Aquí se describe un protocolo para el establecimiento y cultivo derivado de humano y ratón 3 dimensiones (3D) gástrico organoides y el método para la transferencia de organoides 3D a una monocapa de 2 dimensiones. También se describe el uso de la monocapa epitelial gástrica como un análisis nuevo de cero-herida para estudios de regeneración.
Se requiere una suscripción a JoVE para ver este contenido. Inicie sesión o comience su prueba gratuita.
Artículo de método
Cultura de monocapa epitelial gástrico primario derivadas de ratón y humanos para el estudio de la regeneración
En este artículo
Resumen
Resumen
Estudios in vitro de reparación de herida gástrica implica típicamente el uso de líneas celulares de cáncer gástrico en un ensayo de scratch-herida de proliferación celular y migración. Una limitación crítica de tales ensayos, sin embargo, es su surtido homogéneo de tipos celulares. La reparación es un proceso complejo que exige la interacción de varios tipos celulares. Por lo tanto estudiar una cultura desprovista de subtipos celulares, es una preocupación que debe superarse si queremos entender el proceso de reparación. El modelo de organoide gástrico puede aliviar este problema por el que la colección heterogénea de tipos de la célula refleja cerca del epitelio gástrico u otros tejidos nativos en vivo. Demostrado aquí es una novela en vitro arañazo herida ensayo derivado de humanos o ratón organitas 3-dimensional que luego pueden ser transferidos a una monocapa epitelial gástrica sea organitas intacta o como una suspensión unicelular de disociaron organoides. El objetivo del protocolo es establecer organoides derivados gástricas epiteliales monocapas que pueden utilizarse en un sistema de análisis de nuevo heridas de rasguño para el estudio de regeneración gástrica.
Introducción
El uso de scratch-herida ensayos es un método popular para el estudio de regeneración y reparación1,2,3,4,5,6. La metodología propuesta puede ser utilizada para estudiar específicamente gástrica regeneración y colonización de Helicobacter pylori . En el pasado, líneas celulares de cáncer gástrico se han utilizado como un medio para el estudio de la infección de Helicobacter pylori (H. pylori)1,....
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Protocolo
Para evitar la contaminación, realizar el protocolo en su totalidad dentro de una campana de cultivo estériles para tejidos. Tejido humano fundic recogió de pacientes sometidos a gastrectomía en manga según el protocolo aprobado del CRI de la Universidad de Cincinnati (número de protocolo de la IRB: 2015-4869).
Todos los estudios del ratón fueron aprobados por el cuidado Animal institucional de la Universidad de Cincinnati y el Comité uso (IACUC) que mantiene un centro de Asociación Americana de evaluación y acreditación de laboratorio Animal Care (AAALAC).
1. establecer derivados de humanos 3D gástrica fúndica organitas
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Resultados
Organoides se derivaron del corpus/cuerpo del ser humano o del fondo de los tejidos del estómago del ratón (figura 1A). Después de colagenasa o digestión de EDTA de tejido del estómago derivados humanos o ratón respectivamente, las glándulas son embebidas en matriz de la membrana del sótano y cultivadas durante 6-7 días (figura 1A). Figura 1B se muestra la formación de derivados humanos gástrico orga.......
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Discusión
El actual protocolo de detalles de la creación de derivados de humanos y de ratón gástricas epiteliales monocapas que se puede utilizar para los ensayos de cero-herida. El protocolo depende el concepto de células madre residentes tejidos de aislamiento de humanos primarios (o ratón) y es un protocolo modificado publicado por primera vez por Schlaermann et al7. En particular, hemos optimizado el protocolo aquí para establecer un confluente y polarizado monocapa epitelial gástrica que expre.......
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Este trabajo fue financiado por el NIH (NIDDK) 5 DK083402-07 R01 grant (YZ).
....Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Medio Eagle modificado/F12 avanzado de Dulbecco (medio basal) | Life Technologies | 12634-010 | |
| GlutaMAX (L-glutamina) | Life Technologies | 25030-081 | |
| Penicilina/Estreptomicina | Thermo Scientific | SV30010 | |
| Anfotericina B/Gentamicina | Thermo Scientific | R01510 | |
| Kanamicina | Thermo Fisher | RO1510 | |
| Tampón HEPES | Sigma Aldrich | H0887 | |
| N-acetilcistina | Sigma Aldrich | A9165 | |
| N2 | Life Technologies | 17502-048 | |
| B27 | Life Technologies | 12587-010 | |
| Inhibidor de BMP (Noggin) | Pepro Tech | 250-38 | |
| Gastrin | Tocris | 3006 | |
| EGF | Pepro Tech | 315-09 | |
| FGF10 | Pepro Tech | 100-26 | |
| Nicotinamida | Sigma Aldrich | N0636 | |
| Y-27632 Inhibidor de ROCK | Sigma Aldrich | Y0503 | |
| TGF-β Inhibidor | Tocris | 2939 | |
| Ca2+/Mg2+ -free DPBS | Fisher | 21-031CV | |
| Dulbecco's modified Eagle Medium (DMEM) | Life Technologies | 12634-010 | |
| Suero fetal bovino | FBS | ||
| OPTIMEM | Invitrogen | ||
| 0.22µ Filtro M | Fisher | 099-720-004 | |
| 37 ° C Baño | |||
| agua colagenasa tipo 1 | Worthington | ||
| Albúmina de suero bovino | Sigma Aldrich | A9418 | |
| Kimwipes (papel de seda) | Fischer Scientific | 06-666C | |
| fondo redondo de 125 ml | |||
| Barra | |||
| Septa | |||
| de | |||
| gomaPlaca | |||
| Soporte de anillo Abrazaderas | |||
| de soporte de | |||
| Placa | |||
| Agujas de 18 G de 1,5 g de longitud | Thermo Fisher | 305196 | |
| 20 g de 3,5 pulgadas de longitud | Thermo Fisher | 405182 | |
| placa tratada con cultivo celular de 12 pocillos | Midwest Scientific | 92012 | |
| Factor de crecimiento reducido, sin fenol Rojo MatrigelTM (Matriz de membrana basal) | Fisher | CB-40230C | |
| Hojas de afeitar estériles Pinzas | |||
| hemostáticas curvas | |||
| 200 µ Puntas de pipeta anchas L | Thermo Fisher | 02-707-134 | |
| 5 mL tubos de ensayo para cultivos celulares | Fisher | 14-956-3C | |
| Tanque de oxígeno con manguera | |||
| 1 g de D-sorbitol | |||
| Sacarosa | Fisher | SS-500 | |
| Microscopio | |||
| disección Bandeja de | disección | ||
| Mecedora | |||
| Cola de Rata Colágeno Tipo 1 | Life Technologies | A10483-01 | |
| Ácido acético glacial de grado de cultivo celular | Fisher | A38-212 | |
| Agua de grado de cultivo celular | Corning | 25-055-CV | |
| Corredera de cámara de 2 pocillos | Thermo Fisher | 155380 | |
| de 12 pocillos Transwell (insertos de membrana de poliéster) | Corning | 3460 | |
| Raspador de células | Corning | 353086 | |
| Accutase (solución de desprendimiento de células) | Stemcell Technologies | 7920 | |
| 263/8 Jeringa G | Thermo Fisher | 309625 | |
| Cuchilla de | |||
| L Cells | Las células L, una línea celular productora de Wnt3a, fueron recibidas como regalo por el Dr. Hans Clevers (Instituto Hubrecht de Biología del Desarrollo e Investigación de Células Madre, Países Bajos). | N/A | |
| HEK-293T Células secretoras de rspondina | Se obtuvo una línea celular secretora de R-espondina HEK-293T modificada del Dr. Jeff Whitsett (Sección de Neonatología, Biología Perinatal y Pulmonar, Centro Médico del Hospital Infantil de Cincinnati y Facultad de Medicina de la Universidad de Cincinnati, Cincinnati, EE. UU.). | N/A | |
| HK-ATPasa Anticuerpo primario | Invitrogen | SC-374094 | |
| E-Cadherinn | SantaCruz | sc-59778 | |
| UEA1 | Sigma Aldrich | L9006 | |
| Hoechst 33342 | Thermo Fisher | H3570 | |
| Alexafluor 488 anticuerpo secundario (Donkey anti-mouse 488 anticuerpo secundario) | ThermoFisher Scientific | R37114 |
Referencias
- Nagy, T. A., et al. Helicobacter pylori regulates cellular migration and apoptosis by activation of phosphatidylinositol 3-kinase signaling. J Infect Dis. 199 (5), 641-651 (2009).
- Mnich, E., et al.
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Reimpresiones y permisos
