En este artículo discutimos tres preparaciones de cerebro utilizadas para la grabación de abrazadera de parche de células enteras a estudiar el circuito retinotectal de los renacuajos de Xenopus laevis . Cada preparación, con sus propias ventajas específicas, contribuye a la maleabilidad experimental de los renacuajos de Xenopus como modelo para el estudio de la función neuronal del circuito.
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Artículo de método
Preparaciones y protocolos para todo celular parche abrazadera de neuronas Tectal de Xenopus laevis
En este artículo
Resumen
Resumen
El circuito de retinotectal renacuajo Xenopus , compuesto de las células ganglionares de la retina (RGCs) en el ojo que forman sinapsis directamente sobre las neuronas en El tectum óptico, es un modelo popular para estudiar circuitos neuronales cómo uno mismo-montar. La capacidad para llevar a cabo toda célula grabaciones de abrazadera de parche de neuronas tectal y al registro grave-evocado las respuestas, ya sea en vivo o mediante una preparación de todo el cerebro, ha generado un gran cuerpo de datos de alta resolución sobre los mecanismos subyacentes normales y anormal, circuito de formación y función. Aquí describimos cómo realizar la preparación en vivo , la preparación original de todo el cerebro, y más recientemente desarrollaron preparación de corte horizontal del cerebro para obtener grabaciones de abrazadera de parche de células enteras de neuronas tectal. Cada preparación tiene ventajas experimentales únicas. La preparación en vivo permite la grabación de la respuesta directa de neuronas tectal de aumento a los estímulos visuales que se proyectan en el ojo. La preparación de todo el cerebro permite que los axones RGC a activarse de forma muy controlada, y la preparación de corte horizontal del cerebro permite la grabación de a través de todas las capas del tectum.
Introducción
El circuito retinotectal es el componente principal del sistema visual de anfibios. Se compone de las RGCs en el ojo, que proyectan sus axones al tectum óptico donde forman conexiones sinápticas con las neuronas postsinápticas de tectal. El circuito de retinotectal renacuajo Xenopus es un popular modelo de desarrollo para el estudio de la función y formación de circuitos neuronales. Hay muchos atributos de circuito de retinotectal de este renacuajo que potente modelo experimental1,2,3. Un atributo importante y el foco de este artículo, es la capacidad para llevar a c....
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Protocolo
Todos los métodos aquí descritos han sido aprobados por el cuidado institucional del Animal y el Comité uso (IACUC) de la Universidad de Wyoming. Todos los procedimientos, incluyendo las grabaciones electrofisiológicas, se llevan a cabo a temperatura ambiente, aproximadamente de 23 ° C. Todos los métodos aquí descritos están optimizados para la grabación de neuronas tectal de renacuajos entre la etapa de desarrollo 42 y 49 (puesta en escena según Neiuwkoop y Faber15).
1. preparación en Vivo
- Anestesiar el renacuajo.
- Coloque los renacuajos en un pequeño plato de Petri que contenga solución de....
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Resultados
Para registrar las respuestas evocadas de la luz un destello de todo campo de luz se proyecta sobre la retina mientras que la respuesta resultante se registra de neuronas individuales tectal (figura 4A). Este protocolo especial está diseñado para medir tanto la respuesta de la neurona a la luz de encendido ("On" respuesta) y luego apagar 15 s después para medir la "respuesta Off". Las neuronas tectal típicamente exhiben robusta y desactivar l.......
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Discusión
Todos los métodos descritos en este trabajo están optimizados para la grabación de neuronas tectal de renacuajos entre la etapa de desarrollo 42 y 49 (puesta en escena según Neiuwkoop y Faber15). Por etapa 42, los renacuajos son suficientemente grande y suficientemente desarrollada para que los insectos pasadores pueden colocarse a ambos lados del cerebro para grabaciones en vivo y para llevar a cabo la disección de todo el cerebro. En etapas más tempranas, cuando los renacuajos son esenc.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
El apoyo de la beca del NIH SBC COBRE 1P20GM121310-01.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Stemi Stereo 508 | Zeiss | 495009-0006-000 | Microscopio de disección |
| MS-222 "Tricane" | Finquel | ARF5G | Anestésico general anfibio |
| Cloruro de sodio (NaCl) | Fisher Scientific | S271-3 | Se utiliza para preparar la solución de Stienberg y la solución externa |
| Cloruro de potasio (KCl) | Fisher Scientific | P217-500 | Se utiliza para preparar la solución de Stienberg y la solución externa |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375-1KG | Se utiliza para preparar la solución de Stienberg y la solución externa |
| Tetrahirato de nitrato de calcio (Ca(NO3)• 4H2O) | Sigma-Aldrich | 237124-500G | Utilizado para preparar la solución de Stienberg |
| Sulfato de magnesio (MgSO4) | Mallinckrodt Chemicals | 6066-04 | Se utiliza para preparar la solución de Steinberg |
| Cloruro de calcio (CaCl2) | Sigma-Aldrich | C5080-500G | Se utiliza para preparar la solución de grabación externa |
| Cloruro de magnesio (MgCl2) | J.T. Baker | 2444-01 | Se utiliza para preparar la solución de grabación externa |
| D-glucosa anhidra | Mallinckrodt Chemicals | 6066-04 | Se utiliza para preparar la solución de registro externa |
| Clorhidrato de tubocurarina pentahidratado | Sigma | T2379 | Antagonista nicotínico del receptor de acetilcolina |
| Alfileres de insectos | Fine Science Tools | 26002-10 | Pasadores de acero inoxidable de 0,1 mm de diámetro |
| Sylgard 184 Kit de elastómero de silicona | Dow Corning | 761028 | Kit de monómero y agente de curado prepesado |
| Placa de Petri de poliestireno estéril - 60x15mm | Fisher Scientific | AS4052 | Placas de Petri pequeñas |
| Aguja PrecisionGlide 25Gx5/8 (.0.5mm X 16mm) | BD | 305122 | Agujas de jeringa |
| 1mL Slip Tip Tuberculin Syringe | BD | 309659 | Jeringas estériles desechables |
| Pipeta de borosilicato de vidrio | Sutter Instrument | BF150-86-10HP | Tirado según las especificaciones deseadas con la máquina de extracción de pipetas |
| Tirador de micropipetas Flamígero/Marrón | Sutter Instruments | P-97 | Fabrica micropipetas para el registro de electrofisiología |
| Toallitas Kimtech Toallitas | Kimberly-Clark | 34120 | Delicate Limpiaparabrisas sin pelusa |
| Axon Instruments MultiClamp 700B Headstage CV-7B | Molecular Devices | 1-CV-7B | Pinza amperimétrica y pinza de tensión Headstage |
| MP-285 Manipulador Motorizado con Controlador de Mesa | Instrumento Sutter | MP-285/T | Control para cabecera en equipo de electrofisiología |
| LED acoplado a fibra (verde) | Thorlabs | M530F2 | Cable de fibra óptica emparejado con LED verde |
| Electrodo bipolar de grupo (25µ m diámetro) | FHC | 30207 | Electrodo estimulante bipolar |
| ISO-Flex Estimulador | A.M.P.I. (Israel) | Contactar fabricante | Aislador de estímulo flexible |
| Axon Instruments 700B Amplificador multiparche | Molecular Devices | 2500-0157 | Amplificador para registro de pinzas amperimétricas de voltaje y corriente |
| Digitalizador Digidata 1322A | Molecular Devices | 2500-135 Sistema de adquisición de | datos para el registro de electrofisiología |
| Axio Examiner.A1 | Zeiss | 491404-0001-000 | Microscopio para electrofisiología |
| Mesa de laboratorio Micro-g | TMC | 63-533 Mesa de | aire para microscopio de electrofisiología |
| Inspiron 620 Ordenador de sobremesa personal con Windows 7 de 64 bits | Ordenador Dell | D06D001 | con software de electrofisiología |
| Cámara CCD c2400 | Hamamatsu | 70826-5 | Cámara de dispositivo de carga acoplada para imágenes de electrofisiología |
| 7 O'Clock Super Platinum Cuchillas de | afeitar de acero inoxidableGillette | CMM01049 | Hojas de afeitar de acero inoxidable recubiertas de platino |
| Pipetas de transferencia | Fisher Scientific | 13-711-7M | Pipetas de transferencia de polietileno desechables |
Referencias
- Pratt, K. G., Khakhalin, A. S. Modeling human neurodevelopmental disorders in the Xenopus tadpole: from mechanisms to therapeutic targets. Dis. Model Mech. 6, 1057-1065 (2013).
- Pratt, K. G. Finding Order in Human Neurological Disorder Using a Tadpole. Curr. Pathobio. Rep. 3 (2), 129-136 (2015).
- Liu....
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Reimpresiones y permisos
