Cuantificación espacial de fármacos en lesiones de Tuberculosis pulmonar por Laser Capture Microdissection líquido cromatografía espectrometría de masas (LCM-LC/MS)

Resumen

Aquí, describimos un protocolo usando el microdissection de la captura del laser juntada con el análisis por LC/MS para cuantificar espacialmente la distribución de drogas dentro de granulomas de la tuberculosis pulmonar. El enfoque tiene amplia aplicabilidad para cuantificar concentraciones de medicamentos en los tejidos de alto detalle espacial.

Resumen

La tuberculosis sigue siendo una causa importante de morbilidad y mortalidad en todo el mundo. Mejoras en los regímenes de fármacos existentes y el desarrollo de nuevas terapias son urgentemente necesarios. La capacidad de los medicamentos dosificados para alcanzar y para esterilizar bacterias dentro de regiones necróticas poco vascularizado (caseum) de granulomas pulmonares es crucial para la intervención terapéutica exitosa. Regímenes terapéuticos eficaces deben contener fármacos con propiedades de penetración de caseum favorable. Los métodos actuales de LC/MS para cuantificar los niveles de fármaco en tejidos biológicos tienen una limitada capacidad de resolución espacial, lo que dificulta determinar con exactitud las concentraciones de la droga absoluta dentro de los compartimientos pequeños de tejido como las que se encuentran dentro de granulomas necróticos. Aquí presentamos un protocolo con microdissection de la captura del laser (LCM) de regiones de tejido patológico distinto de cuantificación LC/MS. Esta técnica proporciona la cuantificación absoluta de drogas dentro de granuloma caseum, que rodea la lesión celular y tejido pulmonar y, por lo tanto, determina con exactitud si se están alcanzando concentraciones bactericidas. Además de la investigación de la tuberculosis, la técnica tiene muchas aplicaciones potenciales para cuantificar espacialmente resueltos de fármacos en los tejidos enfermos.

Introducción

La capacidad de resolver espacial y cuantificar niveles de drogas es un requisito crucial para determinar si los medicamentos contra la tuberculosis llegar a subpoblaciones bacterianas dentro de las lesiones pulmonares en concentraciones¹de esterilización. De especial importancia es determinar penetración de drogas en la base necrótica de la lesión (llamada caseum), que normalmente contiene el mayor número de bacilos y puede acceso a los medicamentos debido a la ausencia de vascularización.

Los métodos tradicionales para evaluar la penetración de la lesión, que implican la homogeneización de las lesiones pulmonares s....

Protocolo

Todos los estudios animales se llevaron a cabo con arreglo a la guía para el cuidado y uso de animales de laboratorio de los institutos nacionales de salud con la aprobación de la atención institucional de Animal y el Comité uso de NIAID (NIH), Bethesda, MD.

1. animales de experimentación y colección de tejido

Esta sección del protocolo describe los procedimientos animales y recolección de muestras en condiciones de bioseguridad nivel 3 (BSL3). Protocolos detallados de la tuberculosis de la micobacteria aerosol infección procedimiento drogas administración y protocolos en conejos han sido describen previam....

Resultados

Un resumen del enfoque LCM-LC/MS se muestra en la figura 1. Después de la esterilización del tejido por irradiación gamma, todos los pasos posteriores (de tejido a partir de seccionamiento) llevará a cabo fuera de las condiciones de BSL3. La figura 2 muestra la lesión secciones de biopsia antes y después del aislamiento de tejido por LCM. Áreas necróticas y celulares de las lesiones de TB fácilmente identificadas y aisladas media.......

Discusión

Cuantificación espacialmente resueltos de drogas dentro de las lesiones pulmonares de TB es necesaria para determinar si exposición alcanza concentraciones esterilización de poblaciones bacterianas que reside dentro de los compartimientos diferentes de la lesión. El método de LCM-LC/MS que se describe aquí permite la cuantificación absoluta de drogas anti-TB en todos los compartimientos de la lesión, incluyendo el caseum ricos en bacterias, usando solamente secciones de tejido de 1-3 en total. Homogeneización de tejidos .......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Conejos blancos de Nueva Zelanda	Covance	N/A
HN878 Mycobacterium tuberculosis	BEI Resources	NR-13647
Ketathesia (Ketamina) 100 mg/mL C3N	Henry Schein Animal Health	56344
Anased (xilacina) 100 mg/mL	Henry Schein Animal Health	33198
Euthasol (pentobarbital sódico y fenitoína sódica) Solución	Virbac	710101
Acetonitrilo (grado LC-MS)	Fisher	A955-212
Metanol (grado LC-MS)	Fisher	A456-212
Ácido fórmico (grado LC-MS)	Fisher	A117-50
Agua (grado LC-MS)	Fisher	W6212
Tubos de PCR de tapa plana de 0,2 mL	Corning	07-200-392
Bastidores de acero, membrana de PET	Leica	11505151
Premium Portaobjetos de microscopio esmerilado	Fisher	12-544-2
96 Placa de pocillo profundo 2,0 ml PP Columna RB	Fisher NC0363259
Zorbax SB-C8 (4,6 por 50 mm; tamaño de partícula, 3,5 μ m)	Agilent	820631-001D
"Cremallera" Selle las bolsas de muestra	Fisher	01-816-1B
Name	Company	Número de catálogo	Comentarios
Equipo
CM1850 criostato	Leica	Descatalogado Leica	CM1860 es el modelo actual
Sistema de microdisección láser 6500	Leica	Descatalogado	Leica LMD 6 es el modelo actual
Agilent 1260 Infinity II HPLC	Agilent
API 4000 QTRAP Espectrómetro de masas	Sciex