Presentamos un protocolo para comparar el estado de los minerales en vesículas por dos líneas de células de hueso humano: hFOB 1.19 y Saos-2. Sus perfiles de mineralización fueron analizados por alizarina rojo-S (AR-S) coloración, visualización luz de ultravioleta (UV), la proyección de imagen de microscopía electrónica (TEM) transmisión y microanálisis por energía dispersiva por rayos x (EDX).
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Artículo de método
Análisis de minerales producidos por hFOB 1.19 y Saos-2 células usando la microscopia electrónica transmisión con microanálisis de rayos x dispersiva de energía
En este artículo
Resumen
Resumen
Este video presenta el uso de microscopía electrónica de transmisión con microanálisis de rayos x dispersiva de energía (TEM-EDX) para comparar el estado de los minerales en vesículas por dos líneas de células de hueso humano: hFOB 1.19 y Saos-2. Estas líneas celulares, después del tratamiento con ácido ascórbico (AA) y β-glicerofosfato (β-GP), experimentar transdifferentiation osteogénico completado de proliferación a la mineralización y producen vesículas de matriz (MVs) que provocan la nucleación de apatita en la matriz extracelular (ECM).
Basado en la tinción de rojo de alizarina-S (AR-S) y análisis de la composición de minerales en los lysates de la célula con luz ultravioleta (UV) o en vesículas usando proyección de imagen de TEM seguido por EDX cuantificación y mapeo de ion, podemos inferir que el osteosarcoma Saos-2 y osteoblástica las células hFOB 1.19 revelan perfiles de mineralización distinta. Las células SAOS-2 mineralizar más eficientemente que las células hFOB 1.19 y producen depósitos minerales más grandes que no son visibles bajo luz UV, pero son similares a la hidroxiapatita (HA) en que tienen sustituciones más Ca y F.
Los resultados obtenidos con estas técnicas nos permiten concluir que el proceso de mineralización es diferente dependiendo del tipo de célula. Proponemos que, a nivel celular, el origen y las propiedades de las vesículas predeterminan el tipo de minerales.
Introducción
El hueso es un tipo de tejido conectivo compuesto de dos partes: orgánica (células y fibras de colágeno) y minerales (compuestos de calcio y fosfato). Los principales componentes minerales en los huesos son apatitas1. Diferentes tipos de células competentes de mineralización en el hueso (osteoblastos), dientes (odontoblastos) y cartílago (condrocitos) regulan los pasos iniciales de mineralización produciendo proteínas de la matriz extracelular (ECM) y liberación de matriz vesículas (MVs) (figura 1). MVs son vesículas de 100 a 300 nm de diámetro que acumulan calcio y fosfato facilita la nucleación de apatita y poste....
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Protocolo
1. la cultura y el tratamiento de la célula
- Poner todos los materiales necesarios bajo la campana de flujo laminar y esterilización bajo luz UV. Los medios de cultivo son: una mezcla 1:1 del jamón de medios F12 y DMEM con 2,5 mM L-glutamina suplementada con 100 U/mL de penicilina, 100 estreptomicina U/mL 0.3 mg/mL G418 y 10% suero bovino Fetal (FBS) (v/v) para antígeno de T grande de SV40 feto humano hFOB 1.19 transfectadas osteoblastos y medio de McCoy 5A 1,5 mM L-glutamina suplementada con 100 U/mL de penicilina, 100 estreptomicina U/mL y 15% FBS (v/v) para las células de osteosarcoma humano Saos-2.
- La cultura hFOB 1.19 células a 34 ° C en una at....
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Resultados
TEM-EDX permite el en vitro la proyección de imagen de vesículas de la matriz (MVs) lanzadas por mineralización de las células y de los minerales producidos por Mfrente a los resultados obtenidos con esta técnica demuestran que el proceso de mineralización puede proceder de manera diferente en varios tipos de células. Las líneas dos celulares recibieron el mismo tratamiento de transdiferenciación osteoblástica, pero estimulada células Saos-2 más eficientemente que hFOB m.......
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Discusión
En el documento actual, describen los protocolos para AR-S coloración, identificación de luz UV de Fluorapatito y TEM-EDX en vitro la proyección de imagen de MVs por mineralización de las células y de los minerales producidos por MVs. Es posible tratar todos los métodos mencionados siguiendo algunos pasos de solución de problemas comunes. Para obtener resultados óptimos, deben realizarse varios pasos críticos cuidadosamente. En primer lugar, es mejor añadir AA (que es ácido) seguida por β-GP (que es alc.......
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Divulgaciones
Los autores declaran que no tienen ningún conflicto de interés.
Agradecimientos
MK y pedir realizar operaciones manuales y LB había preparado dibujos e hizo la película. PREGUNTA escribió el manuscrito, LB escribió el guión y MK había preparado la mesa. SM, RB y SP leen críticamente la tabla, el script y el manuscrito. Los autores desean agradecer a Hanna Chomontowska por su excelente asistencia ultramicrotomía como Szymon Suski y Henryk Bilski por su excelente ayuda con análisis de TEM-EDX. Los autores desean dar las gracias a Dr. Patrick para corrección de inglés profesional y Barbara Sobiak para las instrucciones de la grabación.
Este trabajo fue financiado por beca N N401 140639 del Ministerio polaco de ciencia y e....
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Reactivo | |||
| Jamón' s Mezcla de medios DMEM/F12 | PAA | E15-813 | 1:1, para feto humano hFOB 1.19 SV40 antígeno T grande transfectado osteoblastos (ATCC CRL-11372) |
| McCoy' s 5A medio | PAA | E82312-0025 | para osteosarcoma humano Células Saos-2 (ATCC HTB-85) |
| Mezcla de antibióticos (penicilina/estreptomicina) | Sigma | P0781-100ML | 100 U/mL cada uno |
| G-418 | Sigma | 68168 | 0,3 mg/mL |
| FBS | Gibco | 10270 | 10% para hFOB 1,19 y 15% para Saos-2 |
| AA | Sigma | A-5960 | 50 y micro; g/mL |
| ß-GP | Sigma | G9422-100G | 7.5 mM |
| Bio-Gel HTP | Gel Bio-Rad | 130-0420 | para HA |
| FA | sintetizado por nosotros CA sintetizado por nosotros | ||
| CA | sintetizado por nosotros | ||
| Tampón de fosfato de sodio Na2HPO4/NaH2PO4 mezcla | Sigma | S7907/S8282 | 0.1 M, pH 7.2 |
| PBS | pH 7.0, preparado por nosotros | ||
| AR-S en PBS | Sigma | A5533-25G | 0.5 g/100 mL, pH 5.0 |
| Colagenasa tipo IA | Sigma | C2674 | 500 U/mL |
| Tampón | preparado por nosotros | ||
| Agua | producida por nosotros | ||
| Etanol | POCh | BA6480111 | absoluto 99.8% y soluciones 25, 50, 75, 90% |
| Acetato de uranilo en etanol al 50% | Polysciences Inc. | 21447-25 | 0,25 g/10 mL |
| PD medio | pH 7,4, preparado por nosotros | ||
| Mezcla de fijación (paraformaldehído/glutaraldehído) | Sigma | 158127/G-6257 | 3%:1% |
| Post-fijación OsO4 | Sigma | 75633 | 1% |
| LR Resina blanca en etanol | Polysciences Inc. | 17411-MUNC 500g | 1:2, 1:1, 100% |
| Acetona | CHEMPUR | 111024800 | |
| viales > puros | |||
| criogénicos | Corning Inc. | 430487 | 1,2 mL |
| Placas de plástico para cultivo de Petri | Falcon | 353003 | 100 mm |
| Tubos de plástico | Falcon | 352096 y 352070 | 15 y 50 mL |
| Pipetas serológicas | Falcon y VWR | 357521 y 612-3700 | 1 y 10 mL |
| Tubos de microcentrífuga de plástico | Sigma | Z688312 y Z628034 | 1,5 mL negro y 2 mL transparentes |
| Puntas de plástico | VWR | 613-0364, 613-0239 y 613-1050 | 0.1-10 y micro; L natural, 1-200 y micro; L amarillo y 200-1000 µ L azul |
| Bastidores de plástico Light Labs | A-7055-Z, A-7053-C | verde para tubos, naranja para microtubos y azul para sondas TEM | |
| Laminar Hera Save | Thermo Scientific Co. | KS12 | (H14 según DIN EN 1822) |
| Incubadoras Hera Cell | Thermo Scientific Co. | 150 | 34 y grados; C para hFOB 1.19 y 37° C para Saos-2 |
| Campana extractora | POLON | WCS-2 | para tinciones TEM |
| Frascos de vidrio | SIMAX | 1632414501050 y 1632414501100 | 50 y 100 mL |
| Tubos de vidrio de cuarzo | SIMAX | 638422010100 | Ø 10 mm, L 100 mm |
| Bomba | IBS Integra Biosciences | VACUSAFE confort | para vacío |
| Horno | Memmert | UNE 400 | 56° C |
| Plato multipocillo de porcelana | Rosenthal technik | 229/12 | 12 pocillos Vasos de precipitados de |
| vidrio | SIMAX | 632417010025 | 25 mL |
| Frascos de vidrio | Pocord | DIN22 | 10 mL |
| Caja de plástico | Agar Scientific Ltd. | para la oscuridad | |
| Snap Fit Cápsulas de gelatina | Agar Scientific Ltd. | G3741 | tamaño 1 |
| Formvar/Carbon 300 Malla Rejillas de Ni en caja | Agar Scientific Ltd. | Película S162N3 | en el lado brillante |
| Raspador de celdas de silicona | Sigma | SIAL0010-100EA | tamaño 1,8/25 cm |
| Jeringa con aguja | BogMark | 007 | jeringa 1 mL 40 U, aguja 0,5 x 16 |
| Jeringa | Chirana | CH005L | |
| 5 mL Centrífuga | MPW Medical Instruments | MPW-350R | 130 x g y 500 x g |
| Transluminador UVP | M-20 | para luz visible y UV | |
| Ultramicrótomo | LKB NOVA | 700Å secciones | |
| Soporte de bloque | LKB | E6711 | forma redonda |
| Cuchillo de diamante | DiATOME | Ultra 45° | Talla 3 |
| Portapestañas | bovino, preparado por nosotros | ||
| Pinza | ROTH | 2855.1 | antiestática para rejillas |
| Juego de espátulas | ROTH | E286.1 | antiestático para polvos |
| Imaging | |||
| Inverted Microscopio | Zeiss con Canon | AxioObserver Z1 equipado con PowerShot G9 | Contraste de fase, luz transmitida, objetivo 20x, filtros RGB |
| Microscopio electrónico de transmisión | TEM Jeol Co. con Oxford Instruments y SiS-Olympus | JEM-1400 TEM equipado con sistema de microanálisis de rayos X (EDX) de dispersión de energía INCA de rango completo y cámara MORADA G2 de 11 megapíxeles | Aumento de 50.000X para TEM y 15.000X para STEM y EDX |
| Cuerpo de la cámara y lentes | Nikon | Nikon D7100 Nikkor AF Micro 105 mm f/2.8D Nikkor AF-S 50 mm f/1.8G Nikkor AF 28 mm f/2.8D | para grabaciones de vídeo |
| Micrófono | MXL | Mics Tempo | para grabaciones de voz |
Referencias
- Buckwalter, J. A., Cooper, R. R. Bone structure and function. Instr. Course Lect. 36, 27-28 (1987).
- Anderson, H. C. Molecular biology of matrix vesicles. Clin. Orthop. Relat. Res. 314, 266-280 (1995).
- Anderson, H. C. Matrix v....
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Reimpresiones y permisos
