Expresión de transgenes de mediada por Virus adeno-asociado en neuronas genéticamente definidas de la médula espinal

Resumen

Inyección intraspinal del recombinase dependiente recombinante virus adeno-asociado (rAAV) puede utilizarse para manipular cualquier tipo de célula genéticamente marcadas en la médula espinal. Aquí describimos cómo transduce las neuronas en el asta dorsal de la médula espinal lumbar. Esta técnica permite interrogatorio funcional del subtipo neurona manipulada.

Resumen

Manipulación selectiva de subpoblaciones neuronales espinales se ha logrado principalmente mediante dos métodos diferentes: 1) concurrencia genética, por el que se generan ratones transgénicos dobles o triples con el fin de lograr la expresión selectiva de un reportero o un efector gen (por ejemplo, desde el locus Rosa26) en la población de columna deseada. 2) inyección intraspinal de las virus Cre-dependiente de adeno-asociado recombinante (rAAV); Aquí vectores AAV Cre-dependiente que codifica para el gen reportero o efectora de elección se inyectan en la médula espinal de los ratones que expresaban recombinase de Cre en la subpoblación neuronal deseada. Este protocolo describe cómo generar vectores rAAV de Cre-dependiente y que transduce las neuronas en el asta dorsal de la médula espinal lumbar segmentos L3-L5 con rAAVs. Como los segmentos de columna vertebral lumbares L3-L5 están inervados por las neuronas sensoriales periféricas que transmiten información sensorial de los miembros posteriores, pueden ser espontáneo comportamiento y respuestas a las pruebas sensoriales aplicadas en el miembro posterior ipsolateral al lado de inyección analizados con el fin de interrogar a la función de las neuronas manipuladas en el procesamiento sensorial. Ofrecemos ejemplos de cómo puede utilizarse esta técnica para analizar genéticamente definición subconjuntos de neuronas espinales. Las principales ventajas de la expresión del transgén mediada por virus en Cre ratones transgénicos en comparación con la expresión inducida de ratón transgénico de reportero clásica son los siguientes: 1) diferentes Cre-dependiente rAAVs codificación de varias proteínas de reportero o efector puede ser inyectado en una sola línea transgénica Cre, superando así la necesidad de crear varios Ratón transgénico múltiples líneas. 2) inyección intraspinal limita la manipulación de células expresan Cre para el sitio de inyección y el tiempo después de la inyección. Las principales desventajas son: 1) expresión del gen reportero de rAAVs es más variable. 2) la cirugía es necesaria para transducir las neuronas espinales de interés. Cual de los dos métodos es más apropiado depende de la pregunta de investigación y población neurona a abordarse.

Introducción

La médula espinal dorsal es esencial para el intercambio de información entre la periferia del cuerpo y el cerebro. Estímulos sensoriales como calor, frío, tacto, o estímulos nocivos son detectados por las neuronas periféricas especializadas, que transmitan esta información a las neuronas del cuerno dorsal de la médula espinal. Aquí, una compleja red de interneuronas inhibitorias y excitatorias modula y eventualmente relés de información sensorial a través de las neuronas de proyección espinal a supraspinal sitios^1,2. Los cálculos realizados por espinal inter- y las neuronas de proyección de información sensorial, determinando así que la información es suprimida o reenviada a que intensidad la puerta. Cambios en la integración de estímulos sensoriales, como un balance alterado entre inhibición y excitación, pueden causar disfunciones sensoriales tales como hipersensibilidad o alodinia (sensaciones dolorosas después del estímulo normalmente no doloroso). Estos cambios se cree que la causa subyacente del dolor crónico de diferentes Estados de^3,4. Así, los circuitos espinales son de gran importancia en el procesamiento sensorial y por lo tanto en la percepción del ambiente de un organismo y el yo. Con el advenimiento reciente combinación de molecular, genética y técnicas quirúrgicas que permiten la manipulación precisa de subpoblaciones genéticamente identificado neurona espinal, los científicos están empezando a entender los circuitos espinales subyacentes responsable de la elaboración de distintas modalidades sensoriales.

Inyección intraspinal de rAAV en ratones de tipo salvaje o transgénicas ha contribuido enormemente a la manipulación, análisis y comprensión de la función de subconjuntos específicos de neuronas espinales^{5,6,7, 8 , 9 , 10 , 11}. esta técnica permite la entrega de proteínas marcadoras (como GFP / proteínas de la fusión de GFP), proteínas de reportero (como GCaMP), o proteínas efectoras (como toxinas bacterianas, channelrhodopsin o receptores Farmacogenético) en un espacial manera restringida a las neuronas espinales. Inyección local de Cre-dependiente rAAVs en ratones transgénicos que expresaban recombinase de Cre en un subconjunto específico de neuronas espinales permite el análisis específico de la población neuronal respectiva. Hemos empleado esta técnica para etiqueta, ablar, inhibir o activar glycinergic espinal neuronas demostrando que son una parte esencial de la columna puerta de control del dolor y picor de transmisión⁷. En estos experimentos, inyección intraspinal de rAAV Cre-dependiente en ratones GlyT2::Cre permitió la manipulación selectiva de las neuronas glycinergic en la médula espinal lumbar. De tal modo, puede evitarse la manipulación simultánea del supraspinal circuitos que contienen neuronas de glycinergic fundamentales para la supervivencia del animal.

Mientras que una inyección intraspinal de rAAVs limita la infección en el sitio de la inyección, transducción viral puede ocurrir no sólo en las neuronas locales, sino también en las neuronas que conectan con el sitio de la inyección mediante proyecciones axonales. El último es a menudo utilizado para áreas de CNS de seguimiento proporciona entrada neuronal a un núcleo particular en el cerebro. La infección de proyecciones axonales, sin embargo, también puede ser un factor de confusión cuando una población definida de neuronas debe estudiarse en un sitio en particular. Para tratar estos temas, recientemente hemos realizado un análisis exhaustivo de serotipos AAV y cassettes de expresión para identificar los serotipos y los promotores que pueden utilizarse para minimizar o maximizar la transducción retrógrada. En el contexto de esta investigación específica en circuitos espinales, se analizó la capacidad de diferentes serotipos y promotores retrogradely transduce las neuronas en los ganglios de raíz dorsal (GRD), la médula rostral ventromedial (RVM) y la corteza somáticosensorial ¹². la técnica se describe en este protocolo, por tanto, puede utilizarse para analizar las neuronas espinales en el sitio de inyección o analizar las neuronas de proyección que aportar en el sitio inyectado de la médula espinal. En el protocolo descrito aquí, tres inyecciones de rAAV en el lado izquierdo de la médula espinal lumbar se realizan para habilitar la transducción de señales de las neuronas en los tres segmentos lumbares (L3-L5). Los segmentos L3-L5 reciben la mayor parte de la entrada sensorial de la trasera ipsolateral en el sitio de inyección. Demostramos que la manipulación funcional de las neuronas genéticamente marcadas en L3-L5 es suficiente para evocar cambios en el comportamiento robustos, proporcionando pruebas funcionales para la función de circuito de un subtipo de neurona marcada genéticamente.

Protocolo

Todos los experimentos con animales fueron aprobados por la Oficina veterinaria cantonal suizo (Zurich) y están de acuerdo y conformidad con todas las directrices pertinentes del reguladoras e institucionales.

Nota: Todos los materiales junto con los respectivos fabricantes o proveedores están listados en la Tabla de materiales.

1. generación de vectores AAV Cre-dependiente

Nota: Puede adquirirse una gran variedad de vectores de Cre-dependiente con diferentes promotores (véase Tabla de materiales) o, si la construcción de la expresión deseada no está disponible, puede generarse mediante la modificación de construcciones existentes de AAV. Tenga en cuenta, el promotor y el serotipo pueden tener un impacto en la propagación de la transducción viral (ver ¹²). La primera parte de este protocolo describe brevemente la generación de dos diferentes vectores AAV Cre-dependiente adecuados para ganancia y pérdida de los experimentos de la función, respectivamente.

1. Activación farmacogenética (ganancia de función)
   1. Orden pAAV.hSyn.flex.hM3D (Gq)-mCherry (véase Tabla de materiales) para receptores diseño activados exclusivamente por drogas de diseño (DREADD)-mediada por la activación.
   2. Al recibir la cultura bacteriana stab, raya a las bacterias en placas de LB (grado bacteriológico agar disuelto en medio líquido Luria-Bertani) complementado con el antibiótico apropiado. Incubar durante la noche a 37 ° C y escoger una sola Colonia en el día siguiente.
      Nota: Plásmidos que contienen AAV vector genomas pueden ser inestables y recombinación del genoma viral, especialmente dentro de la terminal invertida viral repite (ITR), puede ocurrir durante la amplificación en e. coli. Se sugiere uso de recA-deficiente/suprimido cepas tales como MDS42 o Stbl3 para evitar recombinación dentro del plásmido que contiene el genoma AAV.
   3. Amplificar las bacterias siguiendo las instrucciones dadas por el proveedor elegido Maxi-Kit de ADN y preparación de DNA plasmídico de alta calidad con un ADN-Maxi-Kit disponible comercialmente (por ejemplo, véase Tabla de materiales). Realizar un control de calidad de la preparación de DNA plasmídico mediante la verificación de la integridad y la identidad del plásmido ADN a través de la recopilación de la restricción de una alícuota de ADN del plásmido.
      Nota: Existen sitios de reconocimiento para el endonuclease de la restricción SmaI dentro el RTI. Incluir un resumen de SmaI en el control de calidad para verificar la integridad de la RTI.
   4. Enviar el ADN a una instalación de base de vectores virales para producir alta calidad rAAV.
      Nota: Alto título, preparaciones virales de alta calidad son cruciales para evitar confundir fenotipos causados por contaminación de la preparación viral. Por lo tanto recomendamos el rAAV de elección producida en una instalación de base de vector establecido, a menos que la producción de AAV está bien establecida en el laboratorio.
2. Ablación (pérdida de la función)
   Nota: Toxinas bacterianas o receptores de la toxina se pueden utilizar para mediar la ablación celular o neuronal de silenciamiento. Hemos generado pAAV.EF1α.flex.DTA al fragmento de la toxina de difteria expresa A (DTA) en una forma dependiente de la Cre.
   1. Para generar un vector viral dependiente de la Cre, elegir un vector dependiente de la Cre con un promotor adecuado (p. ej., pAAV.EF1α.flex.hChR2(H134R)-eYFP). Amplificar la secuencia de codificación de elección (p. ej., DTA) por reacción en cadena de polimerasa con las cartillas que incluyen AscI y NheI o sitios de reconocimiento compatible endonuclease de la restricción en sus voladizos (véase Foster et al. ⁷)
   2. Mediante técnicas de biología molecular estándar, realizar resúmenes de la restricción del vector de la DNA (pAAV.EF1α.FLEX.hChR2(H134R)-eYFP) y de la polimerización en cadena-amplificado (NheI-DTA-AscI) con las endonucleasas de restricción AscI y NheI. Ligar los fragmentos purificados.
   3. Transformar la reacción de la ligadura en las bacterias adecuadas, según el protocolo dado por el proveedor de las bacterias competentes de elección y las bacterias en placas de LB de la placa. Uso de recA-deficiente/suprimida las cepas, como MDS42 o Stbl3, para la clonación y posterior amplificación del plásmido ADN.
   4. El día después de la transformación, selección de clones e inocular en medio LB suplementado con el antibiótica apropiada durante la noche a 37 ° C. Al día siguiente, extraer ADN de plásmido de las bacterias cultivadas. Verificar la exitosa clonación de resúmenes de la restricción y la secuencia del ADN plásmido extraído.
   5. Amplificación de alta calidad, DNA plasmídico bacteriano (ver paso 1.1.3). Enviar el ADN amplificado a un centro de base de vectores virales para la producción de virus.

2. transducción de las células espinales

1. Preparación de la solución antivirus
   PRECAUCIÓN: Los virus son reactivos infecciosos y deben ser manejados según las directrices pertinentes. En la mayoría de los casos, rAAVs pueden ser manejados en el nivel de bioseguridad 1 (BSL1).
   1. En el día de la inyección, descongele una alícuota stock del virus purificado deseada en el hielo y mantenerlo en hielo hasta directamente antes de la inyección. Evite ciclos repetidos de congelación descongelación, ya que éstos reducirá la concentración eficaz del virus.
      Nota: Si es necesario, el descongelado virus alícuota puede conservarse a 4 ° C hasta 3 días.
   2. Diluir las partículas de virus en estéril 0,9% NaCl o fosfato tampón salino (PBS).
      Nota: El título apropiado depende de los objetivos experimentales y debe determinarse experimentalmente. Una buena carga viral total para empezar es 3 x 10⁹ copias de genoma (3.33x10¹² GC/mL, 3 x 300 nL inyectado). Exceso de tomar y algo de pérdida al cargar el capilar en cuenta, se necesitarán cerca de 2.5 μl de la solución antivirus para cada ratón.
2. Preparación de Micropipetas para inyecciones intraspinales
   1. 'Tirar' de Capillares de vidrio de paredes finas (diámetro exterior 1 mm) en un tirador de la micropipeta para crear un ~5.5 mm., bajo la caña. Utilice ajustes de programa 00 y un filamento calentador de 3.0m m con p (a) adaptada como en la tabla 1.
      Nota: Tirar puede hacerse por adelantado. Los capilares se deben guardarse en un envase cerrado en modelado en arcilla para evitar el polvo, que más adelante pueda obstruir la micropipeta. Autoclave de Micropipetas no es necesario.
   2. Clip de la caña del tubo capilar tirado con pinza laminectomía a una longitud de aproximadamente 4.5 a 5 mm para crear una punta con un diámetro interno de 25-35 μm. Utilizando un microscopio con una escala del micrómetro, mida el diámetro interior de varios Micropipetas para obtener una sensación de cómo es grande la apertura debe ser o medir para cada micropipeta.
      Nota: Un Consejo más pequeño puede conducir a la obstrucción; una punta más grande puede causar daño a los tejidos y las dificultades para penetrar en la médula espinal.
3. Preparación de la instalación quirúrgica y herramientas
   1. Asegúrese de que el equipo está limpio y listo para ser utilizado. Desinfectar el área de trabajo limpia con etanol al 70% y esterilizar las herramientas por autoclave o les desinfección de. No deje ningún desinfectante en la jeringa microliter que dañen el vector viral para ser utilizado.
4. Anestesia y preparación del Animal para la cirugía
   Nota: La duración total de la cirugía es de 60-90 min.
   1. Elegir ratones de 6 a 10 semanas de edad para facilitar el procedimiento quirúrgico.
      Nota: Si lo requiere el diseño experimental, es posible la inyección de los animales más jóvenes o más viejos. Cualquier tensión y ambos sexos se pueden utilizar en principio, pero utilizan la misma tensión de fondo (por ejemplo C57BL/6J) para la comparación de comportamientos entre líneas de ratón transgénico diferente. Si las diferencias de sexo se espera o para investigar, analizar los machos y las hembras en grupos separados.
   2. Inducir la anestesia con isoflurano ~ 5%. Coloque el animal en el marco estereotáxicas sobre una estera de calor y mantener la anestesia en 1-2.5% isoflurano (900 mL/min de velocidad de flujo de aire). Monitorear la tasa de respiración a lo largo de la cirugía.
   3. Aplique ungüento lubricante ocular para evitar la desecación corneal durante la cirugía.
   4. Afeita la parte posterior del animal y limpiarlas con cuidado con los tejidos húmedos. Desinfectar la piel depilada con solución de iodo y permitir que la piel se seque.
   5. Dar tratamiento analgésico (por ejemplo, 0.1-0.2 mg/kg de buprenorfina por vía subcutánea).
5. Exposición de la Columna Vertebral a nivel Lumbar de la médula espinal
   Nota: Debido al desarrollo diferencial de la médula espinal y la columna vertebral, los respectivos niveles no están alineados, pero el segmento lumbar de la médula espinal L4 está en el mismo nivel que la vértebra torácica T13.
   1. Localice el par de costillas más caudal palpando a lo largo de la columna vertebral. Con un bisturí, hacer un corte longitudinal de 1.5-2.5 cm en la piel a partir de justo rostral al par más caudal de la costilla.
   2. Levante la piel con pinzas y sepárela del músculo subyacente con las tijeras. A lo largo de la cirugía, mantener los tejidos expuestos húmedos con estéril 0,9% NaCl.
   3. Con pinzas finas y pequeñas tijeras, hacer una incisión en la capa membranosa siguiente, delgada justo al lado de la línea media y cortado de las apófisis espinosas. Está separado del músculo subyacente paraspinous, pero unido a los procesos espinosos.
6. Identificación de las vértebras a nivel Lumbar de la médula espinal
   Nota: Una vez que está expuesta la columna vertebral, los ligamentos intertransversales y las apófisis espinosas dorsales debe ser visibles. Varios puntos anatómicos pueden ayudar en la identificación de la vértebra correcta a blanco (figura 1B).
   1. Tire de la piel hacia la cola para exponer la cresta ilíaca. En el mismo nivel, el par más caudal de ligamentos intertransversales visibles se une a la apófisis Espinosa L6. Contar hacia atrás en un caudal a rostral hacia identificar la vértebra de interés.
   2. Palpe a lo largo de la columna vertebral. El par más caudal de la costilla se encuentra justo rostral a la vértebra de T13 y hueso pélvico a nivel de la cadera es a nivel de la vértebra L6.
   3. Localizar el punto donde el tendón a lo largo de la columna vertebral es más blanco y más medial. La vértebra T13 encuentra justo rostral. El segmento de la médula espinal lumbar L4 se encuentra dentro de esta vértebra.
7. Fijación de la Columna Vertebral y la exposición de la médula espinal Lumbar
   1. Colocar el animal sobre un colchón de tejidos enrollados para elevar a las abrazaderas espinales del marco estereotáxicas.
   2. Fijar la vértebra de destino para evitar movimientos de la columna vertebral debido a la respiración. Para ello, alinee las abrazaderas adyacentes a la vértebra de objetivo, fijar una abrazadera en la posición y mantenga la columna vertebral con pinza Adson mientras la segunda abrazadera de fijación.
      Nota: La columna debe ser perpendicular al plano de inyección y fijado firmemente para que no se mueve a presión desde arriba. Si es necesario, un segundo par de abrazaderas puede fijarse en la columna vertebral. En este caso, es útil fijar los dos pares de pinzas a las dos vértebras adyacentes a la vértebra de destino.
   3. Quitar los músculos paraspinous sobre las vértebras de interés. Con bisturí, realizar una incisión paralela justo medial a los tendones que son paralelos a la columna vertebral, así como incisiones perpendiculares rostral y caudal en la vértebra de destino. Tenga cuidado de no cortar demasiado profundo. Desgarro/corte lejos el músculo utilizando gubias. Usar pinzas si es necesario para remover el tejido restante sobre la vértebra o por encima de la duramadre en el espacio intervertebral.
   4. En el espacio intervertebral, el vaso sanguíneo dorsal debe ser visible el midline de la médula espinal de la marca. Para inyecciones unilaterales, realizar una laminectomía parcial por taladrar un agujero en el centro del lado de destino de la vértebra. Utilice una odontología fina aparato con una fresa esférica de 0.5 mm de perforación y taladro especial cuidado al acercarse a la médula espinal. Quite cualquier restantes fragmentos de hueso con una aguja biselada de 26G para exponer la médula espinal.
   5. Utilizando una aguja biselada de 26G, perforar la duramadre en el agujero y en el espacio intervertebral rostral y caudal a la vértebra del destino, aproximadamente 200 μm lateral a los vasos sanguíneos dorsal. Líquido cefalorraquídeo deben escapar de los agujeros y la médula espinal se deben bombear ligeramente hacia fuera.
8. Preparación de la jeringa de inyección
   Nota: La jeringa de inyección debe ser preparada inmediatamente antes del comienzo de la inyección para reducir el riesgo de partículas de polvo que la micropipeta.
   1. Monte el tubo capilar de vidrio en un microlitro la jeringa con la aguja desmontable de compresión en el paquete. Fije la tuerca firmemente para asegurar un ajuste apretado y seguro.
   2. Llene la jeringa microliter con agua destilada estéril y empezar a presionarlo con el émbolo.
      Nota: Si hay demasiada resistencia para que el agua no se sale fácilmente de la punta, la micropipeta es probable que se bloquea y debe cambiarse.
   3. Montar la jeringa en un micromanipulador conectado a un microinyector controlado electrónicamente. Tenga cuidado de no tocar nada con la micropipeta.
   4. Usando el microinyector, elaboración de alrededor de 1 μl de aire para crear una burbuja entre el agua y el virus.
   5. Coloque una gota 2,5 μl de solución de antivirus en un pedazo de la película de parafina, mueva con cuidado la punta de la micropipeta a la gota usando el marco estereotáxicas y redactarla. Luego con cuidado Presione dispensar hasta que salga un poco de solución de antivirus en la punta.
   6. Retraiga la jeringa y, utilizando un lápiz, marque la micropipeta con una escala y tenga en cuenta el nivel de la solución de virus; Esto facilitará el seguimiento de si la infusión es progresando conforme a lo programado.
9. Inyecciones intraspinales
   1. Mover la punta de la micropipeta sobre uno de los agujeros en la dura y luego hacia abajo hasta una abolladura leve se observa en la duramadre. Para la inyección en el cuerno dorsal espinal, bajar 500 μm en incrementos consecutivos de 100 μm (1 mm/s de velocidad) y luego 200 para arriba permitir la estabilización mecánica del tejido.
      Nota: La profundidad final de la punta es el μm 300 en este caso, pero puede ser adaptada según la zona de destino.
      1. Si el tejido es resistente a la penetración, la micropipeta puede coger en la duramadre. En este caso, repliegue y mueva ligeramente cubren el orificio, o usar la aguja otra vez perforar la duramadre correctamente antes de repetir el intento de penetración.
   2. Programar la bomba a un volumen de inyección blanco de 300 nL a una velocidad de inyección de 50 nL/min y presione el botón start para comenzar la infusión.
   3. Una vez finalizada la inyección, Compruebe la escala para ver si ha bajado el nivel de virus y deje la micropipeta en lugar de un 3 minutos adicionales equilibrar antes de retraer lentamente la jeringa la presión.
   4. Repita el paso 2.9.1.-2.9.3. para los inyección de dos sitios.
10. Sutura y la recuperación
    1. Quite las abrazaderas del espinales y el cojín debajo del ratón.
    2. Cerrar la herida en capas con suturas interrumpidas, suturar las capas de tejido superficial con suturas absorbibles y la piel con suturas no absorbibles. Aplicar desinfectante de yodo en la herida suturada.
    3. Terminar la anestesia y deja el animal en la estera de calor hasta que recupera antes de regresar a su jaula casera.
11. Cuidados postoperatorios
    1. Supervisar la salud de los animales en el día de la cirugía, al día siguiente y luego cada 2-3 días. Asegúrese de que el animal tiene un paso normal, un aspecto saludable (peso, ojos, pelaje y comportamiento), y que la herida está cicatrizando.
    2. Continuar el tratamiento con analgésicos (por ejemplo, 0.1-0.2 mg/kg de buprenorfina por vía subcutánea) según sea necesario, tres veces al día.

3. análisis del conductuales y morfológicos

1. Análisis del comportamiento
   Nota: Deje que los animales para adaptarse a la configuración respectiva por lo menos 30 minutos antes de comenzar las mediciones para hacerles adaptarse al nuevo entorno experimental.
   1. Prueba de von Frey
      1. Coloque animales individualmente en compartimientos individuales de unos 10 cm x 10 cm en un suelo de rejilla metálica.
      2. Estimular la superficie plantar de la hindpaw ipsilateral al sitio de inyección con un filamento de von Frey dinámico. Tenga en cuenta la fuerza que el animal se retira su pata desde el estímulo.
      3. Repetir cinco veces y calcular el umbral de retiro promedio de las seis medidas para cada animal.
   2. Prueba del pinchazo de alfiler
      1. Colocar animales en compartimentos individuales de unos 10 cm x 10 cm en un suelo de rejilla metálica.
      2. Estimular la superficie plantar de la hindpaw ipsilateral al sitio de la inyección con una aguja 26-G blunted sin penetración de la piel. Puntuación de comportamiento como cero (sin reacción) o uno (reacción).
      3. Repetir 9 veces con intervalos de 3 min entre estímulos y calcular el porcentaje de respuesta de 10 mediciones de cada animal.
   3. Inyección de ligando DREADD clozapina-N-óxido (CNO)
      1. CNO se disuelven en dimetil sulfóxido (DMSO) para crear una solución de 0,2 mg/μl, que puede ser almacenado a temperatura ambiente.
      2. En el día del experimento, diluir la solución madre en estéril 0,9% NaCl a 0,2 μg/μl y se inyectan 10 μl/g de peso corporal por vía intraperitoneal. Inyectar animales de control con vehículo (0.2% de DMSO en 0.9% NaCl).
         Nota: Según la experiencia, efectos pico de comportamientos pueden ser esperado 1-3 h después de la inyección, y efectos deben desaparecen totalmente después de 24 h. En el caso de activación de las neuronas glycinergic, observa comportamientos incluyen respuestas reducción de dolor y picor. Comportamientos por DREADD mediada por activación de las neuronas depende de los subconjuntos específicos de neuronas espinales.
   4. Inyección de Pruritogens para inducir prurito
      1. Disolver pruritogens en 0.9% NaCl a soluciones de 8 mg/mL (cloroquina) o 10 mg/mL (histamina). 2 h después de la administración de la CNO, inyectan 10 μl de solución vehículo o pruritogen por vía subcutánea en la superficie plantar de la hindpaw ipsilateral al sitio de la inyección espinal. Por otra parte, inyectar por vía intradérmica el pruritogen en la pantorrilla, que ha sido afeitada un día antes para reducir la conducta aversiva causada por el afeitado sí mismo.
   5. Video para analizar Nocifensive espontánea o picor inducido por Pruritogen comportamientos
      1. Coloque animales individualmente en compartimientos transparentes (unos 10 cm de diámetro) con un poco de ropa de cama de su respectivo hogar-jaula en el piso.
      2. Grabar en video los animales durante 5 min a registro espontáneo y 30 min para registrar comportamientos inducidos por pruritogen. Analizar los videos off-line en contenedores de 5 minutos.
   6. Dolor Versus comportamientos de picor
      1. Vea y recuerde pestañear, lamer y morder los comportamientos.
         Nota: Vacilar y lamiendo de sitio afectado son considera las respuestas al dolor, mientras que pican se asocia con prurito.
      2. Analizar videos a velocidad normal, medir el tiempo que el ratón pasó lamiendo o mordiendo el sitio afectado o medir en camara lenta para una distinción más precisa entre lamer y morder los reflejos. Como alternativa, contar el número de combates, lamer, morder/vacilar.
2. Análisis morfológico
   1. Realizar análisis morfológicos de una a tres semanas después de la inyección del virus o al final de un experimento conductual.
      Nota: Hemos detectado la expresión de eGFP en cuanto a 48 h después de la inyección, pero también encontró que expresión aumenta significativamente en los próximos días y hasta semanas. Para las células con expresión fuerte reportero, una semana de incubación (de inyección intraspinal hasta perfusión) puede ser suficiente. Para células con expresión débil transgenes, virus con promotores débiles o fluoróforos más débil, se requiera una expresión más larga para asegurar niveles detectables.
   2. Fijación del tejido
      1. Perfusión cada transcardially de ratón, primero con de 20 mL de solución de helado líquido cefalorraquídeo artificial (ACSF) (NaCl 125 mM, NaHCO₃ 25 mM, NaH₂PO₄ 1,25 mM, D-glucosa 20 mM, 2.5mm de KCl y CaCl2 2 mM MgSO4 1 m m), luego a 100 mL de paraformaldehído helada al 4% (en buffer de fosfato de sodio de 0,1 M, pH 7.4).
         PRECAUCIÓN: Paraformaldehido es tóxica y debe manipularse con cuidado.
      2. Diseccionar la médula espinal lumbar y después fijar el tejido por 2 h con paraformaldehído al 4% en el hielo. Lavar brevemente el tejido posterior fijo con tampón de fosfato sódico de 0,1 M (pH 7,4) y luego la incubar en la solución de sacarosa al 25% (en tampón de fosfato de sodio de 0,1 M, pH 7.4) durante la noche a 4 ° C.
      3. Cortar el tejido de cryoprotected a 30 μm en un criostato y Monte las secciones en portaobjetos de microscopio.
   3. Tinción de inmunofluorescencia
      1. Después de lavado breve en PBS, aplicar 300 μL de solución de bloqueo (10% de suero Normal de burro en 0.3% Triton-PBS) en las secciones por 1 h a temperatura ambiente.
      2. Incube los portaobjetos con 300 μL de las respectivas combinaciones de anticuerpos primarios en solución de bloqueo (véase Tabla de materiales) durante la noche a 4 ° C. Lávese las secciones 3 veces por 5 minutos cada uno en PBS.
      3. Incube los portaobjetos con las respectivas combinaciones de anticuerpos secundarios en solución de bloqueo durante 1 hora a temperatura ambiente. Lávese las secciones 3 veces por 5 minutos cada uno en PBS.
      4. Brevemente enjuague los portaobjetos en ddH₂O y luego montar el cubreobjetos con medio de montaje fluorescente.
      5. Adquisición de imágenes fluorescentes utilizando un microscopio confocal equipado con 20 x y un objetivo de 40 x.

Resultados

Con el fin de ilustrar los niveles de expresión que pueden ser obtenidos por la inyección intraspinal de rAAV codificando una proteína del marcador, primero inyectamos AAV1. CAG.eGFP en la médula espinal lumbar de los ratones de tipo salvaje. Tres inyecciones espaciadas aproximadamente 1 mm de separación producción una infección casi continua de segmentos espinales lumbares L3 a L5 (figura 1A-C). Inyección de virus a una profundidad de 300 μm...

Discusión

Inyección intraspinal de aireación puede convertirse en una poderosa técnica en un laboratorio de investigación, lo que permite el análisis de células espinales con solución temporal y espacial de alta. Este protocolo permite la transducción de los tres principales segmentos espinales inervados por neuronas sensoriales ampliando sus axones periféricos a la trasera. Transducción de tres segmentos produce datos conductuales robustos y reproducibles. También permite la prueba de un área sensorial más grande que posible desp...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Equipment
oxígeno Oxymat3	Weinmann	NA
unidad de anestesia: VIP 3000 Vaporizador Veterinario	Midmark	NA
Afeitadora eléctrica	Philips	BT9290
microscopio quirúrgico (OPMI pico)	Zeiss	NA
Aparato estereotáxico para animales pequeños	Kopf	NA
Neurostar StereoDrive (opcional)	Neurostar	NA
Modelo 51690 Adaptador espinal para ratón Cunningham	Harvard Apparatus	72-4811
Bomba de jeringa PHD Ultra con nanomito	Harvard Apparatus	70-3601
Hamilton 701 RN 10 μ l jeringa de microlitro de vidrio	Hamilton	7635-01
Hamilton Accesorio de compresión de aguja extraíble (RN) 1 mm	Hamilton	55750-01
aparato de perforación de odontología fina: Osada success 40	Osada	OS-40
cortador esférico, 0,5 mm	Busch	12001005B
anestesiómetro electrónico von Frey	IITC	23905
pelos flexibles de von Frey	IITC	#7
LSM710 Pascal microscopio confocal	Zeiss	NA
0.8 NA × 20 Plan-objetivo apocromático	Zeiss	NA
1.3 NA × 40 EC Plan-Neofluar objetivo de inmersión en aceite	Zeiss	NA
strong>Name	Company	Número de catálogo	Comments
Herramientas quirúrgicas
	Fine Science Tools	10004-13
Tijeras Bonn Extra Finas	Fine Science Tools	14084-08
Pinzas Adson, 1 x 2 dientes, 12 cm	Fine Science Tools	11027-12
Friedman-Pearson rongeurs, curvado, copa de 0,7 mm	Fine Science Tools	16121-14
Pinza de laminectomía Dumont #2	Fine Science Tools	11223-20
Portaagujas Olsen-Hegar, dentado, longitud de abrazadera de 8,5 mm	Fine Science Tools	12002-12
Pinzas finas #5	Fine Science Tools	11254-20
Name	Company	Número de catálogo	Comentarios
Consumibles y productos químicos
vidrio de pared delgada, diámetro exterior de 1 mm	World Precision Instruments	TW 100-3
Jeringas (1, 5 y 20 ml)	B. Braun	(9166917V, 4606051V, 4606205V)
26G Aguja biselada	B. Braun	4665457
Hojas de bisturí estériles	B. Braun	BB523
Suturas quirúrgicas Safil Quick+ 4/0, reabsorbibles	B. Braun	C1046220
Suturas quirúrgicas Premilene 5/0, no absorbibles	B. Braun	C0932191
PBS estéril o solución salina (0,9%)		NA
Etanol, 70% (desinfectante)		NA
Solución de yodo (p. ej., Braunol)	B. Braun	18380
Anestésicos (p. ej., Attane isoflurano)	Provet	2222
Aldasorber	Provet	333526
analgésicos (p. ej., buprenorfina: temgesic)	Indivior	GTIN: 7680419310018
Oftálmico ungüento (p. ej. vita-pos)	Pharma medica	GTIN: 4031626710635
Bastoncillos de algodón (p. ej. de)	FIV Hartmann	1628100
Pañuelos faciales (p. ej. de)	Uehlinger AG	2015.10018
Portaobjetos de microscopio Superfrost plus	ThermoScientific	J1800AMNZ
Name	Company	Número de catálogo	Comments
Ratones
C57BL/6J ratones (wildtype)	The Jackson Laboratory	RRID:IMSR_JAX:000664
Rorbtm1.1(cre)Ratones Hze/J (RORβ Cre)	El Laboratorio Jackson	RRID:IMSR_JAX:023526
Gt(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomate)Ratones Hze/J (R26Tom)	El Laboratorio Jackson	RRID: IMSR_JAX:007914
Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Vectores virales
AAV1. CB7. CI.eGFP.WPRE.rBG (AAV1. CAG.eGFP)	Núcleo vectorial Penn	AV-1-PV1963
AAV1. CAG.flex.eGFP.WPRE.bGH (AAV1. CAG.flex.eGFP)	Núcleo vectorial Penn	AV-1-ALL854
AAV1. CAG.flex.tdTomato.WPRE .bGH (AAV1. CAG.flex.tdTomato)	Penn Vector Core	AV-1-ALL864
AAV1. EF1a.flex.DTA.hGH (AAV1. EF1a.flex.DTA)	Penn Vector Core	Producción
AAV1.hSyn.DIO.hM3D(Gq)-mCherry.hGH (AAV.flex.hM3D(Gi))	Penn Vector Core	Producción
Name	Company	Número de catálogo	Comments
>Plásmidos
pAAV.hSyn.flex.hM3D(Gq)-mCherry	Addgene	44361
pAAV.EF1α. flex.hChR2(H134R)-eYFP	Addgene	20298
Nombre	Company	Número de catálogo	>Comentarios
Bacterias
MDS42	ScarabGenomics
Stbl3	ThermoScientific	C737303
Nombre	Compañía	Número de catálogo	Comentarios
Reactivos
EndoFree Plasmid Maxi Kit	Quiagen	12362
NucleoBond PC 500	Machery & Nagel	740574
clozapina-N-óxido (CNO)	Enzo Life Sciences	BBL-NS105-0025
sal de difosfato de cloroquina	Sigma	C6628
histamina	Sigma	H7125
Dapi	Invitrogen	D3571
Name	Company<	strong>Número de catálogo	Comentarios
Anticuerpos (dilución)
Conejo anti-GFP (1:1000)	Sondas moleculares	RRID:AB_221570
Conejo anti-NeuN (1:3000)	Abcam	RRID:AB_10711153
Cabra anti-Pax2 (1:200)	R & D Systems	RRID:AB_10889828
Cobaya anti-Lmx1b (1 : 10 000)	Dr Carmen Birchmeier	Muller et al. 2002
Conejo anti-GFAP (1 : 1000)	DakoCitomatación	RRID:AB_10013382
Anticuerpos secundarios criados en burro (1:800)	Jackson ImmunoResearch Laboratories	NA