Este protocolo describe un método sencillo y conveniente para marcar y visualizar energizados cromosomas en las células mitotic usando la etiqueta Histone2B-GFP BacMam 2.0 y un sistema de microscopia confocal spinning disc.
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Artículo de método
Imágenes de células vivas de la segregación de cromosomas durante la Mitosis
En este artículo
Resumen
Resumen
Los cromosomas deben ser fiable y uniforme separados en células de la hija durante la división celular mitótica. Fidelidad de la segregación cromosómica es controlado por múltiples mecanismos que incluyen el eje montaje puesto de control (SAC). El saco es parte de un sistema complejo que es responsable para la prevención de un progreso de la célula por mitosis salvo los cinetocoros cromosómicos se han unido para huso de microtúbulos. Cromosomas anormales y retraso cromosómico segregación es un indicador de puntos de control de ciclo celular disfuncional y pueden utilizarse para medir la estabilidad genómica de dividir las células. Desregulación del saco puede resultar en la transformación de una célula normal en una célula maligna a través de la acumulación de errores en la segregación cromosómica. Implementación del saco y la formación de los cinetocoros complejo están estrictamente regulados por interacciones entre quinasas y fosfatasas como proteína fosfatasa 2A (PP2A). Este protocolo describe la proyección de imagen de células vivas de los cromosomas en fibroblastos embrionarios de ratón aislados de ratones que tenían un nocaut de la subunidad reguladora de la PP2A-B56γ del revestimiento. Este método supera las deficiencias de otros ciclo celular control técnicas de imagen como la citometría de flujo o inmunocitoquímica que sólo proporcionan una instantánea de un estado de citocinesis de la célula, en lugar de una visualización dinámica espaciotemporal de los cromosomas durante la mitosis.
Introducción
En el siguiente protocolo, describimos un método conveniente para visualizar la segregación cromosómica y la progresión mitótica durante el ciclo celular en fibroblastos embrionarios de ratón usando histona 2B-GFP, etiquetado BacMam 2.0 y proyección de imagen de células vivas.
Puestos de control de ciclo celular monitor segregación cromosómica y juegan un papel importante en el mantenimiento de la integridad genética de la célula 1,2,3. Acumulación de los cromosomas segregados mal puede llevar a aneuploidía, que es una característica de los tumores....
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Protocolo
Todos los experimentos llevados a cabo en estos estudios fueron realizados según protocolos de actuación aprobados por el cuidado de Animal institucional y Comité de uso en el centro de investigación de alimentos y drogas (FDA).
1. aislamiento y cultivo de fibroblastos embrionarios de ratón (MEFs)
- Aislar los fibroblastos embrionarios de ratón (MEFs) de una cepa de PP2A-B56γ-ratón y hermanos de camada de tipo salvaje por protocolo estándar 7,8,9.
- ExpandMEFs para 3 pasajes, congelar y almacenar hasta que se necesite para experimen....
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Resultados
MEFs de tipo salvaje y PP2A-B56γ-ratones fueron sembradas en un vidrio de cubierta de la cámara 2-bien y permitidos para fijar. En el día 2, MEFs se sincronizaron con 0.1% FBS para 24 h. El día 3, MEFs en medios con 200 ng/mL nocodazole y 30 regentwere de PPC CL-HB se incubaron durante 18 h a 37° C y 5% CO2. El día 4, las células fueron fotografiadas utilizando un sistema de microscopio confocal de disco giratorio (figura 1). En vivo la .......
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Discusión
Puestos de control del ciclo celular que garanticen la segregación cromosómica precisa evitar aneuploide y celular transformación 1,2,3. En el presente estudio, encontramos que la inactivación de PP2A-B56γ resultó en un puesto de control de montaje de husillo debilitado. Celular directo imágenes nos permitieron observar la segregación errores cromosómica durante la mitosis en la MEFs de PP2A-B56γ tratados con nocodazole
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Divulgaciones
Los autores declaran que no tienen intereses financieros que compiten.
Agradecimientos
Nos gustaría agradecer al Dr. Guo-Chiuan Hung y Dr. Bharatkumar Joshi valiosos comentarios que mejoraron el manuscrito.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| DMEM/F12 | Gibco | 11320082 | |
| L-Glutamina | Gibco | 25030081 | |
| MEM Solución de aminoácidos no esenciales (100X) | Gibco | 11140050 | |
| Penicilina-Estreptomicina (10.000 U/mL) | Gibco | 15140122 | |
| Dulbecco' s Fosfato Solución salina tamponada | Gibco | 14190144 | |
| Tripsina-EDTA | Gibco | 25300054 | |
| Suero fetal bovino | Atlanta Biologicals | S11150 | |
| DMSO | EMD Millipore | MX 1458-6 | |
| Cajas de almacenamiento de viales criogénicos | Fisherbrand | 10-500-28 | |
| Viales criogénicos | Corning/costar | 431416 | |
| Matraces T75 | Cellstar | 658175 | |
| 2 cubreobjetos de cámara | bien Cunc | 155380PK | |
| Cellometer Vision Cell Profiler | Nexcelom Bioscience LLC | Cellometer Vision Trio | |
| Nocodazol | Sigma | M1404 | |
| CellLight Histone 2B-GFP, BacMam 2.0 | Thermo Fisher Scientific Inc. | C10594 | |
| Zeiss Cell Observer Disco giratorio Sistema de microscopio confocal | Carl Zeiss Microscopía | Zeiss Cell Observer SD | |
| Baño de agua | Thermoscientific | 280 series | |
| Incubadora | Sanyo soluciones comerciales | MCO-18AIC (UV) | |
| Clase II Cabina de seguridad biológica | The Baker Company | SterilGard | |
| Software Axiovision | Zeiss | Ver.4.8.2 | |
| Software ImageJ | Instituto Nacional de Salud | Ver. 1.51r |
Referencias
- Funk, L. C., Zasadil, L. M., Weaver, B. A. Living in CIN: Mitotic Infidelity and Its Consequences for Tumor Promotion and Suppression. Dev Cell. 39, 638-652 (2016).
- Etemad, B., Kops, G. J. Attachment issues: kinetochore transformations and s....
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Reimpresiones y permisos
