Artículo de método

Detección de Inflammasome activación y muerte celular Pyroptotic en macrófagos derivados de médula ósea murinas

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DOI:

10.3791/57463

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21 de mayo de 2018

 , 
1Department of Laboratory Medicine, University of Washington

En este artículo

Resumen

Describimos la detección de la activación de inflammasome NLRP3 en bases celulares mediante microscopía de fluorescencia y la coloración para activa caspasas-1 y el adaptador, ASC. Un ensayo de liberación de lactato deshidrogenasa se presenta para detectar lisis pyroptotic sobre una base de población. Estas técnicas se pueden adaptar para estudiar muchos aspectos de la biología de inflammasome.

Resumen

Inflammasomes son plataformas señalización inmunes innatas que se requieren para el control exitoso de muchos organismos patógenos, sino que también promueven inflamatorias y enfermedades autoinflamatorias. Inflammasomes son activadas por receptores de reconocimiento de patrón citosólica, incluyendo a miembros de la familia de NOD-like receptor (NLR). Estos receptores oligomerize a la detección de estímulos microbianos o asociada a daño. Posterior reclutamiento de la proteína adaptador ASC forma un microscópico visible inflammasome complex, que activa la caspasa-1 a través de la auto activación inducida por proximidad. Después de la activación caspase-1 segmenta pro-IL-1β y pro-IL-18, conduciendo a la activación y secreción de estas citoquinas proinflamatorias. Caspasa-1 interviene también en la forma inflamatoria de muerte celular denominada pyroptosis, que cuenta con la pérdida de la lisis de integridad y de la célula de la membrana. Caspasa-1 golpea a gasdermin D, soltar el fragmento N-terminal que forma poros en membrana del plasma, llevando a la lisis osmótica.

In vitro, la activación de caspasa-1 se puede determinar por macrófagos derivados de médula ósea con la punta de prueba de actividad de caspasa-1 FAM-YVAD-FMK de etiquetado y etiquetado las células con anticuerpos contra la proteína adaptadora de ASC. Esta técnica permite la identificación de inflammasome formación y activación de la caspasa-1 en células individuales utilizando microscopía de fluorescencia. Pyroptotic la muerte celular puede detectarse midiendo la liberación de lactato deshidrogenasa citosólica en el medio. Este procedimiento es simple, rentable y en un formato de placa de 96 pocillos, permitiendo la adaptación para la investigación. En este manuscrito, nos muestran que la activación de la inflammasome NLRP3 por nigericin conduce a la colocalización de la proteína adaptadora de ASC y activa caspasas-1, a pyroptosis.

Introducción

Inflamación mediada por Inflammasome es un componente crítico de la defensa contra organismos patógenos1, pero también es la base de la etiología de muchas enfermedades2. Citosólica detección de patrones moleculares asociado de patógeno (PMAP) activa la respuesta inflamatoria a una amplia gama de infecciones o daños asociados patrones moleculares (DAMPs). Receptores de reconocimiento de patrón (PRR), incluyendo a miembros de la familia NOD-like receptor (NLR), oligomerize a la detección de estos PAMPs y humedades. Esto provoca la formación de un complejo de varias proteína denominado inflammasome, que contiene el PRR, la proteína adaptadora asociada a Apoptosis Mota-como la proteína contiene un dominio c-terminal de reclutamiento de caspasas (CARD) (ASC) y la pro forma de caspasa-13,4. Este complejo permite proximidad inducida auto activación de caspasa-1. Caspasa-1 activo entonces conduce a un conjunto de eventos que caracterizan la muerte celular inflamatorio vía pyroptosis. Estos eventos incluyen: el escote y la liberación de las citoquinas inflamatorias IL-1β e IL-18, exocitosis de lisosomas con liberación de contenido lysosomal en el espacio extracelular, la condensación nuclear y gasdermin D escote. El dominio N-terminal liberado de gasdermin D inserta en la membrana plasmática, formando poros que provocan ruptura de la membrana plasmática y liberación del contenido inflamatorio, además de tomar a un nicho protector para patógeno replicación5, 6 , 7.

Aquí, nos enfocamos en el bien estudiado inflammasome NLRP3. La activación de la inflammasome NLRP3 se produce a través de un proceso de dos etapas8. El primer paso de "cebado" se produce a través del reconocimiento por los receptores Toll-like (TLR) de un producto microbiano. Esto se repite en el entorno de laboratorio mediante el uso de LPS para estimular el TLR4. Esta estimulación upregulates NLRP3 y pro-IL-1β mediante señalización NF-kB. Cebado además licencias NLRP3 a través de mecanismos no transcripcionales induciendo su deubiquitination9,10 y fosforilación o desfosforilación de residuos específicos11,12.

La segunda señal para la activación de NLRP3 se piensa para implicar factores mitocondriales, especies reactivas de oxígeno, eflujo de potasio y calcio de señalización, aunque un mecanismo unificador para la activación de NLRP3 sigue siendo difícil de alcanzar8. NLRP3 activado oligomerizes a través de interacciones entre sus dominios NACHT y recluta a ASC por atascamiento de los dominios de pirina (PYD)13. En cada célula, estos complejos macromoleculares forman un foco microscópico visible. ASC fue identificada originalmente como una proteína del KDa 22 que forma un "punto" durante la apoptosis de las células de leucemia humana y nombre asociada a apoptosis Mota-como la proteína que contiene una tarjeta14. Más tarde se determinó que la ASC reclutas pro-caspasa-1 a través de la interacción de la tarjeta de ASC con la tarjeta de pro-caspasa-1, formando el inflammasome15.

NLRs no todas requieren la presencia de ASC para inducir la activación de la caspasa-1. A diferencia de NLRP3, NLRC4 y NLRP1b tienen tarjeta dominios y pueden contratar directamente pro-caspasa-1 a través de las interacciones de la tarjeta-tarjeta para inducir la activación de la caspasa-1. En la ausencia de ASC, activa caspase-1 sigue siendo difuso en el citosol y no forma un solo foco. Este activo difuso caspasa-1 es suficiente para inducir la muerte celular de pyroptotic, pero es incapaz de procesar pro-IL-1β13,16.

En este manuscrito, discutiremos dos formas de evaluar inflammasome activación. La primera utiliza la actividad fluorescente sonda, FAM-YVAD-FMK, que se une a la familia de proteasas de caspasa-1. Esta familia incluye caspasa-1, pero también ratón caspasa-11 y humano caspasas-4 y caspasa-5. Mediante el uso de los macrófagos de ratones deficientes caspase-1/11 en todos los experimentos, se abordará la especificidad de este sondeo. Este método puede combinarse con anticuerpo etiquetado de componentes inflammasome, que también describiremos. Visualización microscópica permite la identificación de células individuales que contienen activos de caspasa-1 y oligomerized ASC. Usando este método, los investigadores podrán determinar que en la cascada de formación inflammasome sus manipulaciones de la célula huésped o el organismo patógeno en estudio tienen un efecto. Por ejemplo, uno puede distinguir si una intervención determinada impide la contratación de ASC para el complejo NLRP3 o apunta el posterior reclutamiento y activación de caspasa-117. Examinar los resultados de la activación de la caspasa-1 como la secreción de IL-1β no serían capaces de distinguir entre estas dos posibilidades. Además, la secreción de IL-1β podría modificarse sin alterar la capacidad de las células para activar la caspasa-1 y se someten a pyroptotic celular muerte16.

El segundo método mide la liberación de lactato deshidrogenasa (LDH) en el sobrenadante, la célula que ocurre durante la lisis del macrófago de pyroptotic tras la activación de caspasa-1 como se describe anteriormente. Este segundo método es un enfoque basado en la población como la liberación de LDH en todo el bien se mide. Este enfoque simple permite el análisis rápido (30 minutos de tiempo de incubación) de muestras para determinar si existe muerte celular mediada por caspasas-1 y se puede realizar en un formato de placa de 96 pocillos.

Estos métodos son complementarios, cada uno con diferentes ventajas y ambos son fácilmente susceptibles de modificaciones. Por ejemplo, tratamiento de macrófagos con objetivo pequeño peso molecular compuestos antes inflammasome estimulación puede utilizarse para investigar el papel de cierto proteínas pueden tener el control de las respuestas inflamatorias.

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Protocolo

Todos los procedimientos animales eran aprobados y llevado a cabo en la Universidad de Washington institucional Animal Care y Comité de uso.

1. la cosecha de médula ósea

  1. Asépticamente Remueva el fémur y la tibia de un ratón y limpiar los huesos usando instrumentos estériles. Coloque los huesos limpios en medio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) + 5 mM HEPES 0,2 mg/mL de L-glutamina + 0,05 mM 2-Mercaptoetanol + 50 mg/mL gentamicina Sulfato + 10.000 U/mL de penicilina/estreptomicina + 10% de suero bovino fetal (FBS, DMEM-10 completa) e incube la el tubo en hielo por 15 min.
  2. Eliminar las juntas de rótula proximal y distal con unas tijeras. Inserte una aguja de 25 G conectada a una jeringa de 10 mL llenada de medio en el hueco de los huesos. Eliminar la médula ósea con DMEM-10 completa. Suspender cualquier grupos transfiriendo el medio hacia arriba y hacia abajo suavemente.
  3. Centrifugar las células durante 10 min a 300 x g y cuente el número de células usando un hemocitómetro. En este punto, o bien congelar las células mediante 90% FBS + 10% de dimetilsulfóxido (DMSO) o las células en una placa de Petri para diferenciar a los macrófagos por medio de elución de L929 acondicionado (paso 2.1) de 15 cm de la placa.

2. diferenciación de macrófagos derivados de médula ósea

  1. Por medio de diferenciación precalentado (21 mL de DMEM-10 completa y 9 mL de medio de celular condicionado de elución de L929 de Swanson et al. 18), poner células de médula ósea en un 15 cm no-cultivo de tejidos tratados de Petri (1.2-1.5 x 107 células). Incubar la placa a 37 ° C y 5% de CO2 durante 7 días. Agregar un adicional 30 mL de medio de diferenciación a la placa en día 3 o 4.
    Nota: Es importante no utilizar placas de cultivo de tejidos Tratado, como los macrófagos serán difíciles de separar y recoger.
  2. Para recoger los macrófagos, lavar la placa con solución salina tamponada con fosfato (PBS) y añadir 20 mL de PBS frío + ácido de 1 mM etilendiaminotetracético (EDTA). Incubar la placa a 4 ° C durante 10 minutos cosecha las células mediante pipeteo la PBS + EDTA sobre las células y lave la placa con 10 mL de PBS. Combinar ambos lavados en dos tubos cónicos de 15 mL.
  3. Centrifugar las células a 300 x g durante 10 min y resuspender las células en 10 mL de DMEM libre de rojo de fenol 5 mM HEPES 0,2 mg/mL de L-glutamina + 0,05 mM 2-Mercaptoetanol + 5% FBS (DMEM-5) y contar las células usando un hemocitómetro o un contador Coulter. Mantener las células en hielo durante el conteo.
  4. Semilla de los macrófagos en las placas de cultivo de tejidos recubierto en 2 x 105 células/mL. Para los experimentos de microscopía, sembrar 1 mL de células sobre cubreobjetos en placas de 24 pozos. Para los ensayos de liberación LDH, sembrar 100 μl de células en una placa bien 96. Para el análisis LDH, semilla 9 pozos (3 pozos sin tratamiento, 3 pozos con controles 100% lisis y 3 pozos para el estímulo experimental).
  5. Centrífuga del 96 bien placa por 5 min a 300 x g para asegurarse de que las células se distribuyen igualmente en el pozo.
  6. Incube la placa durante la noche a 37 ° C + 5% CO2 antes de iniciar el proceso de cebado.

3. cebado

  1. Reemplazar el medio con medio fresco (DMEM-5) que contiene 100 LPS ng/mL (500 μL para el 24 bien placa o 50 μL de la 96 bien la placa).
    Nota: Hay una variedad de variaciones estructurales de LPS, que afectan la capacidad de estimular el cebado mediada por el TLR419. LPS de Salmonella minnesota R595 (Re) de múltiples proveedores y se recomienda.
  2. Incubar la placa por 3 h a 37 ° C y 5% CO2.

4. activación de la Inflammasome NLRP3 con Nigericin y etiquetado con FAM-YVAD-FMK

  1. Quite el medio y sustituirlo con 290 μL de DMEM-5 que contiene 5 μM nigericin y glicina de 5 mM. Glicina es añadida para reducir la cantidad de lisis celular que ocurre durante la activación de la caspasa-15. Incubar por 60 min a 37 ° C y 5% CO2. Uso de tipo salvaje y caspasa-1 de los macrófagos deficientes para asegurar que el etiquetado observada es específico para la caspasa-1.
  2. Durante los últimos 45 minutos, añadir 10 μL de 30 x FAM-YVAD-FMK, preparado según las instrucciones del fabricante.
  3. Después de 60 minutos, quite el medio y lavar las células 3 veces de 5 min con 1 mL de PBS frío.
  4. Añadir 250 μL de paraformaldehído al 2% a cada pocillo e incubar en hielo cubierto con papel de aluminio durante 30 minutos.
  5. Durante los últimos 5 minutos, añada 4 μL de mancha de far-red ácidos nucleicos fluorescente 0,2 mM a los núcleos de la etiqueta. 4' 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) y otros colorantes pueden utilizarse también para etiqueta de ADN.
  6. Lavar las células 3 veces con 1 mL de PBS frío y montar el cubreobjetos en portaobjetos de microscopio con 7 μL anti-fade montaje medio. Que el medio de montaje endurecer durante la noche antes de sellar el cubreobjetos portaobjetos usando esmalte de uñas.
  7. Imagen de los macrófagos por microscopia confocal. Ex / Em de FAM-YVAD-FMK es 492/520nm y 642/661 para la mancha fluorescente far-red de ácido nucleico. Asegúrese de configurar el microscopio que las células no tratadas no presentan ningún fondo de coloración en el canal de 488. De lo contrario, la tinción de fondo FAM-YVAD-FMK será detectado y no reales activa caspase-1.
    Nota: La configuración del microscopio se describe en sección 6.

5. anticuerpos

Nota: Para etiquetar las células con anticuerpos para detectar ASC, semilla, cebe y exponer las células a la nigericin idéntica a la sección anterior. El proceso es luego como sigue:

  1. Lavar las células 3 veces de 5 min con 1 mL de PBS frío. Añadir 250 μL de solución de fijación y permeabilización. Incubar las células en hielo y cubierto durante 30 minutos.
  2. Lave los macrófagos tres veces de 5 min con 1 mL de tampón de lavado.
  3. Añadir 250 μL de anticuerpo primario contra ASC diluido 1: 500 en tampón de lavado e incubar durante 1 h en el hielo. Incluyen un cubreobjetos que no reciben ningún anticuerpo primario, pero sólo recibirá el secundario. Este cubreobjetos se utilizará durante la configuración del microscopio para establecer el desplazamiento correcto.
  4. Lavar las células 3 veces de 5 min con 1 mL de tampón de lavado.
  5. Añadir 250 μL de anticuerpo secundario (colorante fluorescente conjugado cabra anti-ratón) diluido 1: 500 en tampón de lavado e incubar durante 1 h en el hielo. Añadir 4 μL de mancha fluorescente far-red de ácido nucleico de 0,2 mM para lo últimos 5 min de la incubación a núcleos de etiqueta.
  6. Lavar las células 3 x con 1 mL de tampón de lavado fría y Monte el cubreobjetos en un microscopio de diapositivas utilizando 7 μL anti-fade montaje medio. Que el medio de montaje endurecer durante la noche antes de sellar el cubreobjetos portaobjetos usando esmalte de uñas claro.
  7. Macrófagos de imagen por microscopía confocal. Ex / Em para el anticuerpo secundario es 555/580 nm y 642/661 para far-red ácido nucleico fluorescente manchan (como se describe a continuación).
    Nota: Etiquetado con FAM-YVAD-FMK y anticuerpo etiquetado puede combinarse para mostrar la co-localización de caspasa-1 activo y ASC. Para ello, siga las condiciones para el etiquetado de FAM-YVAD-FMK y luego al anticuerpo etiquetado protocolo para su posterior procesamiento.

6. la proyección de imagen de etiqueta macrófagos mediante Microscopía Confocal

Nota: Las células pueden verse después de los cubreobjetos se ha permitido a curar durante la noche y han sido sellados para el portaobjetos con esmalte de uñas. Aquí se describe imagen utilizando un microscopio confocal. También puede verse las células por microscopía de fluorescencia estándar.

  1. Colocar el portaobjetos con las células control no tratados en la platina del microscopio y enfocar el microscopio en las células.
  2. Parámetros el microscopio buscar Up Table (LUT), ajuste el desplazamiento que no hay ninguna coloración de FAM-YVAD-FMK positiva en las células no tratadas. Este proceso puede realizarse también mediante macrófagos deficientes caspase-1.
    Nota: La compensación debe ser ajustada para cada canal usado en el experimento, pero el desplazamiento correcto es más crítico para la FAM-YVAD-FMK canal y canales de anticuerpos fluorescentes. El desplazamiento para el canal de ADN es menos crítico. Una vez que el desplazamiento se ha establecido, no para ajustar esta configuración para el resto del experimento.
  3. Cambiar la diapositiva a la muestra de nigericin tratado. Encontrar un campo que contiene las células que son positivas y negativas para la tinción de FAM-YVAD-FMK. Ajustar el plano de proyección de imagen del canal FAM-YVAD-FMK el plano que tiene la mayor intensidad de tinción positiva. Normalmente se trata del plano donde el centro de la atención de inflammasome es reflejado.
  4. Ajuste de la ganancia que focos son visibles en las células que tienen núcleos condensados. Después de ajustar la ganancia y offset, deje estos ajustes para el resto de la sesión de imágenes.
    Nota: Una manera fácil de determinar si una celda es pyroptotic es en la morfología nuclear. Células con activa caspase-1 se han redondeado y núcleos condensados, mientras que los nucleolos son visibles en las células sin la morfología nuclear y activación de la caspasa-1 es similar a las de las células no tratadas.
  5. Recoger imágenes de 5 campos seleccionados al azar a 100 X de aumento total. Ello normalmente alrededor de 40 células por imagen. Repita este proceso para cada muestra.
  6. Contar el número de células en cada imagen utilizando el software de análisis de imagen. Luego contar el número de células que tienen la coloración positiva de FAM-YVAD-FMK. Representan el nivel de activación de la caspasa-1 como el porcentaje de células positivas de FAM-YVAD-FMK.

7. LDH versión ensayo

Nota: Para el ensayo de liberación LDH, semilla y las células como se describe en la sección anterior, excepción primer utilizan una placa bien 96. No retire el medio después de cebado.

  1. Añadir 50 μL de DMEM-5 que contiene 10 nigericin μM a los pozos experimentales y 50 μL DMEM-5 a los pocillos de control lisis espontáneos y 100%. No añadir glicina en este experimento, ya que el objetivo es medir la lisis celular. Incubar por 60 min a 37 ° C y 5% CO2.
  2. Después de 30 min, añadir 10 μL de tampón de lisis de x 10 a los pocillos de control 100% lisis y añadir 10 μL de DMEM-5 a los otros pozos. Durante la incubación, retirar 1 frasco de mezcla de sustrato (1,5 mL de sustrato liofilizado) y 1 alícuota de tampón de ensayo (~ 12 mL) del congelador y dejarlos descongelar protegido de la luz a temperatura ambiente.
    Nota: La mezcla de sustrato contiene una sal de tetrazolio (iodonitro-tetrazolio violeta), que se convierte en un producto de formazán rojo.
  3. Después de la incubación en total 60 minutos, centrifugar la placa por 5 min a 500 x g a 10 ° C. Transferir 50 μL del sobrenadante a una placa transparente de fondo plano. Durante este tiempo, añadir 12 mL de tampón de ensayo al frasco de mezcla de sustrato e incubar a temperatura ambiente durante 5 minutos antes de usar.
  4. Añadir 50 μL de substrato en cada pocillo e incubar por 30 min en la oscuridad. Incluyen pozos sólo medio para valores en blanco. Compruebe la placa después de 15 minutos para asegurarse de que la señal no superará el límite de detección del lector de la placa.
  5. Después de 30 min, agregar 50 μL de solución de parada (el ácido acético de 1 M) y mida OD490 usando un lector de placas.
  6. Calcular el porcentaje de lisis celular con la siguiente fórmula:
    Observan % = ((Experimental-Spontaneous) / (máximo-espontánea)) × 100
    Experimental: de nigericin Tratado de células; espontánea: no se trata de células; máximo: las células expuestas al tampón de lisis

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Resultados

Para detectar la activación de la caspasa-1 después de la exposición a nigericin, las células se procesaron como se describe en la sección de protocolo. Combinamos la FAM-YVAD-FMK y ASC anticuerpo etiquetado para demostrar que el ASC y activa caspase-1 co localización tras inflammasome NLRP3 mediada por activación. Figura 1A muestra que el tipo salvaje macrófagos expuestos a 5 μM nigericin tienen formación de un enfoque de la ASC en la región perinuclear. Est...

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Discusión

En este manuscrito, hemos presentado dos técnicas para examinar la activación inflammasome y la consecuencia de la activación de la caspasa-1 después del estímulo NLRP3 en macrófagos derivados de médula ósea murinos. La primera técnica permite al investigador determinar el nivel de activación de la caspasa-1 basándose en los celulares usando el reportero fluorescente FAM-YVAD-FMK. Este reportero es altamente específico para atar la caspasa-1 familia de enzimas, como se ve por la ausencia de tinción en macrófagos deficien...

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Divulgaciones

Los autores no tienen conflictos de interés divulgar

Agradecimientos

Todos la microscopia se realizó en el centro W. M. Keck microscopia con el apoyo de Nathaniel Peters y con el apoyo del Premio NIH S10OD016240. Y es apoyada por los NIH K08AI119142 y R21AI130281. Agradecemos al Dr. Richard Flavell y Dr. Brad Cookson de ratones deficientes caspase-1/11 y el Dr. Brad Cookson para compartir equipos y laboratorios.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
E-MEMATCC30-2003Para el cultivo de células L929
Clon NCRC 929 (L929)ATCCCCL-1
Kit de Fijación/Permeabilización BDBiosciences554714Incluye solución de fijación y permeabilización, y tampón de lavado. Formulaciones patentadas. Contiene 4,2% de formaldehído
GlycineBiorad161-0718
Cytotox96 Ensayo de citotoxicidad no radiactivaFisher ScientificPR-G1780Incluye mezcla de sustrato y tampón de ensayo; Formulaciones patentadas. La solución de parada es 1 M Ácido acético
FAM-YVAD-FMKImmunocytochemistry Technologies98
DMEM, alto en glucosa, sin glutaminaInvitrogen11960044
DMEM, alto en glucosa, sin glutamina, sin rojo de fenolInvitrogen31053028
PBS de Dulbecco, sin calcio, sin magnesioInvitrogen14190144
Suero fetal bovino, calificado, origen de EE. UU.Invitrogen26140079Heat inactivado a 55 ° C durante 50 min
GentamicinInvitrogen15750060
ProLong Gold Mounting MediumInvitrogenp36934Formulación patentada. Medio de montaje de curado. Se endurece a un índice refractario de 1,46
ALEXA555 anti-ratónde cabra InvitrogenA-21422
HEPES (Ultra Pure)Invitrogen11344041
L-GlutaminaInvitrogen21051024
Penicilina-EstreptomicinaInvitrogen15140122
TO-PRO-3 IduroInvitrogenT3605rojo lejano fluorescente tinción de ácido nucleico
C57BL/6J ratónJackson Laboratoy000664
caspasa-1/11-/- ratónJackson Laboratory016621
Microscopio confocal Leica SP8XLeica
Ultrapure LPS de Salmonella minnesota R595 (Re)List Biologicals434
clon anti-ASC 2EI-7Millipore-Sigma04-417
beta-mercapto-etanolMillipore-SigmaM6250-10ML
DMSOMillipore-SigmaD2650-5X10ML
EDTAMillipore-SigmaE5391
Spectramax M3 lector de placasMolecular Devices 5000414

Referencias

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