Célula activada por el magnético clasificación estrategias para aislar y purificar sinovial líquido mesenquimales células madre derivadas de un modelo de conejo

Summary

Este artículo presenta un protocolo sencillo y económico para el simple aislamiento y purificación de células madre mesenquimales del líquido sinovial del conejo blanco de Nueva Zelanda.

Abstract

Las células madre mesenquimales (MSCs) son la fuente principal de la célula para terapia basada en células. Pueden utilizar MSCs de líquido sinovial de la cavidad articular para la ingeniería del tejido fino del cartílago. MSCs de líquido sinovial (SF-MSCs) han sido considerados candidatos prometedores para la regeneración articular, y su potencial beneficio terapéutico les ha hecho un tema de investigación importante últimamente. SF-MSCs de la cavidad de la rodilla del conejo Nueva Zelanda blanco pueden ser empleados como modelo traduccional optimizado para evaluar humana medicina regenerativa. Por medio de CD90-basado celular activado magnética clasificación tecnologías (MACS), este protocolo con éxito obtiene conejo SF-MSCs (rbSF-MSCs) de este modelo de conejo y completamente demuestra el fenotipo MSC de estas células induciendo a distinguir a osteoblastos, adipocitos y condrocitos. Por lo tanto, este enfoque puede aplicarse en la investigación en biología celular e Ingeniería del tejido fino usando procedimientos y equipos sencillos.

Introduction

MSCs se han sugerido como una fuente valiosa para la medicina regenerativa, especialmente para las lesiones de cartílago. MSCs, incluyendo condrocitos, osteoblastos, adipocitos, miocitos esqueléticos y viscerales células stromal, ampliamente amplían las áreas para el trasplante de células madre debido a su alta expansión tasa y multilineal diferenciación potencial¹. MSCs pueden ser aislados de los esquelético muscular, membrana sinovial, la médula ósea y tejido adiposo^2,3,4. Resultados tienen también confirmó la presencia de MSCs en el líquido sinovial....

Protocol

Todos los experimentos con animales se realizaron conforme a las directrices regionales del Comité de ética, y todos los procedimientos animales fueron aprobados por las institucional Animal Care y uso Comité de Shenzhen segundo pueblo de Hospital, Universidad de Shenzhen.

1. aislar y cultura rbSF-MSCs

1. Preparaciones para el procedimiento de animales
   1. Preparar esqueléticamente maduros mujer Nueva Zelanda conejos blancos para la colección de rbSF-MSCs. realizar un examen clínico de los conejos, un día antes del procedimiento anestesia y artrocentesis.
      Nota: debe incluir exámenes físicos peso (2.0-2.5 kg....

Results

Aislamiento, purificación y la cultura de las rbSF MSCs:
Este protocolo utiliza MACS para aislar rbSF-MSCs, basados en la expresión del marcador de superficie MSC CD90. Figura 1muestra un diagrama de flujo proceso de rbSF-MSCs aislamiento, purificación, caracterización y el protocolo de cultivo en vitro .

Morfología de la célula después de la célula activada magn.......

Discussion

La existencia de las MSCs en el líquido sinovial proporciona una alternativa para la terapia celular. Estudios anteriores han demostrado que lesiones sitios contienen cantidades más altas de células madre mesenquimales en su líquido sinovial, que puede ser correlacionado positivamente con el período posterior a la lesión⁵. El MSCs en el líquido sinovial pueden ser beneficiosos al tejido para mejorar la curación espontánea después de una lesión^18,

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagents
MesenGro	StemRD	MGro-500 1703	Warm in 37 ° C baño de agua antes de usar
MesenGro Suplemento	StemRD	MGro-500 M1512	Componente del medio de cultivo MSCs
DMEM básico	Gibco Inc.	C11995500BT	MSCs medio de diferenciación
Solución salina isotónica	Litai, China	5217080305	Cavidad reactivo de procedimiento de artrocentesis
Salina tamponada con fosfato (PBS)	HyClone Inc.	SH30256.01B	PBS, libre de Ca2+/Mg2+
Suero bovino fetal (FBS)	Gibco Inc.	10099-141	Componente del medio de cultivo MSCs Solución de
yodo Povidona	Guangdong, China	150605	Agente de esterilización
75% etanol	Lircon, China	170917	Agente de esterilización
0.25% Trypsin/EDTA	Gibco Inc.	25200-056	Reactivo de disociación celular
1% Penicilina-Estreptomicina	Gibco Inc.	15140-122	Componente del medio MSCs
MACS Running Buffer	MiltenyiBiotec	5160112089	Contiene solución salina tamponada con fosfato (PBS), 0,5% de albúmina sérica bovina (BSA) y 2
microperlas conjugadas con anticuerpos mMEDTA CD90	MiltenyiBiotec	5160801456	para la clasificación de células activadas
magnéticamente Piruvato de sodio	Sigma-Aldrich	P2256	Componente de las MSCs condrogénicas
diferenciación dexametasona	Sigma-Aldrich	D1756	Componente de la diferenciación osteogénica de las MSC
ITS	BD	354352	1%, Componente de la diferenciación condrogénica de las MSCs
L-prolina	Sigma-Aldrich	P5607	0,35 mM, Componente de la diferenciación condrogénica de las MSCs
L-ascórbico-2-fosfato	Sigma-Aldrich	A8960	50 mM, Componente de la diferenciación condrogénica de las MSC
3-isobutil-1-metilxantina	Sigma-Aldrich	I5879	0,5 mM, Componente de la diferenciación adipogénica
Indometacina	Sigma-Aldrich	I7378	100 mM, Componente de la diferenciación adipogénica
TGFβ 1	Peprotech	100-21	10 ng/mL, Componente de las MSCs diferenciación condrogénica
alfa;-glicerophsphate	Sigma-Aldrich	G6751	Componente de la diferenciación osteogénica de las MSCs
Anticuerpo policlonal CD34, FITC Bioss conjugado		bs-0646R-FITC Marcador de	células madre hematopoyéticas
Anticonejo de ratón CD44 Bio-Rad		MCA806GA	membrana Thy-1 glicoproteína (marcador de MSCs)
CD45 (anticuerpo monoclonal)	Bio-Rad	MCA808GA	Marcador de células madre hematopoyéticas
Marcador de anticuerpos CD105	Genetex	GTX11415	Marcador de MSCs
Alcohol isopropílico	Sigma-Aldrich	I9030	Precipitados Extracción de ARN fases orgánicas
Triclorometano	Wengué, China	61553	Extracto de ARN total
Trizol	Invitrogen	15596-018	Aislado de ARN total
SYBR mezcla maestra verde	Takara Bio, Japón	prueba de PCR	RR420A
	Takara Bio, Japón	RR047A	Transcrito inverso a ADN complementario
Alizarina Rojo	Sigma-Aldrich	A5533	Tinción de compuestos de calcio
Azul de toluidina	Sigma-Aldrich	89640	Tinción de tejido cartilaginoso
Aceite Solución roja O	Sigma-Aldrich	O1391L	Tinción de vacuolas lipídicas
Equipo
MiniMACS Separador	MiltenyiBiotec	130-042-102	Para la clasificación por células activadas magnéticamente
MultiStand	MiltenyiBiotec	130-042-303	Para la clasificación por células activadas magnéticamente
Columnas MS	MiltenyiBiotec	130-042-201	Para la clasificación de células activadas magnéticamente
Filtro de células	FALCON Inc.	352340	40 μ m
Hemocitómetro de	ISOLAB Inc.	075.03.001	Recuento de células
Plato Falcon de 100 mm	Corning	353003	Plato de cultivo celular
Tubo de microcentrífuga	Axygen	MCT-150-C Tubos de	extracción de ARN y PCR
Sigma-Aldrich	91050	Esterilizado por rayos gamma
Centrífuga de alta velocidad	Eppendorf	5804R	Celdas de centrífuga
Célula de dióxido de carbono incubadora	Thermo scientific	3111	Cultivo celular
Instrumento de PCR en tiempo real Life	Tech	Life Tech QuantStudio	Reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa en tiempo real
Citómetro de flujo	BD Biosciences	342975	Analizador
Pipeta	Eppendorf	O25456F	Transferir el líquido
Cilindro de clonación	Sigma-Aldrich	C3983-50EA	Aislar y seleccionar colonias celulares individuales
Jeringa hipodérmica estéril	Double-Dove, China	131010	Procedimiento de artrocentesis
Jaula para conejos	Zhike, China	ZC-TGD	Sujetar al conejo