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Summary

En este artículo discutimos tres preparaciones de cerebro utilizadas para la grabación de abrazadera de parche de células enteras a estudiar el circuito retinotectal de los renacuajos de Xenopus laevis . Cada preparación, con sus propias ventajas específicas, contribuye a la maleabilidad experimental de los renacuajos de Xenopus como modelo para el estudio de la función neuronal del circuito.

Abstract

El circuito de retinotectal renacuajo Xenopus , compuesto de las células ganglionares de la retina (RGCs) en el ojo que forman sinapsis directamente sobre las neuronas en El tectum óptico, es un modelo popular para estudiar circuitos neuronales cómo uno mismo-montar. La capacidad para llevar a cabo toda célula grabaciones de abrazadera de parche de neuronas tectal y al registro grave-evocado las respuestas, ya sea en vivo o mediante una preparación de todo el cerebro, ha generado un gran cuerpo de datos de alta resolución sobre los mecanismos subyacentes normales y anormal, circuito de formación y función. Aquí describimos cómo realizar la preparación en vivo , la preparación original de todo el cerebro, y más recientemente desarrollaron preparación de corte horizontal del cerebro para obtener grabaciones de abrazadera de parche de células enteras de neuronas tectal. Cada preparación tiene ventajas experimentales únicas. La preparación en vivo permite la grabación de la respuesta directa de neuronas tectal de aumento a los estímulos visuales que se proyectan en el ojo. La preparación de todo el cerebro permite que los axones RGC a activarse de forma muy controlada, y la preparación de corte horizontal del cerebro permite la grabación de a través de todas las capas del tectum.

Introduction

El circuito retinotectal es el componente principal del sistema visual de anfibios. Se compone de las RGCs en el ojo, que proyectan sus axones al tectum óptico donde forman conexiones sinápticas con las neuronas postsinápticas de tectal. El circuito de retinotectal renacuajo Xenopus es un popular modelo de desarrollo para el estudio de la función y formación de circuitos neuronales. Hay muchos atributos de circuito de retinotectal de este renacuajo que potente modelo experimental^1,2,3. Un atributo importante y el foco de este artículo, es la capacidad para llevar a cabo grabaciones de abrazadera parche de células enteras de neuronas tectal, en vivo o utilizando una preparación de todo el cerebro. Con un aparejo de electrofisiología equipado con un amplificador que soporte el voltaje y corriente abrazadera modos de grabación, grabaciones de células enteras patch clamp permiten electrofisiología de la neurona que se caracterizará en alta resolución. Como resultado, toda célula parche abrazadera las grabaciones de las neuronas tectal en las distintas etapas claves de la formación de circuito retinotectal han proporcionado una comprensión detallada y completa del desarrollo y plasticidad intrínseca^{4,5 , 6 , 7} y sináptica^8,9,10,11 propiedades. Combinación de grabaciones de celulares todo parche abrazadera neurona tectal, la habilidad de expresar genes o morfolinos de interés en estas neuronas¹²y un método para evaluar comportamiento guiado visual a través de un test de evitación visual establecido¹³ promueve el identificación de enlaces entre moléculas, la función del circuito y el comportamiento.

Es importante tener en cuenta que el tipo de alta resolución, datos obtenidos de las grabaciones de celular todo parche abrazadera no están posibles utilizar nuevos enfoques proyección de imagen tales como el indicador de calcio genética GCaMP6, porque aunque utilizando indicadores de calcio permite la proyección de imagen de calcio dinámica a través de grandes poblaciones de neuronas simultáneamente, no directa o de manera obvia de que los parámetros eléctricos específicos pueden obtenerse midiendo la fluorescencia del delta en la somata y no hay forma de tensión de la abrazadera la neurona para medir relaciones de corriente-tensión. Claramente estos dos enfoques distintos, las grabaciones electrofisiológicas y proyección de imagen del calcio, poseen fortalezas sin traslapo y generar diferentes tipos de datos. Así, el mejor método depende de la pregunta experimental concreta que se aborda.

Aquí, describimos nuestro método para adquirir células enteras patch clamp las grabaciones de las neuronas del tectum óptico renacuajo con una preparación en vivo , preparación de todo el cerebro, y un más nuevo modificado preparación de todo el cerebro que se desarrolló en nuestro laboratorio de¹⁴ . En la sección de resultados de representante, nos demuestran las ventajas experimentales de cada preparación y los diferentes tipos de datos que pueden obtenerse. Los límites y fortalezas de las diferentes preparaciones, así como consejos para la solución de problemas, se incluyen en la sección de discusión.

Protocol

Todos los métodos aquí descritos han sido aprobados por el cuidado institucional del Animal y el Comité uso (IACUC) de la Universidad de Wyoming. Todos los procedimientos, incluyendo las grabaciones electrofisiológicas, se llevan a cabo a temperatura ambiente, aproximadamente de 23 ° C. Todos los métodos aquí descritos están optimizados para la grabación de neuronas tectal de renacuajos entre la etapa de desarrollo 42 y 49 (puesta en escena según Neiuwkoop y Faber15). 1. preparación en Vivo Anestesiar el renacuajo. Coloque los renacuajos en un pequeño plato de Petri que contenga solución de Steinberg con 0.01% MS-222 durante aproximadamente 5 minutos.Nota: MS-222 aka “Tricaine” es un común pescados y anfibios anestésico. Los renacuajos son criados en la solución de Steinberg en mM: 0.067 KCl, 0.034 Ca (NO3)2•4H2O, 0.083 MgSO4•7H2O, NaCl 5.8, 4,9 HEPES. Asegúrese de que el renacuajo es profundamente anestesiado (no responden y no natación) antes de proceder al paso 2. Asegure el renacuajo anestesiado a un bloque de silicona sumergida en el suelo del plato de grabación de disección. Utilice una pipeta de transferencia desechable para mover el renacuajo anestesiado a un plato de disección y grabación que contiene solución de grabación externo (115 mM de NaCl, KCl, 2 mM 3 mM de CaCl2, 3 mM de MgCl2, 5 mM de HEPES, 1 mM de glucosa; ajustar el pH 7.25 uso 10 N de NaOH, osmolaridad 255 mOsm). Para minimizar la espontánea del músculo espasmos, añadir el bloqueador de los receptores de la acetilcolina, tubocurarina (100 μm) a la solución externa. (Por lo general, esto se hace mediante el uso de pipeta 200 μL para añadir 100 μl de un caldo de tubocurarina 10 mM a 10 mL de la solución externa). Con pernos de insectos, fije el renacuajo, el lado dorsal, a un bloque sumergido de elastómero de silicona (como Sylgard 184, véase Tabla de materiales para más detalles), que ha sido pegado a la disección baja de plato.Nota: La colocación de los pasadores es crítica: colocarlos a ambos lados del cerebro, suficiente caudal para evitar empalar a los axones aferentes de grave ese proyecto del ojo y entrar en el cerebro justo anterior al tectum óptico (figura 1A). Filete el cerebro a lo largo de la línea media. Para una visión clara del cerebro, retire la piel que cubre el cerebro haciendo una incisión superficial a lo largo de la línea media usando una aguja estéril de 25 G. Filete el cerebro a lo largo del mismo eje de la línea media por la inserción de la aguja en el tubo neural y tirando suavemente hacia arriba (dorsal) tal que la porción dorsal del tubo se corta limpiamente (cortada) dejando la placa intacta (figura 1B).Nota: Es importante que la placa del piso del tubo neural se deje intacto porque las entradas sensoriales aferentes entran El tectum a través de la placa. Quitar la membrana ventricular transparente que cubre las neuronas tectal. Mover el plato de grabación para la plataforma de electrofisiología y use una pipeta de vidrio roto para quitar la membrana ventricular que cubrían los cuerpos celulares de neuronas tectal. Romper la punta arrastrando ligeramente a través de un limpiador de tarea delicada. Tornillo de la pipeta en el soporte de pipeta y baje hasta El tectum óptico a través de las amalgamas dentales. Utilizar la pipeta rota para pelar la membrana ventricular lejos El tectum.Nota: No es necesario sacar la membrana entero tectum; una pequeña ventana será suficiente y proporcionar acceso a un montón de neuronas. Obtener la célula todo grabaciones de patch clamp.Nota: El enfoque de este punto hacia adelante es similar a la realización de grabaciones de abrazadera de parche de células enteras de rodajas de cerebro de ratón como se describe en Segev, et al. 16 (Figura 1C). Registro de las respuestas de la neurona tectal de aumento a un campo todo destello de luz se proyecta sobre la retina. Para proyectar un flash de todo campo de la luz sobre la retina, colocar una fibra óptica adyacentes al ojo de renacuajo. En el otro extremo de la fibra óptica es un LED con una resistencia variable que permite la luz luminancia a controlarse. Gatillo el LED por la salida digital del amplificador. De esta manera, todo campo destellos de diferentes intensidades de luz pueden ser registrado (figura 4A). 2. todo el cerebro preparación Realice los pasos 1.1 a 1.3.Nota: No hay ninguna necesidad de tubocurarina en la solución externa para esta preparación. Aislar el cerebro. Utilice una aguja de 25 G para separar el cerebelo (figura 2A). Para aislar todo el cerebro de los renacuajos, correr suavemente la aguja por debajo del cerebro, en una dirección caudal a rostral a cortar todos los lateral y ventral del tejido conectivo y fibras nerviosas. Asegure el cerebro a un bloque de elastómero de silicón. Una vez liberado totalmente, asegure el cerebro a un bloque de elastómero de silicona colocando un perno a través de uno de los bulbos olfativos y otro pasador por el cerebelo (figura 2B). Esta es la configuración óptima para la grabación de las neuronas tectal. Mover el plato que contiene la preparación anclados todo el cerebro de la disección alcance a la plataforma de electrofisiología. Quitar la membrana ventricular con una pipeta de vidrio roto como se describe en el paso 1.4. Coloque un electrodo de estimulación bipolar sobre el quiasma óptico (donde se cruzan los tractos axón de cada ojo en el cerebro medio) para activar directamente los axones RGC. Coloque el electrodo de estimulación bipolar rostral y casi junto al gran ventrículo medio. El quiasma óptico está situado inmediatamente rostral al ventrículo medio grande (figura 2B). Suavemente baje el electrodo estimulante en el quiasma óptico que está formado un pequeño hueco en el tejido. El electrodo bipolar es conducido por un estimulador de pulso que permite la fuerza del estímulo ser precisamente controlados. Realizar la grabación de abrazadera de parche de células enteras (figura 2C) según lo descrito por Segev, et al. 16 3. horizontal cerebro sector preparación Realice los pasos 2.1 a 2.3. Utilice una cuchilla para suprimir el cuarto más lateral (que en vivo corresponde a la cuarta más dorsal) de un lado de un tectum óptico. Este corte se hace paralelo al plano rostral caudal como se muestra en la figura 3A. Volver a prender el cerebro al lado del elastómero de silicona con las rebanadas del lado hacia arriba (para que la somata y neuropilo pueden accederse directamente para la grabación) y la superficie ventricular del cerebro hacia el bloque de elastómero de silicona (figura 3 B) (de modo que puede colocarse un electrodo bipolar en el quiasma óptico). Realizar la abrazadera del remiendo de células enteras o grabación potencial archivado local (figura 3C) según lo descrito por Segev, et al. 16

Representative Results

Para registrar las respuestas evocadas de la luz un destello de todo campo de luz se proyecta sobre la retina mientras que la respuesta resultante se registra de neuronas individuales tectal (figura 4A). Este protocolo especial está diseñado para medir tanto la respuesta de la neurona a la luz de encendido (“On” respuesta) y luego apagar 15 s después para medir la “respuesta Off”. Las neuronas tectal típicamente exhiben robusta y desacti…

Discussion

Todos los métodos descritos en este trabajo están optimizados para la grabación de neuronas tectal de renacuajos entre la etapa de desarrollo 42 y 49 (puesta en escena según Neiuwkoop y Faber¹⁵). Por etapa 42, los renacuajos son suficientemente grande y suficientemente desarrollada para que los insectos pasadores pueden colocarse a ambos lados del cerebro para grabaciones en vivo y para llevar a cabo la disección de todo el cerebro. En etapas más tempranas, cuando los renacuajos son…

Materials

Stemi Stereo 508	Zeiss	495009-0006-000	Dissecting microscope
MS-222 "Tricane"	Finquel	ARF5G	Amphibian general anesthetic
Sodium Chloride (NaCl)	Fisher Scientific	S271-3	Used to prepare Stienberg's solution and external solution
Potassium Chloride (KCl)	Fisher Scientific	P217-500	Used to prepare Stienberg's solution and external solution
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375-1KG	Used to prepare Stienberg's solution and external solution
Calcium nitrate tetrahyrate (Ca(NO3)•4H2O)	Sigma-Aldrich	237124-500G	Used to prepare Stienberg's solution
Magnesium Sulfate (MgSO4)	Mallinckrodt Chemicals	6066-04	Used to prepare Steinberg's solution
Calcium Chloride (CaCl2)	Sigma-Aldrich	C5080-500G	Used to prepare external recording solution
Magnesium Chloride (MgCl2)	J.T. Baker	2444-01	Used to prepare external recording solution
D-glucose Anhydrous	Mallinckrodt Chemicals	6066-04	Used to prepare external recording solution
Tubocurarine hydrochloride pentahydrate	Sigma	T2379	Nicotinic acetylcholine receptor antagonist
Insect Pins	Fine Science Tools	26002-10	0.1mm diameter stainless steel pins
Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit	Dow Corning	761028	Preweighed monomer and curing agent kit
Sterile Polystyrene Petri Dish – 60x15mm	Fisher Scientific	AS4052	Small petri dishes
PrecisionGlide Needle 25Gx5/8 (.0.5mm X 16mm)	BD	305122	Syringe needles
1mL Slip Tip Tuberculin Syringe	BD	309659	Disposable, sterile syringes
Borosilicate pipette glass	Sutter Instrument	BF150-86-10HP	Pulled to desired specifications using pipette pulling machine
Flaming/Brown Micropipette Puller	Sutter Instruments	P-97	Fabricates micropipettes for electrophysiology recording
Kimwipes Kimtech wipes	Kimberly-Clark	34120	Delicate task lint-free wipers
Axon Instruments MultiClamp 700B Headstage CV-7B	Molecular Devices	1-CV-7B	Current clamp and voltage clamp headstage
MP-285 Motorized Manipulator with Tabletop Controller	Sutter Instrument	MP-285/T	Control for headstage on electrophysiology rig
Fiber-Coupled LED (Green)	Thorlabs	M530F2	Fiber optic cable paired with green LED
Cluster Bipolar Electrode (25µm diameter)	FHC	30207	Bipolar stimulating electrode
ISO-Flex Stimulator	A.M.P.I. (Israel)	Contact manufacturer	Flexible stimulus isolator
Axon Instruments 700B Multipatch Amplifier	Molecular Devices	2500-0157	Amplifier for voltage- and current-clamp recording
Digidata 1322A digitizer	Molecular Devices	2500-135	Data acquisition system for electrophysiology recording
Axio Examiner.A1	Zeiss	491404-0001-000	Microscope for electrophysiology
Micro-g Lab Table	TMC	63-533	Air table for electrophysiology microscope
Inspiron 620 Personal Desktop Computer with Windows 7 64-bit	Dell	D06D001	Computer running electrophysiology software
c2400 CCD camera	Hamamatsu	70826-5	Charge-coupled device camera for electrophysiology imaging
7 O'Clock Super Platinum Stainless Razorblades	Gillette	CMM01049	Platinum-coated stainless razor blades
Transfer Pipets	Fisher Scientific	13-711-7M	Disposable Polyethylene transfer pipets