRC organoide de células constantemente forma tumores primarios positivos para GFP en ratones receptores. Por otra parte, espontáneamente desarrollando micrometastásica colonias expresando GFP se detectan principalmente en los pulmones de los ratones por microscopía de fluorescencia. Por otra parte, intrasplenic inyección de CRC organoides con frecuencia produce colonización hepática. Tomados en conjunto, estos resultados indican GFP-labelled CRC derivados de PDX organoide células ser visualmente perceptible durante un proceso de varios pasos como la cascada de metástasis invasión. Los protocolos descritos incluyen el establecimiento de PDXs de CRC humana y cultura 3D de las celdas correspondientes de organoide CRC transduced por partículas lentivirales GFP.

Introducción

Cáncer colorrectal (CCR) es la segunda causa de muertes de cáncer en todo el mundo¹. La insuficiente respuesta a las terapias convencionales de pacientes con enfermedad en estadio avanzado indica la ineficacia de los intentos de curar radicalmente CRCs. Para el desarrollo de enfoques terapéuticos más eficaces, se han establecido varios modelos de ratón preclínico de cáncer que imitan las características de la CRC. Varias líneas celulares CRC se han utilizado ampliamente para generar xenoinjertos tumorales debido a su comodidad y facilidad de manipulación. Cultura a largo plazo de líneas celulares de cáncer, sin embargo, a menudo provoca la sele....

Protocolo

La paciente proporcionó consentimiento de informado escrita y el proyecto fue aprobado por el Comité de ética de investigación de la Facultad de medicina de la Universidad de Juntendo. Los experimentos de ratón también fueron aprobados por el Comité de ética de investigación Animal de la Facultad de medicina de Juntendo.

1. establecimiento de CRC PDXs en ratones inmunodeficientes

Procedimientos experimentales para el establecimiento de CRC PDXs (paso 1) se describen en la figura 1A.

1. Preparar el tejido primario de CRC inmediatamente después de la resección quirúrgica del tum....

Resultados

Un adenocarcinoma colorrectal primaria diagnosticada como moderado distinguido había sido resecado quirúrgicamente de una hembra de año 76 con clasificación de TNM, estadio IIIa, seguida de quimioterapia postoperatoria. La principal convención células immunohistochemically mancharon el positivo para Ki-67, cacerola-cytokeratin, el antígeno carcinoembrionario y E-cadherina. Piezas del tumor resecado fueron implantados también por vía subcutánea en ratones NOG para generar el modelo PDX de .......

Discusión

Aunque el modelo PDX CRC ha sido ampliamente empleado para estudiar el crecimiento del tumor primario, si este modelo es también aplicable a la investigación de metástasis del tumor ha no aún se han aclarado completamente. Metástasis espontáneas también fueron apenas detectables en el hígado y los pulmones de varios divulgados colon PDX modelos^4,10. Para detectar micrometástasis con alta sensibilidad, hemos desarrollado un protocolo para la transducción de partíc.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
NOD/Shi-scid IL2Rγ ratones nulos (NOG)	El Instituto Central de Animales de Experimentación,Kanagawa, Japón		Cría ratones machos de 6 semanas de edad en condiciones libres de gérmenes y patógenos específicos
clips de heridas 2× Fabricación	Natsume	Autoclave	-21-S antes de
Jeringa Hamilton tamaño de la aguja: calibre 22	Tokyo Science, Japón		Desinfecte con alcohol al 70% y PBS estéril.
Placa de 6 pocillos	BMBio	#92006
Placa de 12 pocillos	BMBio	#92412
Tubo cónico de 15 ml	Sumitono Baquelita	MS-57150
Tubo cónico de 50 ml	Sumitomo Baquelita	MS-57500
	microtubo Eppendorf	#0030120086	Autoclave antes de usar
Hemocitómetro	Erma	#03-202-1
40μ m filtro de células	Corning	#352340
Matrigel matriz de membrana basal	Corning	#354234	Almacene los aliqupts a -20°C. Coloque en hielo hasta que use
Colagenasa tipo 1	Sigma	#C1030	150 mg / ml colagenasa tipo1 en 1&veces; PBS. Guarde los aliqupts a -20 grados; C por hasta 1 año
Accutase	Innovate Cell Technologies	#5V2623A	Tienda en 4°C.
DMEM/F-12 con GlutaMAX™	Gibco	#10565018	Tienda a 4°C. Cálido a 37° C antes de usar
Cell banker 1plus	ZENOAQ	#628	Almacene a 4°C. Úselo dentro de 1 mes
Penicilina	Gibco	#15140122	Almacene a 4°C. Úselo dentro de 1 mes
Estreptomicina	Gibco	#15140122	Almacene a 4°C. Úselo dentro de 1 mes
hEGF	PEPROTECH	#AF-100-15	Almacene a -20°C. Agregue al medio el mismo día que el uso
Y27632, un inhibidor de ROCK	Wako	#253-00591	Almacenar a -20°C. Añadir al medio el mismo día que el uso
Medio de cultivo	Gibco		DMEM/F-12 con suplemento GlutaMAX™ suplementado con 5% de FBS, 100 U/ml de penicilina y 100 µ g/ml de estreptomicina. Conservar a 4ºC. Utilizar en el plazo de 1 mes.
Medio de cultivo de organoides CRC con 1% o 5% de FCS			DMEM/F-12 con suplemento de GlutaMAX™ (Gibco #10565018) suplementado con 1% o 5% de FCS, 100 U/ml de penicilina, 100 µ g/ml de estreptomicina, 2 ng/ml de hEGF y 10 µ M Y27632, un inhibidor de ROCK. Almacene a 4°C. Úselo dentro de 1 mes.
la transfección FuGENE 6 regent	Roche	11814 443001
Minisart 0.45 µ m filter	Sartorius stedim	17598-K
5 ml tubos de centrífuga de polipropileno	Beckman Coulter	326819
PRRL-GFP	vector Regalo del Dr. Robert A. Weinberg
pCMV-VSV-G	Regalo del Dr. Robert A. Weinberg
pCMV-dR8.2 dvpr	Regalo del Dr. Robert A. Weinberg
el cubo oscilante SW55Ti rotor	Beckman Coulter
a Zeiss Microscopio de fluorescencia estereoscópica Axioplan 2	Zeiss

de de 10 mm, Japón#C usar