Artículo de método

Un modelo de ratón de la obstrucción Intestinal parcial

DOI:

10.3791/57381

⸱

5 de marzo de 2018

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Physiology and Cell Biology, University of Nevada, Reno School of Medicine, 2Department of Physiology, Wonkwang Digestive Disease Research Institute and Institute of Wonkwang Medical Science, School of Medicine, Wonkwang University

* These authors contributed equally

En este artículo

Resumen

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Obstrucciones intestinales son una obstrucción parcial o completa del intestino que puede causar dolor abdominal severo, náuseas, vómitos y evitando el paso de las heces. Este procedimiento para crear tiene obstrucciones parciales intestinal en ratones es confiable en el estudio de los mecanismos de crecimiento celular patológico y la muerte en el intestino.

Resumen

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Obstrucciones intestinales, que impiden o bloquean el movimiento peristáltico, pueden ser causadas por adherencias abdominales y más gastrointestinales (GI) enfermedades incluyendo crecimientos tumorales. Sin embargo, el celular mecanismos de remodelación involucrado en, y causada por, obstrucciones intestinales son poco conocidas. Se han desarrollado varios modelos animales de obstrucciones intestinales, pero el modelo de ratón es más coste/tiempo eficaz. El modelo de ratón utiliza la implantación quirúrgica de una obstrucción intestinal parcial (PO) que tiene una alta tasa de mortalidad si no se realiza correctamente. Además, ratones recibiendo cirugía PO no desarrollan hipertrofia si un bloqueo apropiado se utiliza o no correctamente colocado. Aquí, describimos un protocolo detallado para la cirugía PO que produce obstrucciones intestinales fiables y reproducibles con una tasa de mortalidad muy baja. Este protocolo utiliza un anillo de silicona colocado quirúrgicamente que rodea el íleo que bloquea parcialmente la circulación digestiva en el intestino. La obstrucción parcial hace que el intestino se dilatan debido a la interrupción de circulación digestiva. La dilatación del intestino induce la hipertrofia del músculo liso en el lado oral del anillo que desarrolla progresivamente durante 2 semanas hasta que provoca la muerte. El modelo de ratón PO quirúrgico ofrece un modelo en vivo de hipertrófico tejido intestinal útil para el estudio de los cambios patológicos de las células intestinales incluyendo células del músculo liso (SMC), células intersticiales de Cajal (ICC), PDGFRα+, neuronales y células durante el desarrollo de la obstrucción intestinal.

Introducción

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Obstrucciones intestinales son una obstrucción parcial o completa en el intestino pequeño o grande que impide que alimentos digeridos, líquidos y gases en movimiento a través de los intestinos1. Debido a la obstrucción, la obstrucción induce las paredes intestinales para ser espesada, estrechamiento de la luz2. La obstrucción intestinal puede ocurrir como resultado de cirugías abdominales o pélvicas que causan formación de tejido de adherencias abdominales o de trastornos GI como enfermedades inflamatorias del intestino (enfermedad de Crohn), diverticulitis, hernia, vólvulo, estenosis, invaginación intestinal, estreñimiento, impactación fecal, seudo-obstrucción, tumores y cánceres de3,4,5. Obstrucciones intestinales en estos casos a menudo conducen a la hipertrofia de los muscularis de tunica de los intestino6.

PO de la luz induce distensión intestinal y aumenta el espesor de la capa de músculo liso alrededor de la obstrucción en respuesta a la necesidad de seguir peristaltismo funcional7,8,9,10, 11,12,13. Modelos animales de PO intestinal se han desarrollado para estudiar la hipertrofia del músculo liso en ratones7ratas10, conejillos de Indias11, perros12y gatos13 que constantemente desarrollan hipertrofia similar dentro de la capas del músculo intestinal.

Un modelo de ratón de PO intestinal es la manera más rentable para generar y estudiar obstrucciones intestinales en vivo. Obstrucciones de intestino delgado se llevan a cabo en ratones mediante el uso de un anillo de silicona que se coloca quirúrgicamente alrededor del íleo. El PO los ratones mostraron un incremento temprano en el número de células (hiperplasia) y un aumento en espesor de la capa del músculo (hipertrofia) después PO cirugía8,15. SMC son las principales células plásticas que están creciendo dentro de las capas musculares lisas en respuesta a las condiciones hipertrófica14, sino otras células como los ICC PDGFRα+ células y que están estrechamente asociados con SMC, también se repobló. Hemos divulgado previamente que los ratones PO desarrollan hipertrofia en el intestino delgado, en que SMC son dedifferentiated en células PDGFRα+ que son altamente proliferativas7,15,16. Por el contrario, ICC se degeneró y perdió dentro de las capas de músculo liso hipertrofiado durante el desarrollo de obsruction intestinal7. Otro beneficio importante del modelo PO es su capacidad para inducir cambios en el sistema nervioso entérico y propagación de patrones motores neurogénicos. La importante propagación de patrón motor neurogénica en el intestino de ratón es el migrar motor complejo (MMC), que es neurogénica y no requiere de ICC o de las ondas eléctricas lentas17. El modelo PO puede proporcionar penetraciones claras en cómo MMCs y los nervios entéricos son remodelados por obstrucción parcial.

Aquí, proponemos un protocolo murino para la cirugía PO intestinal usando un anillo de silicona. Ratones que recibieron cirugía PO confiablemente producen hipertrofia en las muscularis de tunica del intestino. Dentro de músculo hipertrófico, SMC, ICC, PDGFRα+y células neuronales son remodeladas dramáticamente.

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Protocolo

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El siguiente protocolo ha sido aprobado por el institucional cuidado Animal y el Comité uso (IACUC) en la Universidad de Nevada Reno (UNR) los recursos y cumple con todas las éticas con respecto al uso de animales de investigación.

1. los animales.

  1. Obtener ratones C57BL/6 de maduro (4-6 semanas de edad) entre 20-30 g. casa de la colonia de ratones de laboratorio en un centro de animales centralizado en UNR los recursos.

2. parcial obstrucción cirugía

Nota: Las cirugías se realizan en una sala dedicada a procedimientos quirúrgicos. Todos los instrumentos quirúrgicos son autoclave antes de la cirugía. Guantes y batas quirúrgicas estériles deben llevarse por todo el personal en la sala quirúrgica en todo momento.

  1. Preparación para el ratón quirúrgico
    1. Compruebe el sistema de anestesia para asegurar el suministro de oxígeno e isoflurano es adecuada para el procedimiento. Encienda el suministro de oxígeno. Encienda el medidor de caudal de gas y ajustar a 500-1000 mL/min lugar el animal en la sala de inducción y la parte superior del sello.
    2. Encienda el vaporizador de isoflurano al 5% y controlar al animal hasta que se convierte en decúbito. Cambiar el sistema de anestesia para el cono de nariz.
    3. Limpie la cámara de inducción de cualquier resto de gas con oxígeno, luego abra la línea de la cámara de inducción manteniendo la línea del cono de nariz.
    4. Retire el animal de la cámara y coloque cuidadosamente la pomada oftálmica en los ojos del animal.
    5. Coloque el cono de nariz en una almohadilla caliente precalentada cuando gas sigue fluyendo.
    6. Cambiar el flujo de oxígeno a 100-200 mL/min, con 2-3% de isoflurano. Si el animal empieza a moverse, gentlyrestrain el animal con el cono de nariz en hasta completamente anestesiados otra vez.
    7. Controlar la respiración y la respuesta a la estimulación durante el procedimiento y ajuste el porcentaje de isoflurano (2-5%) según sea necesario. Nivel de anestesia animal es supervisado por la falta de reflejo de pellizco del dedo del pie antes de realiza la cirugía.
    8. Inyecte analgésicos (buprenorfina, 1 μg/g de peso corporal) por vía intraperitoneal de la zona de la incisión.
    9. Aplicar loción de eliminación de pelo en el abdomen utilizando un hisopo de algodón limpio. Que la loción se siente durante 3-5 min en ratón, luego eliminar el vello utilizando hisopos de Gasa y algodón. Repita este paso hasta que se ha eliminado todo el pelo del abdomen del ratón.
    10. Limpiar la piel con etanol al 70% usando torundas de Gasa y algodón. Aplique solución swabsticks o povidona yodada para limpiar el abdomen.
  2. Cirugía de la obstrucción parcial
    1. Cubra el sitio quirúrgico con papel estéril 25 x 50 cm con 2,5 x 2,5 cm en el centro para el área de cirugía. Asegure el cobertor al animal colocando tiras estériles en los límites de la apertura y la piel.
    2. Hacer una incisión abdominal de cm ~3.0 longitudinalmente con bisturí hoja nº 15, asegurando que sólo la piel es incidida y evitar el corte en la capa de musculoperitoneal en este momento.
    3. Utilizando pinzas y tijeras quirúrgicas, cuidadosamente separe la piel de la capa de musculoperitoneal sin causar ninguna incisión a la capa de musculoperitoneal. Después de que las capas se han separado lo suficiente (aproximadamente 1 cm x 4 cm), identificar la linea alba en la capa de musculoperitoneal y corte ~ 2 cm a lo largo de la linea alba para exponer la cavidad intraperitoneal utilizando micro-pinzas y tijeras.
    4. Cuidadosamente Localice e identifique el ciego. Despacio y con cuidado retire el ciego de la cavidad intraperitoneal con micro-pinzas, trayendo el colon proximal y el ileon con el ciego fuera sobre el cobertor esterilizado. Inmediatamente humedecer el tejido intestinal con una gasa empapada salina estéril 0,9% y mantener tejidos expuestos humedecido en todo momento mientras estén fuera de la cavidad abdominal.
    5. Localice e identifique el mesenterio entre el íleon y el colon proximal. Hacer una incisión (~ 1 cm) paralela a y justo debajo, el íleo, en el mesentery y evite cortar cualquier vasculatura.
    6. Toma un anillo de silicona autoclave (6 mm de longitud, 4 mm de diámetro exterior, diámetro interior de 3,5 mm). Cortar longitudinalmente para abrir el tubo y abrir el anillo con micro pinzas.
    7. Inserte un extremo del anillo abierto a través de la incisión en el tejido del mesenterio. Devolver el anillo a una forma de anillo terminado poniendo un extremo en contacto con otro, con el íleon rodeado por el anillo.
    8. Asegurar que el anillo de silicona rodea completamente el íleo y cerrar el anillo con la sutura cuidadosamente vuelva a colocar el intestino en la cavidad intraperitoneal.
  3. Cierre de la cirugía
    1. Realizar una simple sutura continua en la capa de musculoperitoneal a lo largo de la linea alba para cerrar el musculoperitoneal la herida con una sutura absorbible. Una vez finalizada la sutura, limpiar cualquier sangrado con una gasa empapada salina estéril 0,9%.
    2. Para cerrar completamente la herida con una sutura de nylon separadas, realizar una sutura continua simple en la piel.
    3. Ambas suturas cuando hayan terminado, limpie la herida con nuevo swabstick o povidona yodada.
    4. Inyectar por vía intraperitoneal antibióticos (gentamicina, 150 μL por ratón basado en el peso corporal de 20-30 g).
    5. Después de la terminación del procedimiento, apagar el vaporizador de isoflurano y dejar que el animal respirar sólo fluye oxígeno hasta que empezar ganando consciencia.
    6. Una vez que el animal está despierto, colocar al animal en un área de recuperación separado con soporte térmico hasta que se recuperó completamente.

3. posterior a la operación observación.

  1. Después de la terminación de la cirugía, mueva los animales a una incubadora en una sala de recuperación donde se regulación la temperatura y la humedad. Monitorear los animales después de la operación cada 15 minutos durante la primera hora después cada 30 min para la segunda hora mientras los animales están en la incubadora.
  2. Tan pronto como la observación prescrita esté completa, mueva los animales a su jaula individual y controlarlos diariamente para indicaciones clínicas del dolor18y para asegurar que la herida está sanando correctamente sin signos de complicaciones ( dehiscencia) presente.

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Resultados

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Obstrucción parcial (PO) fue quirúrgicamente inducida en ratones de un mes de edad colocando un anillo de silicona alrededor del íleo cerca el esfínter ileocecal. Este anillo creado una obstrucción parcial en el íleo. Operaciones simuladas (tan) se realizaron sin un anillo de edad/sexo emparejado ratones y estos ratones no mostraron síntomas similares a los encontrados en ratones de PO. Ratones se recuperaron rápidamente de cirugía PO dentro de unas horas. No demostraron ninguna cambios c...

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Discusión

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Hemos demostrado que ratones recibiendo la cirugía PO intestinal consistente y reproducible desarrollan hipertrofia del músculo liso intestinal, que imita a la obstrucción intestinal humana. Cirugía de obstrucción intestinal ha sido desarrollado para diferentes animales, incluyendo ratones7,10de ratas, conejillos de Indias11, perro12 y gatos13. El modelo de ratón de la obstrucción intestinal tiene tiemp...

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Divulgaciones

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Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

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Los autores desean dar las gracias a Benjamin J Weigler, D.V.M., pH.d. y Walt Mandeville, D.V.M. (recursos animales y Campus asistir a médico veterinario, Universidad de Nevada, Reno) por su excelente servicio de animal suministrado a los ratones, así como su asesoramiento en procedimientos quirúrgicos.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Paño quirúrgicoSuministros médicos y veterinariosSMS4040" X100 yardas
Underpad, econ, pro plusSuministros médicos y veterinariosMSC28122417x24"
Tijeras de irisBraintree scientific, IncSC-i-130
Tijeras de irisVantageV95-304
Pinzas electrónicas y de joyería DumontDumont98-180-3
Sutura reabsorbible trenzadaCovidien polysorbSL-5687G5-0, poliglactina
Nylon monofilamento no absorbibleAD quirúrgicoS-N618R136-0, nylon
Cuchilla quirúrgicaDynarexNo.15
PortaagujasJacobson microvascular36-1342TC8.5 pulgadas
Mango de bisturíFlinn scientificAB1049
Tijera microquirúrgicaWPI 503305
Vaselina ungüento oftálmicoPuralube VET3,5 g
Fluriso (isoflurano)VetoneV1 502017250 ml
Cierre cutáneo reforzado Steri-strip3MR1547
Guantes quirúrgicosMedlineMSG2270
Mascarilla facial con lazo para la orejaLa zona de seguridad EsponjasRS700
AvantCuidadoPRM25444
Copa quirúrgicaAdmiral  craft OYC-2725-A422.5 oz
SwabstickChloraPrep2601032% con clorhexidina   Gluconato (CHG) y 70% v/v de alcohol isopropílico (IPA)
Aplicador con punta de algodónPuritan806-WC
BuprenorfinaZoo pharm BZ80693171 mg/ml
Gentamicina sulfatoVetoneG-6336-04100 mg/ml
Gel removedor de crema de acción rápidaVeet
JeringaAHSAH01T25161 ml con aguja
Anillo de siliconaVWR60985-7206 mm de longitud, 4 mm de diámetro exterior, 3,5 mm de diámetro interior
C57BL/6 ratonesThe Jackson Laboratory4-6 semanas de edad
no tejidas de gasa 8111002

Referencias

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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