Preparaciones y protocolos para todo celular parche abrazadera de neuronas Tectal de Xenopus laevis

Zhenyu Liu; Katelynne B. Donnelly; Kara G. Pratt

doi:10.3791/57465

Artículo de método

Preparaciones y protocolos para todo celular parche abrazadera de neuronas Tectal de Xenopus laevis

DOI:

10.3791/57465

⸱

15 de marzo de 2018

Zhenyu Liu¹ , Katelynne B. Donnelly¹ , Kara G. Pratt¹

¹Department of Zoology and Physiology and Program in Neuroscience, University of Wyoming

En este artículo

Resumen

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En este artículo discutimos tres preparaciones de cerebro utilizadas para la grabación de abrazadera de parche de células enteras a estudiar el circuito retinotectal de los renacuajos de Xenopus laevis . Cada preparación, con sus propias ventajas específicas, contribuye a la maleabilidad experimental de los renacuajos de Xenopus como modelo para el estudio de la función neuronal del circuito.

Resumen

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El circuito de retinotectal renacuajo Xenopus , compuesto de las células ganglionares de la retina (RGCs) en el ojo que forman sinapsis directamente sobre las neuronas en El tectum óptico, es un modelo popular para estudiar circuitos neuronales cómo uno mismo-montar. La capacidad para llevar a cabo toda célula grabaciones de abrazadera de parche de neuronas tectal y al registro grave-evocado las respuestas, ya sea en vivo o mediante una preparación de todo el cerebro, ha generado un gran cuerpo de datos de alta resolución sobre los mecanismos subyacentes normales y anormal, circuito de formación y función. Aquí describimos cómo realizar la preparación en vivo , la preparación original de todo el cerebro, y más recientemente desarrollaron preparación de corte horizontal del cerebro para obtener grabaciones de abrazadera de parche de células enteras de neuronas tectal. Cada preparación tiene ventajas experimentales únicas. La preparación en vivo permite la grabación de la respuesta directa de neuronas tectal de aumento a los estímulos visuales que se proyectan en el ojo. La preparación de todo el cerebro permite que los axones RGC a activarse de forma muy controlada, y la preparación de corte horizontal del cerebro permite la grabación de a través de todas las capas del tectum.

Introducción

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El circuito retinotectal es el componente principal del sistema visual de anfibios. Se compone de las RGCs en el ojo, que proyectan sus axones al tectum óptico donde forman conexiones sinápticas con las neuronas postsinápticas de tectal. El circuito de retinotectal renacuajo Xenopus es un popular modelo de desarrollo para el estudio de la función y formación de circuitos neuronales. Hay muchos atributos de circuito de retinotectal de este renacuajo que potente modelo experimental¹^,²^,³. Un atributo importante y el foco de este artículo, es la capacidad para llevar a c....

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Protocolo

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Todos los métodos aquí descritos han sido aprobados por el cuidado institucional del Animal y el Comité uso (IACUC) de la Universidad de Wyoming. Todos los procedimientos, incluyendo las grabaciones electrofisiológicas, se llevan a cabo a temperatura ambiente, aproximadamente de 23 ° C. Todos los métodos aquí descritos están optimizados para la grabación de neuronas tectal de renacuajos entre la etapa de desarrollo 42 y 49 (puesta en escena según Neiuwkoop y Faber¹⁵).

1. preparación en Vivo

Anestesiar el renacuajo.
1. Coloque los renacuajos en un pequeño plato de Petri que contenga solución de....

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Resultados

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Para registrar las respuestas evocadas de la luz un destello de todo campo de luz se proyecta sobre la retina mientras que la respuesta resultante se registra de neuronas individuales tectal (figura 4A). Este protocolo especial está diseñado para medir tanto la respuesta de la neurona a la luz de encendido ("On" respuesta) y luego apagar 15 s después para medir la "respuesta Off". Las neuronas tectal típicamente exhiben robusta y desactivar l.......

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Discusión

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Todos los métodos descritos en este trabajo están optimizados para la grabación de neuronas tectal de renacuajos entre la etapa de desarrollo 42 y 49 (puesta en escena según Neiuwkoop y Faber¹⁵). Por etapa 42, los renacuajos son suficientemente grande y suficientemente desarrollada para que los insectos pasadores pueden colocarse a ambos lados del cerebro para grabaciones en vivo y para llevar a cabo la disección de todo el cerebro. En etapas más tempranas, cuando los renacuajos son esenc.......

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Divulgaciones

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Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

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El apoyo de la beca del NIH SBC COBRE 1P20GM121310-01.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Stemi Stereo 508	Zeiss	495009-0006-000	Microscopio de disección
MS-222 "Tricane"	Finquel	ARF5G	Anestésico general anfibio
Cloruro de sodio (NaCl)	Fisher Scientific	S271-3	Se utiliza para preparar la solución de Stienberg y la solución externa
Cloruro de potasio (KCl)	Fisher Scientific	P217-500	Se utiliza para preparar la solución de Stienberg y la solución externa
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375-1KG	Se utiliza para preparar la solución de Stienberg y la solución externa
Tetrahirato de nitrato de calcio (Ca(NO₃)• 4H₂O)	Sigma-Aldrich	237124-500G	Utilizado para preparar la solución de Stienberg
Sulfato de magnesio (MgSO₄)	Mallinckrodt Chemicals	6066-04	Se utiliza para preparar la solución de Steinberg
Cloruro de calcio (CaCl₂)	Sigma-Aldrich	C5080-500G	Se utiliza para preparar la solución de grabación externa
Cloruro de magnesio (MgCl₂)	J.T. Baker	2444-01	Se utiliza para preparar la solución de grabación externa
D-glucosa anhidra	Mallinckrodt Chemicals	6066-04	Se utiliza para preparar la solución de registro externa
Clorhidrato de tubocurarina pentahidratado	Sigma	T2379	Antagonista nicotínico del receptor de acetilcolina
Alfileres de insectos	Fine Science Tools	26002-10	Pasadores de acero inoxidable de 0,1 mm de diámetro
Sylgard 184 Kit de elastómero de silicona	Dow Corning	761028	Kit de monómero y agente de curado prepesado
Placa de Petri de poliestireno estéril - 60x15mm	Fisher Scientific	AS4052	Placas de Petri pequeñas
Aguja PrecisionGlide 25Gx5/8 (.0.5mm X 16mm)	BD	305122	Agujas de jeringa
1mL Slip Tip Tuberculin Syringe	BD	309659	Jeringas estériles desechables
Pipeta de borosilicato de vidrio	Sutter Instrument	BF150-86-10HP	Tirado según las especificaciones deseadas con la máquina de extracción de pipetas
Tirador de micropipetas Flamígero/Marrón	Sutter Instruments	P-97	Fabrica micropipetas para el registro de electrofisiología
Toallitas Kimtech Toallitas	Kimberly-Clark	34120	Delicate Limpiaparabrisas sin pelusa
Axon Instruments MultiClamp 700B Headstage CV-7B	Molecular Devices	1-CV-7B	Pinza amperimétrica y pinza de tensión Headstage
MP-285 Manipulador Motorizado con Controlador de Mesa	Instrumento Sutter	MP-285/T	Control para cabecera en equipo de electrofisiología
LED acoplado a fibra (verde)	Thorlabs	M530F2	Cable de fibra óptica emparejado con LED verde
Electrodo bipolar de grupo (25µ m diámetro)	FHC	30207	Electrodo estimulante bipolar
ISO-Flex Estimulador	A.M.P.I. (Israel)	Contactar fabricante	Aislador de estímulo flexible
Axon Instruments 700B Amplificador multiparche	Molecular Devices	2500-0157	Amplificador para registro de pinzas amperimétricas de voltaje y corriente
Digitalizador Digidata 1322A	Molecular Devices	2500-135 Sistema de adquisición de	datos para el registro de electrofisiología
Axio Examiner.A1	Zeiss	491404-0001-000	Microscopio para electrofisiología
Mesa de laboratorio Micro-g	TMC	63-533 Mesa de	aire para microscopio de electrofisiología
Inspiron 620 Ordenador de sobremesa personal con Windows 7 de 64 bits	Ordenador Dell	D06D001	con software de electrofisiología
Cámara CCD c2400	Hamamatsu	70826-5	Cámara de dispositivo de carga acoplada para imágenes de electrofisiología
7 O'Clock Super Platinum Cuchillas de	afeitar de acero inoxidableGillette	CMM01049	Hojas de afeitar de acero inoxidable recubiertas de platino
Pipetas de transferencia	Fisher Scientific	13-711-7M	Pipetas de transferencia de polietileno desechables

de 64 bits

Referencias

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Pratt, K. G., Khakhalin, A. S. Modeling human neurodevelopmental disorders in the Xenopus tadpole: from mechanisms to therapeutic targets. Dis. Model Mech. 6, 1057-1065 (2013).
Pratt, K. G. Finding Order in Human Neurological Disorder Using a Tadpole. Curr. Pathobio. Rep. 3 (2), 129-136 (2015).
Liu....

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Preparaci n in vivo preparaci n del cerebro completo corte cerebral horizontal registros del tectum ptico activaci n de las c lulas ganglionares de la retina electrodo de estimulaci n bipolar bloque de elast mero de silicona soluci n de registro externa

Preparaciones y protocolos para todo celular parche abrazadera de neuronas Tectal de Xenopus laevis

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