Proyección de imagen de células vivas proporciona una riqueza de información en las células o poblaciones enteras que es inalcanzable por célula fija la proyección de imagen solamente. Aquí, se describen protocolos de células vivas para evaluar las decisiones de destino celular después del tratamiento con el fármaco anti-mitotic paclitaxel.
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Artículo de método
A largo plazo células vivas imágenes para evaluar el destino de la célula en respuesta a Paclitaxel
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Resumen
Resumen
Proyección de imagen de células vivas es una técnica poderosa que puede utilizarse para visualizar directamente los fenómenos biológicos en las células durante largos períodos de tiempo. En la última década, nuevas e innovadoras tecnologías han mejorado grandemente la utilidad de las imágenes de células vivas. Las células pueden mantenerse ahora en foco y continuamente reflejada durante varios días mientras se mantuvo en 37 °C y 5% CO2 condiciones de cultivo celular. Por otra parte, múltiples campos de vista representando a diferentes condiciones experimentales puede ser adquirido al mismo tiempo, proporcionando así datos experimentales de alto rendimiento. Proyección de imagen de células vivas ofrece una considerable ventaja sobre la proyección de imagen fija-cell por lo que permite la visualización directa y la cuantificación temporal de eventos celulares dinámicos. Imágenes de células vivas también pueden identificar la variación en el comportamiento de las células que de lo contrario habría sido perdido usando análisis basado en la población. Aquí, describimos protocolos imágenes de células vivas para evaluar las decisiones de destino celular después del tratamiento con el fármaco anti-mitotic paclitaxel. Demostrar métodos para visualizar si mitotically detuvieron mueren células de mitosis o slip en interfase. También describimos cómo el sistema de indicadores (FUCCI) ciclo de celular ubiquitinación base fluorescente puede utilizarse para evaluar la fracción de células de la interfase de deslizamiento mitótico que son capaces de volver a entrar en el ciclo celular. Finalmente, se describe un método de proyección de imagen de células vivas para identificar eventos de ruptura del envoltorio nuclear.
Introducción
Drogas anti-mitotic han sido utilizadas en los regímenes quimioterapéuticos de varios tipos de tumores sólidos y a menudo muestran gran eficacia1,2,3. Mecánico, estos fármacos interrumpir progresión mitótica normal y promover la detención mitótica en proliferar rápidamente las células cancerosas. Sin embargo, el destino de la célula en respuesta a la detención mitótica es muy variable: mientras que una fracción de las células sufre la muerte celular de mitosis, otros salida de mitosis y regresar a la interfase como células tetraploides (un proceso llamado mitosis deslizamient....
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Protocolo
Este protocolo se centra en el uso de la no-transformado y cromosómico estable retiniana pigmentada epitelial (RPE-1) línea celular para experimentos de células vivas. Sin embargo, este protocolo adaptable a cualquier línea celular adherente que las condiciones de cultivo celular se ajustan según sea necesario. Todos los procedimientos deben adherir a regulaciones y directrices éticas y de bioseguridad institucional.
1. preparación de las células de proyección de imagen de células vivas
- Utilizar las células de RPE-1 pasaje recién descongelada y principios expresando humano histona que H2B unida a una proteína fluorescente....
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Resultados
Utilizando el protocolo descrito anteriormente, las células de RPE-1 expresando GFP H2B fueron tratadas con un control anti-mitotic o vehículo (DMSO) y analizadas por proyección de imagen de células vivas. El análisis reveló que 100% de las células del EPR-1 control mitóticas iniciado anafase un promedio de 22 minutos después de entrar en mitosis (figura 1A, 1D). Por el contrario, las células de RPE-1 tratadas con paclitaxel exhibieron una pr.......
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Discusión
El aspecto más crítico de las imágenes de células vivas a largo plazo es garantizar la salud de las células se va a examinar. Es esencial que las células de estar expuesto a estresores ambientales extraños mínima, como deficientes condiciones de temperatura, humedad y niveles de CO2 . También es importante limitar el fotoenvejecimiento de iluminación fluorescente de la excitación, como imagen de estrés es conocido por afectar la célula comportamiento50. Limitar el fotoenvejecimiento pue.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
AFB, MAV y NJG gustaría agradecer Ryan Quinton para comentarios sobre el manuscrito y Adrian Salic para la construcción de TDRFP-NLS. AFB y MAV son financiados por la beca de formación NIGMS Biomolecular Farmacología 5T32GM008541. NJG es miembro de la Shamim Ashraf Dahod mama cáncer Research Laboratories y es apoyado por subvenciones de NIH GM117150 y CA-154531 la Karin Grunebaum Foundation, el programa de premios de la familia de Smith, el programa de eruditos de Searle y la investigación del Melanoma Alianza.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| sin rojo de fenol, DMEM:F12 media | Hyclone | SH3027202 | |
| 10% de suero fetal bovino (FBS) | Gibco | 10438026 | |
| 100 UI/ml de penicilina y 100 mg/ml de estreptomicina. | Gibco | 15070063 | |
| PBS | Gibco 10010049 | ||
| 0.25% Tripsina/EDTA | Gemini | 50-753-3104 | |
| Plato de imagen con fondo de vidrio de 12 pocillos | Cellvis | P12-1.5H-N | |
| Paclitaxel | TSZ Chem | RS036 | |
| Dimetilsulfóxido (DMSO) | Sigma | NC0215085 | |
| Ambiental Cámara | In Vivo Scientific | ||
| 5% CO2 | Airgas | Z03NI7432000201 | |
| 15 mL Tubos cónicos | Fisherbrand | 05-539-12 | |
| Placas de cultivo de tejidos de poliestireno de 10 cm | Falcon | 08772E | |
| 10 mL Pipeta serológica desechable | Fisherbrand | 4488 | |
| 5804R Centrífuga de 15 amperios | Eppendorf | 97007-370 | |
| 1000 microlitros Pipeta | Gilson | Pipetman Classic | |
| 20 microlitros Pipeta | Gilson | Pipetman Classic | |
| p1000 Puntas de pipeta | Sharp | p1126 | |
| p20 Puntas de pipeta | Sharp | P1121 | |
| RPE-1 Celdas | ATCC | CRL-4000 | |
| Incubadora Galaxy 170S | Eppendorf | CO17011005 | |
| Pipette Boy | Integra 156401 | ||
| Hemacitómetro | Fisher Scientific | 0267110 | |
| Nikon Ti-E-PFS Microscopio invertido para imágenes de células vivas Micro Video | Instruments, Inc. | ||
| Sistema de escenario X-Y anterior e iluminador LED de luz blanca Micro Video Instruments | , Inc. | 500-H117P1N4 | |
| Prior Proscan 3 Controller XYZ con codificadores | Micro Video Instruments, Inc. | 500-H31XYZE | |
| Cámara digital Andor Micro Video Instruments | , Inc. | D10NLC | |
| Nikon NIS Elements AR Software | Micro Video Instruments, Inc. | ||
| Iluminador LED SOLA para micro instrumentos de video fluorescente | , Inc. | SOLA-E | |
| InVivo con control de flujo de CO2 Micro Video | Instruments, Inc. | Ti-IVS-100 | |
| Ti-ND6-PFS Revólver Motorizado de Enfoque Perfecto | Micro Video Instruments, Inc. | ||
| Torreta de condensador del sistema Ti-C | Micro Video Instruments, Inc. | ||
| Ti-C LWD LWD Unidad de lente para torreta de condensador del sistema | Micro Video Instruments, Inc. | ||
| Te-C LWD Ph1 Módulo | Micro Video Instruments, Inc. | ||
| CFI Plan Fluor DLL 10X Objectivena 0.3 wd 16mm | Micro Video Instruments, Inc. | ||
| CFI Super Plan Fluor ELWD 20xc ADM Objetivo | Micro Video Instruments, Inc. |
Referencias
- van Vuuren, R. J., Visagie, M. H., Theron, A. E., Joubert, A. M. Antimitotic drugs in the treatment of cancer. Cancer Chemother Pharmacol. 76 (6), 1101-1112 (2015).
- Chan, K. S., Koh, C. G., Li, H. Y. Mitosis-targeted anti-cancer therapies: where they stand. Cell Death Dis. 3
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Reimpresiones y permisos
