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Artículo de método

Investigación de reclutamiento de la proteína a las lesiones del ADN usando 405 Nm láser Micro-irradiación

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DOI:

10.3791/57410

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20 de marzo de 2018

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biology, Université de Sherbrooke

* These authors contributed equally

En este artículo

Resumen

Estudiar la cinética de reparación de daños de ADN requiere un sistema para inducir lesiones en regiones definidas del nucleares. Se describe un método para crear localizados roturas de doble cadena utilizando un microscopio confocal de escaneo láser equipado con un 405 nm láser y procedimientos automatizados para cuantificar la dinámica de los factores de reparación de estas lesiones.

Resumen

La respuesta de daño de DNA (DDR) utiliza una gran cantidad de proteínas para detectar la señal y reparar las lesiones del ADN. Delineación de esta respuesta es fundamental para entender los mecanismos de mantenimiento del genoma. Puesto que el reclutamiento y el intercambio de proteínas en las lesiones son altamente dinámicos, su estudio requiere la capacidad para generar daños en el ADN de una manera rápida y espacialmente delimitado. Aquí, describimos los procedimientos para inducir localmente el daño de la DNA en células humanas usando un microscopio confocal escaneo láser comúnmente disponible equipado con una línea de láser de 405 nm. Acumulación de mantenimiento genoma factores en rayas de láser pueden evaluarse por inmunofluorescencia (IF) o en tiempo real utilizando proteínas etiquetadas con reporteros fluorescentes. Utilizando fosforiladas histonas H2A. X (γ-H2A.X) y replicación de proteína A (RPA) como marcadores, el método proporciona suficiente resolución para discriminar factores contratados localmente que difunda en cromatina adyacente. Además proporcionamos scripts basados en ImageJ para controlar eficientemente la cinética de la relocalización de la proteína al ADN dañan sitios. Estos refinamientos simplifican enormemente el estudio de la dinámica de la DDR.

Introducción

Las células están constantemente expuestas a las fuentes endógenas y exógenas de daño en el ADN que amenazan su integridad genómica. El DDR es un conjunto de vías que detectan, señalan y reparacion las lesiones del ADN para mantener la estabilidad del genoma de señalización. En roturas de doble hebra de DNA (distritales), lo DDR se produce principalmente en dos plataformas complementarias: γ-H2A.X-labeled cromatina y una región de ADN (ssDNA) monocatenario resecada normalmente recubierta de ssDNA-enlace complejo EPR1,2.

UV-láser micro-irradiación de células sensibilizadas previamente con la timidina analógica 5-bromo-2' desoxiuridina (BrdU) o el tinte de ADN bisbenzimide etóxido trihydrochloride (BBET, Hoechst 33342) crea una mezcla de lesiones de ADN, como roturas de cadena simple ( SSBs) y distritales que provocan una DDR localizada en la cromatina y el ssDNA plataformas3,4. Trabajos previos demostraron que reclutamiento de factores de mantenimiento del genoma para estas dos plataformas distintas en el OSD puede ser discriminado con láseres de alta energía UV-A (335-365 nm) combinados con IF2,5. Microscopios equipados con estos láseres son costosos ya que requieren un láser de alta energía y dedicados objetivos de transmisión UV-A haciéndolos mucho menos frecuente en contextos académicos y farmacéuticos que microscopios confocales de escaneo láser con láser de 405 nm líneas. El estudio de reclutamiento de la proteína y el intercambio en los sitios de micro-irradiado también queda excluido por el análisis de imagen manual laborioso requerido para describir el comportamiento dinámico de los factores de mantenimiento del genoma.

Aquí, mostramos que la sensibilización previa de las células con tinción de ácido nucleico BrdU o BBET seguida de irradiación de micro usando una 405 nm láser a un microscopio confocal común permite el monitoreo de la dinámica de factor de mantenimiento de genoma en las lesiones del ADN. Γ-H2A.X o subunidades complejo de RPA como marcadores de la plataforma junto con z de apilamiento para mayor profundidad de campo y deconvolución resolución permite al experimentador discriminar los factores que son reclutados localmente a distritales a las que se extendió a Dominios de cromatina grande que rodea la lesión inicial. Esta sub-clasificación según distintos compartimentos intra nucleares ayuda a perfeccionar los roles potenciales de desacostumbrada proteínas reclutadas a sitios irradiados de micro. Además, ofrecemos protocolos convenientes y optimizado tuberías para analizar rápidamente la dinámica de los factores de mantenimiento del genoma usando el software de código abierto Fiji (una distribución de ImageJ)6,7,8. Estos refinamientos a los métodos de micro-irradiación actuales hacen el estudio de la DDR posible en prácticamente cualquier entorno de laboratorio.

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Protocolo

1. la sensibilización de las células

  1. 24 h antes del experimento de micro-irradiación de semillas 40.000 U2OS células por pocillo en 1 x DMEM que contiene 10% FBS en cultivo 8-bien diapositivas con fondos de 170 μm de espesor como cubreobjetos de vidrio y polímeros para transmitancia máxima de 405 nm de luz láser y la proyección de imagen excelente con un escaneo láser confocal microscopio invertido. Si usa un 8 bien microslide, use 500 μl de medios o soluciones por pozo para todos los tratamientos posteriores y pasos de lavado del protocolo.
    Nota: Debido a su morfología plana, buena adherencia y núcleos grandes, U2OS células facilitan la detección de reclutamiento de la proteína en sitios irradiados micro pero pueden utilizarse otros tipos de células adherentes según sea necesario. Las células deben idealmente ser alrededor 80% irradiado de confluencia en el tiempo de irradiación de micro para aumentar el número de células por experimento. Confluencia de muy alta puede resultar en alteraciones del ciclo celular que pueden perturbar vías de reparación específicos como recombinación homóloga que ocurre durante las fases S y G2 del ciclo celular9.
  2. Incube las células durante la noche a 37 ° C con 5% CO2y luego la sensibilizar las células (paso 1.3) BrdU o (1.4) BBET (Hoechst 33342).
    Nota: Para observar el reclutamiento directo de una proteína de interés (POI) para las lesiones del ADN, transfectar o transduce la DNA del plasmid llevando una fusión entre una proteína fluorescente y un POI las 24 horas después de la siembra de la célula. 24 h post-transfection/transducción de señales, la sensibilizar y micro-irradian las células para controlar la contratación de la PDI en los sitios de daño de ADN en tiempo real.
  3. Para aumentar el número de consejos escolares distritales generados por exposición a la 405 nm láser, añadir 10 μm de BrdU a los medios durante 24 h antes de la irradiación de micro. Antes de la irradiación del micro, utilizando una micropipeta, enjuague las células dos veces con medio sin rojo de fenol para máxima exposición de las células a los láser de 405 nm.
  4. Por otra parte, tratar células durante 15 min con BBET a 10 μg/mL en el medio apropiado en una incubadora de cultivo de células a 37 ° C. Después del tratamiento, Lave dos veces con medio sin rojo de fenol antes micro-irradiación.

2. micro-irradiación de células

  1. Seleccionar un adecuado microscopio confocal de escaneo láser.
    Nota: Los experimentos aquí presentados fueron realizados en un sistema de microscopio equipado con una 50 mW 405 nm láser línea y un objetivo de aceite de apertura numérica de 1.4 X 63. Para generar distritales, células fueron irradiadas por micro 1 X scan zoom a 1.024 x 1.024 píxeles/campo (0.21 μm/píxeles en 63 X de ampliación) y en modo unidireccional en 8 μs/píxel. La potencia del láser utilizada fue de 25% y 80% para las células BBET y BrdU-pre-sensibilizadas, respectivamente. Para ayudar a los usuarios configurar su sistema, el objetivo después de la energía láser en el sistema presentado se midió con un medidor de potencia según las instrucciones del fabricante. Las mediciones corresponden al 2.6 mW y 7.0 mW para BBET y BrdU-pre-sensibilizadas las células, respectivamente.
  2. Encienda el microscopio y la cámara.
    1. Fijar la cámara a 37 ° C con 5% CO2 antes de que las muestras se colocan en la incubadora escenario para evitar estrés innecesario a las células y para asegurar cinética homogénea de la RDA a través de experimentos.
  3. Seleccionar campos con células bien-distribuidas, ajustar el enfoque y registrar su posición para facilitar la adquisición de imágenes después del Protocolo de IF. Adquirir al menos una imagen que servirá como punto de referencia de daños previos para monitorizar la cinética de reclutamiento de la proteína después de la irradiación de micro.
    Nota: Recipientes de cultivo cuadriculada pueden usarse para facilitar la localización de las células irradiadas por micro en los pasos posteriores.
    1. Para los experimentos de IF usando las células etiquetadas BBET, ajuste el enfoque en las células mediante el láser de 405 nm en la menor potencia del láser suficiente para visualizar las células para evitar daños injustificados en el ADN.
      1. Evitar el uso de fluorescencia de campo amplio para ajustar el enfoque en células con tinción BBET como la luz ultravioleta emitida por la lámpara inducen daño en el ADN en sitios iluminados.
    2. Si utiliza células BrdU marcado, ajuste el enfoque con contraste de interferencia diferencial (DIC) o proyección de imagen de contraste de fase mirando el nucleares características como nucleolos.
    3. Si usa las células con marcada con fluorescencia POIs, seleccione un plano focal con intensidad de fluorescencia representante.
      Nota: Evite las células que expresan altos niveles del PDI como fuerte sobreexpresión puede resultar en localización artifactual. Además, seleccionar las células que expresan el POI en niveles comparables (selección de clones estables recomienda reducir al mínimo las variaciones en los niveles de expresión y selección de POI).
  4. Configurar el microscopio para el paso de micro-irradiación con la recuperación de fluorescencia después de photobleaching (FRAP) _module del sistema.
    Nota: Los parámetros más importantes a considerar al establecer el sistema de microscopio para experimentos de micro-irradiación son: la potencia de salida de los 405 nm láser, número de iteraciones (es decir, número de veces el láser a entrar en las mismas coordenadas), número de píxeles/campo (63 X aumento y resolución de 1.024 x 1.024, 1 píxel = 0,21 μm) y tiempo de permanencia por píxel. Todos estos factores afectará la cantidad de energía que experimentan las células y por lo tanto la cantidad y el tipo de ADN dañan generado (véase discusión para más información de optimización de dosis).
  5. Con el módulo FRAP del sistema de microscopio, micro-irradian las células.
    Nota: En la mayoría de los sistemas micro-irradiación de células múltiples puede realizarse en un solo campo como manchas o líneas/rectángulos (típicamente 1-2 μm de ancho). Al realizar imágenes en vivo de marcada con fluorescencia de proteínas inmediatamente después daños, limitar la irradiación de micro a un pequeño número de células por campo ya que el tiempo tomado para micro-irradiar cada célula dará lugar a una inducción retardada del DDR. Esto es particularmente importante cuando el control de proteínas que son reclutadas muy rápidamente a las lesiones del ADN.
  6. Después de la micro-irradiación, devolver diapositivas varios pocillos o platos en una incubadora a 37 ° C con 5% CO2 durante el tiempo necesario antes de procesar las muestras para si (sección 5) o proceder de inmediato con imágenes en vivo (sección 3).
    1. Como primer paso, fijar las células en pocos minutos hasta unas pocas horas post-irradiation del protocolo IF. Según el PDI, cinética de reclutamiento puede variar. Por lo general, proteínas asociadas a cromatina distritales y SSBs se localización muy rápidamente a la lesión y a veces se quitan dentro de 5 minutos. Algunos factores como los que montan en ssDNA se reclutarán en momentos más tardías una vez que se ha dedicado a la maquinaria de la resección y permanecen allí durante horas (véase figura 1 y la referencia4).

3. en vivo imágenes de proteínas marcada con fluorescencia

  1. Realizar proyección de imagen de Time-lapse de las células irradiadas por micro. Proteínas que son reclutadas muy rápidamente a las lesiones, unos segundos por fotograma serán ideal, pero para las proteínas que localización a la zona dañada más adelante (p. ej., factores de resección), la adquisición pueden ser llevado a cabo cada 1 – 2 min hasta alcanza una meseta.
    Nota: Reducir al mínimo la potencia del láser para la adquisición de la imagen para evitar blanqueo tanto como sea posible y para asegurar el reclutamiento de la proteína en sitios de daño no alcanza la saturación que impediría la cuantificación de la señal y posterior análisis (véase el análisis de datos Sección 4). En el sistema actual, la proyección de imagen se realizó con un 63 X 1.4 aceite objetiva usando un tiempo de permanencia de 8 μs/píxel, resolución de 1.024 x 1.024, zoom X 1 y un promedio de 2. Tenga en cuenta que estos parámetros deben optimizarse para otros sistemas o experimentos diferentes.
  2. Micro-irradian las células en campos adicionales hasta mediciones de cinética se obtienen células de 15-30. Repetir los experimentos al menos 3 veces en muestras biológicas para asegurar la exactitud y la reproducibilidad de la cinética de captación.
    Nota: Cuando la adaptación de este protocolo a un específico sistema confocal, puede ser útil iniciar mediante el control de la cinética de la contratación de un factor de mantenimiento del genoma conocido marcada con fluorescencia (p. ej., 53BP1-GFP, RPA32-GFP, etc.). Usando proyección de imagen en vivo para optimizar las condiciones micro-irradiación permite medir varios parámetros rápidamente.

4. Análisis de la cinética de reclutamiento

  1. Instalar el plugin de análisis Microirradiation10 en de software de análisis de imagen de Fiji11.
  2. Abra las imágenes adquiridas en Fiji. Seleccione "El analizador de daños" en el menú desplegable plugins en la suite de análisis de Microirradiation. Siga las instrucciones para definir una región del fondo de interés (ROI) (por lo general de 3 x 3 μm) y ROIs irradiados y no irradiados en cada célula irradiada por el micro.
    1. ROIs de uso del mismo tamaño para minimizar los sesgos potenciales en decir intensidades de la señal. Para imágenes adquiridas, también incluyen al menos un marco de irradiación previa que se utilizará como base para vigilar la contratación en sitios de micro-irradiado.
    2. Una vez que se han recogido todos los datos de retorno de la inversión sobre la serie full time-lapse, guarde el archivo creado por el plugin que contiene el resultado como un archivo de txt (archivo delimitado por tabuladores) o csv (archivo delimitado por comas). Este archivo contiene las mediciones de la intensidad media para cada momento y cada ROI (significa fondo de intensidad, intensidad significa no-irradiados y significa intensidad irradiado).
      Nota: El plugin resta automáticamente la intensidad de fondo (b) de la intensidad de los ROIs irradiados (s) y el ROI no irradiado (In). También calcula una relación entre ambos valores (ver la fórmula abajo) para corregir por photobleaching (irradiadas/no-irradiado).
      figure-protocol-1
      El plugin también calcula una normalización entre el primer punto de tiempo (valor 1) y todos los otros puntos del tiempo para cada núcleo (cociente relativo al primer punto de tiempo). Puede encontrar información adicional en el plugin web10.
  3. Realizar el análisis utilizando el plugin para todos irradiado de micro células (por lo menos 15 – 30) y ver el enriquecimiento relativo promedio en las regiones irradiadas por micro con el tiempo. Calcular los errores estándar de la media para los datos de cada punto y les trama de.
    1. Confirmar las diferencias en la cinética de captación entre dos condiciones experimentales mediante la realización del estudiante t-pruebas para cada punto de datos.

5. Si protocolo

  1. Preparar soluciones de IF. Preparar solución de pre/post-extraction (helada 1 x PBS con un 0.25% Tritón X-100), solución de lavado (1 x PBS que contenga 0.05% Tween-20), solución de bloqueo (PBS 1 x con un 3% de BSA y 0.05% Tween-20) y la solución de fijación (paraformaldehido 3% + sacarosa 2% en PBS 1 x) en tubos cónicos de polipropileno.
    Nota: Para un solo pozo 8 microslide, 10 mL de solución de pre/post-extraction, 50 mL de solución, 10 mL de solución de bloqueo y 5 mL de solución de fijación de lavado se requieren.
    1. Preparar la solución de fijación.
      1. Debajo de una campana química, mezcla 400 mL de agua destilada doble (ddH2O) con 15 g de paraformaldehído y 30 μl de 10 N NaOH en un matraz Erlenmeyer de 1 L.
      2. Cerrar el recipiente y el calor a 65 ° C en una agitador magnético placa agitando para solubilizar completamente el paraformaldehído.
      3. Usando una pipeta de 25 mL, agregar 50 mL de 10 X PBS, remover y filtro utilizando un filtro de 0.45 μm.
      4. Añadir 10 g de sacarosa y completar a 500 mL con ddH2O.
      5. Alícuota de la solución en tubos cónicos de 15 mL; almacenar a-20 ° C hasta su uso.
    2. Preparar los núcleos coloración solución por dilución de una solución stock de 1 mg/mL de 4, 6-Diamidino-2-phenylindole (DAPI) 1:1,000 en PBS 1 x.
  2. Usando una micropipeta, retire con cuidado los medios de comunicación de los pocillos del portaobjetos de microscopía varios pocillos o placas e inmediatamente lavar con 500 μl de solución de lavado IF cambiando la solución dos veces sin necesidad de esperar.
    Nota: Los datos IF presentados aquí fueron obtenidos usando las células cultivadas en portaobjetos de microscopía 8-bien que se lavaron y se incubaron en 500 μl de las soluciones. Volúmenes deben ajustarse dependiendo de los contenedores de cultura de célula utilizados por experimentadores. Además, realizar el protocolo de IF con extremo cuidado como células pueden separar fácilmente de la parte inferior de vidrio y polímeros. Utilice una micropipeta para todos los cambios de solución para minimizar la pérdida de la célula.
  3. Incubar en hielo por 5 min con 500 μl de helada si solución de pre/post-extraction y agitar suavemente a mano durante 15 – 30 s. realizar la extracción previa paso que elimina más proteínas citoplásmicas y nucleoplasmática y maximiza la señal de la cromatina / Factores asociados de ADN.
  4. Lavar dos veces con 500 μl de solución de lavado de IF.
  5. Incubar durante 15 min a temperatura ambiente en 500 μl de solución de fijación de IF. Como alternativa, utilice una solución de paraformaldehído pre-hechos (3 – 4%) para el paso de fijación.
  6. Lavar dos veces con 500 μl de solución de lavado de IF.
  7. Incubar en hielo por 5 min en 500 μl de helada IF pre/post-extraction solución y deslice suavemente con la mano para efectuar el paso de permeabilización del remolino.
  8. Lavar dos veces con 500 μl de solución de lavado de IF.
  9. Incubar al menos 30 min a temperatura ambiente con 500 μl de solución de bloqueo de IF.
  10. Eliminar bloqueo de solución con una micropipeta e incubar durante una noche en una cámara humidificada a 4 ° C con anticuerpos primarios de 250 μl diluidos en solución de bloqueo.
    Nota: Es buena práctica realizar la incubación con los anticuerpos primarios secuencialmente para evitar posibles artefactos de la co-localización. Una vez que se han realizado los controles adecuados, al mismo tiempo incuban anticuerpos primarios para acelerar el proceso.
  11. Lavar cuatro veces durante 5 minutos en 500 μl de solución de lavado IF con suave agitación (60 RPM en un rotador).
  12. Incubar durante 1 h a 37 ° C con 250 μl de anticuerpos secundarios diluido en solución de bloqueo en una cámara humidificada.
    Nota: Proteger las muestras de la luz sobre la adición de anticuerpos secundarios marcados con fluorescencia.
  13. Lavar cuatro veces cada 5 minutos en 500 μl de solución de lavado IF con agitación suave.
  14. Incubar a temperatura ambiente durante 5 minutos en 500 μl de PBS de x 1 que contiene 1 μg/mL DAPI para teñir núcleos.
  15. Lavar dos veces con 500 μl de PBS 1 x y dejar las células en 500 μl de solución de PBS para la proyección de imagen de 1 x.
  16. Utilizando diapositivas cuadriculadas o posiciones etapa registrada, encontrar las células irradiadas por micro con un marcador de daño de ADN bien caracterizado (por ejemplo, γ-H2A.X, RPA32, etc.).
  17. Imagen de diapositivas cultura varios pocillos o placas en todos los canales pertinentes mediante los ajustes apropiados en un microscopio confocal de escaneo láser.
    Nota: En el sistema actual, la proyección de imagen se realizó con un 63 X 1.4 aceite objetiva usando un tiempo de permanencia de 8 μs/píxel, resolución de 1.024 x 1.024, zoom X 1 y un promedio de 2. Tenga en cuenta que estos parámetros deben optimizarse para otros sistemas o experimentos diferentes.

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Resultados

Tras micro-irradiación, las células pueden recuperar para un período específico de tiempo dependiendo de la naturaleza del genoma mantenimiento proteínas1,12. Distritales se procesarán por nucleasas, más extensivamente durante las fases S y G2 del ciclo celular, para crear una región limitada de ssDNA que rápidamente es cubierto por RPA y otros de factores de mantenimiento de genoma9. Esta región de ssDNA e...

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Discusión

Utilizando los métodos mencionados anteriormente, 405 nm láser micro-irradiación de células sensibilizadas previamente con BBET o BrdU permite la generación localizada de las lesiones del ADN incluyendo distritales dentro de los núcleos de las células humanas adherentes. Cinética de DDR en estos distritales son similares a los generados con otros métodos en las células eucariotas9,18,19. Resección de DSB en sitios irradiados mic...

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Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Este trabajo fue apoyado por las ciencias naturales y Consejo de investigación de ingeniería de Canadá [descubrimiento subsidio 5026 h] y por una nueva generación de científicos de la sociedad de investigación del cáncer [21531 a A.M]. Agradecemos a Jean-François Lucier para proporcionar control de calidad excelente de los scripts de Python de Fiji y asesoramiento en análisis estadístico. Damos las gracias por la receta de solución de fijación IF Dr. Stephanie A. Yazinski. Agradecemos a Paul Ludovic Karsenti ayuda con medidas de potencia láser.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Microscopio confocal de barrido láser resonante Olympus FLUOVIEW FV3000Software Olympus
FluoView FV3000 (versión 2.1)Láser Olympus
405 nm FuentecoherenteIncubadora
microscopio AIO-UNO-OLYUS-1OkolabOKO-UNO-1
60X /1.4 ObjetivoAceite Olympus objetivo de inmersión
Portaobjetos de cultivo de 8 pocillos en cubreobjetos (X-well)Sarstedt94.6190.802
U2OS osteosarcoma línea celular humanaATCCHTB-96Líneas celulares estables 
4',6-Diamidino-2-Fenilindol (DAPI)ThermoFisherD1306Precaución
tóxico 5-bromo-2′-desoxiuridina ( BrdU) Sigma-Aldrich59-14-3
ParaformaldehídoSigma-Aldrich30525-89-4Precaución
tóxico Bisbenzimida H 33342 (Hoechst 33342)ThermoFisher62249
Albúmina sérica bovina (BSA)ThermoFisherBP1600-100
Tripsina EDTA 0,1% ThermoFisher15400-054
Triton X-100 BioShopTRX777.100
Tween-20 ThermoFisherBP337-500
Sacarosa BioShopSUC507
Reactivo de transfección JetPRIME Montaje Polyplus114-07
ProLong Diamond Antidecoloración con DAPI ThermoFisherP36962
DMEM 1X, + rojo fenolWisent 319-005-CL
DMEM 1X, - rojo fenolWisent319-051-CL
Suero fetal bovino (FBS)Wisent 080-150
Anticuerpo anti-RPA32 de ratónAbcamab21751:500 para IF
Conejo anti-γ-H2A. Señalización celular del anticuerpo X 9718S1:500 para IF
Rabbit Anti-53BP1 anticuerpoCell Signaling 4937S1:500 para IF
Conejo Anticuerpo anti-PRP19Abcamab276921:500 para IF
Cabra anti-conejo IgG Alexa Fluor 647Señalización celular 4414S1:250 para IF
Cabra anti-ratón  IgG Alexa Fluor 488 Señalización celular 4408S1:250 para
software de código abierto de análisis de imágenes IF Fiji https://fiji.sc
1918-K Medidor de potencia  con un sensor 918D-SL-0D3Newport
de radiación de

Referencias

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