Evaluación de colágeno y elastina Microarchitectures dependiente de la presión en las arterias de resistencia viva, humana por microscopía de fluorescencia etiqueta-libre

Maria Bloksgaard; Bjarne Thorsted; Jonathan R. Brewer; Jo G. R. De Mey

doi:10.3791/57451

Artículo de método

Evaluación de colágeno y elastina Microarchitectures dependiente de la presión en las arterias de resistencia viva, humana por microscopía de fluorescencia etiqueta-libre

DOI:

10.3791/57451

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9 de abril de 2018

Maria Bloksgaard¹ , Bjarne Thorsted² , Jonathan R. Brewer² , Jo G. R. De Mey¹^,³

¹Department of Cardiovascular and Renal Research, Institute of Molecular Medicine, University of Southern Denmark, ²Department of Biochemistry and Molecular Biology, University of Southern Denmark, ³Department of Cardiac, Thoracic and Vascular Surgery, Odense University Hospital

En este artículo

Resumen

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Describimos prueba mecánica simultánea y proyección de imagen 3D de la pared arterial de aislados, viven las arterias de resistencia humana y Fiji y Ilastik análisis de imagen para la cuantificación de colágeno y elastina densidades organización y volumen espaciales. Discutimos el uso de estos datos en modelos matemáticos de la mecánica de la pared arterial.

Resumen

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La contribución patógena de resistencia arteria remodelación está documentada en la hipertensión esencial, diabetes y síndrome metabólico. Investigaciones y desarrollo de modelos matemáticos microestructuralmente motivados para la comprensión de las propiedades mecánicas de las arterias de resistencia humana en salud y enfermedad tienen el potencial para ayudar a entender cómo la enfermedad y tratamientos médicos afectan la microcirculación humana. Para desarrollar estos modelos matemáticos, es fundamental para desentrañar la relación entre las propiedades mecánicas y microarquitectura de la pared microvascular. En este trabajo, describimos un método ex vivo para ensayos mecánicos pasivos y proyección de imagen tridimensional libre de sello simultánea de la microarquitectura de elastina y colágeno en la pared arterial de las arterias de resistencia humana aislada. El protocolo de imagen puede aplicarse a las arterias de resistencia de cualquier especie de interés. Análisis de imagen se describen para cuantificar cambios i) inducidos por la presión en los ángulos de ramificación lámina elástico interna y rectitud de colágeno adventicial con Fiji y densidades de volumen ii) colágeno y elastina determinadas utilizando el software de Ilastik. Preferentemente se realizan todas las mediciones mecánicas y proyección de imagen en vivas y perfusión de las arterias, sin embargo, es un método alternativo utilizando presión estándar de video-microscopía miografía en combinación con las imágenes posteriores a la fijación de los recipientes a presión discuten. Este método alternativo proporciona a los usuarios diferentes opciones de enfoques de análisis. Se discute la inclusión de los datos mecánicos y proyección de imagen de modelos matemáticos de la mecánica de la pared arterial, y se proponen adiciones al Protocolo y desarrollo futuro.

Introducción

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La contribución patógeno y efectos de la resistencia de la arteria remodelación están documentadas en la hipertensión esencial, diabetes y síndrome metabólico¹^,²^,³^,⁴^,⁵. Descifrar la relación entre las propiedades mecánicas y microarquitectura de la pared microvascular es esencial para el desarrollo de modelos matemáticos de esta asociación. Tales modelos mejorarán la comprensión el proceso de remodelación y apoyarán el desarrollo de modelos de silico útil para probar estrategias farmacológicas dirigidos a e....

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Protocolo

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Colección de biopsias del pericardio parietal humana para su uso en este trabajo se realizó después de consentimiento de informado escrita, descrita³³. El estudio de tejidos humanos se ajustan a los principios esbozados en el³⁴ de la declaración de Helsinki y fue aprobado por los comités regionales de ética de la investigación de salud para el sur de Dinamarca (S-20100044 y S-20140202) y la Agencia danesa de protección de datos.

1. recoger el tejido y aislante (humanos) resistencia arteria

Recoger muestras de tejido de interés inmediatamente después de la supresión durante una cirugí....

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Resultados

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La laringe a la medida de presión para la proyección de imagen usada en este trabajo se muestra en la figura 1. Se prestó especial atención para el diseño de la laringe a i) la cámara con un pequeño volumen (2 mL) y ii) la posibilidad de colocación de la cánula cerca a y en paralelo con el fondo de cristal (figura 1B). La parte inferior de la cámara ajusta un 50 × 24 mm #1.5 vidrio cubreobjetos (reemplazable). El regulador de pre.......

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Discusión

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Este trabajo representa nuestra sugerencia para un estandarizada combinada presión y proyección de imagen de miografía enfoque, valioso para la evaluación simultánea de las propiedades mecánicas de las arterias de resistencia y cambios en la estructura de la arterial relacionados con la presión pared en un rango de presión de 0 a 100 mmHg. El enfoque presentado fue desarrollado usando equipo construido personalizado, sin embargo, puede utilizarse cualquier miógrafo de presión que cabe en un microscopio de fluorescencia d.......

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Divulgaciones

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Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

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Los autores agradecen el danés biomédica Molecular Imaging Center en la Facultad de Ciencias naturales de la Universidad de Dinamarca Meridional, para el uso de laboratorios y microscopios. Kristoffer Rosenstand y Ulla Melchior son reconocidos por la excelente asistencia técnica con la presión miografía y proyección de imagen.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
Nombre	Empresa	Número de catálogo
Herramientas de ciencia fina	15401-12
Herramientas de ciencia fina	11251-23
Nikon	SMZ800N
Sigma-Aldrich, Brø ndby, Dinamarca.	761028	para fines
Vitrex Medical A/S, Herlev, Dinamarca	1,63, 2,13, 210 mm
Smiths medical Intl, Reino Unido
Ethicon	Ethilon 11-0
Patente		DK personalizada número 201200167, Universidad del Sur de Dinamarca, J. Schoubo V. Jensen, F. Jensen. T.R. Uhrenholt
Mettler toledo
Sigma-Aldrich, Brø ndby, Dinamarca.	B3259
Sigma-Aldrich, Brø ndby, Dinamarca.	A7030
Sigma-Aldrich, Brø ndby, Dinamarca.	C5670
Sigma-Aldrich, Brø ndby, Dinamarca.	G7021
Sigma-Aldrich, Brø ndby, Dinamarca.	E3889
Merck Millipore, Hellerup, Dinamarca	1.00496.9010	Solución de formaldehído al 4% tamponada con fosfato (pH 6,9)
Sigma-Aldrich, Brø ndby, Dinamarca.	H3784
Sigma-Aldrich, Brø ndby, Dinamarca.	P9666
Sigma-Aldrich, Brø ndby, Dinamarca.	P5655
Sigma-Aldrich, Brø ndby, Dinamarca.	M2643
Sigma-Aldrich, Brø ndby, Dinamarca.	S2002
Sigma-Aldrich, Brø ndby, Dinamarca.	S5886
Sigma-Aldrich, Brø ndby, Dinamarca.	S5761
Sigma-Aldrich, Brø ndby, Dinamarca.	1.06462
Gibco, ThermoFisher Scientific	10010015
Sigma-Aldrich, Brø ndby, Dinamarca.	PHR1423
Sigma-Aldrich, Brø ndby, Dinamarca.	Z370525
Tocris Bioscience, Bristol, Reino Unido	538944
Nikon	Spectra Physics hecho
, Mountain View, CA
Nikon	CFI Plan Apo IR SR 60XWI NA 1.27
Nikon	CFI Plan Fluor 20XMI (inmersión múltiple) NA 0.75
Hamamatsu, Ballerup, Dinamarca	H7422P-40
AHF analysentechnik AG (Tü Bingen, Alemania).	ChromaET 460 nm AHF dicroico
analizadontechnik AG (Tü Bingen, Alemania).	Filtro Semrock FF01-520/35-25 BrightLine AHF
analysentechnik AG (Tü Bingen, Alemania).	Croma ET402/15X
grosor del cubreobjetos Scotch TM debe coincidir con el objetivo utilizado en el microscopio (# 1 o # 1.5), alternativamente, configure el collar de ajuste para que coincida con el cubreobjetos

de diseccióna medidade paso largo El

Referencias

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Briones, A. M., Arribas, S. M., Salaices, M. Role of extracellular matrix in vascular remodeling of hypertension. Curr Opin Nephrol Hy. 19 (2), 187-194 (2010).
Heagerty, A. M., Heerkens, E. H., Izzard, A. S. Small artery structure and function in hypertension. J Cell Mol Med.....

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Collagen Elastin Microarchitecture Resistance Artery Mechanics Label free Fluorescence Microscopy Two photon Excitation Imaging Elastin Autofluorescence Collagen Second Harmonic Generation Fiji Image Analysis Ilastik Software Analysis Pressure induced Vascular Changes Extracellular Matrix Quantification

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