El protocolo descrito en este artículo utiliza el músculo levator auris longus (LAL) de ratón para grabar espontánea y nervio postsynaptic potenciales evocados (abrazadera de la corriente) y corrientes (abrazadera de tensión) en la Unión neuromuscular. Uso de esta técnica puede proporcionar ideas claves en los mecanismos de transmisión sináptica en condiciones normales y la enfermedad.
Se requiere una suscripción a JoVE para ver este contenido. Inicie sesión o comience su prueba gratuita.
Artículo de método
Del levator Auris Longus Preparación para examen de la transmisión Neuromuscular mamífero bajo condiciones de fijación de voltaje
En este artículo
Resumen
Resumen
Este protocolo describe una técnica para grabar transmisión sináptica de la placa neuromuscular bajo condiciones de corriente abrazadera y pinza de voltaje. Una preparación ex vivo del levator auris longus (LAL) se utiliza porque es un músculo delgado que proporciona una visualización fácil de la placa neuromuscular para empalamiento de microelectrodos en la placa motora. Este método permite la grabación de potenciales de placa miniatura espontáneos y corrientes (mEPPs y mEPCs), potenciales evocados del nervio tapa y corrientes (productos ambientalmente preferibles y EPC), así como las propiedades de la membrana de la placa motora. Resultados obtenidos de este método incluyen el contenido cuántico (QC), número de sitios de lanzamiento de vesícula (n), la probabilidad de liberación de la vesícula (prel), facilitación sináptica y depresión, así como la constante de tiempo de la membrana muscular (τ m) y la resistencia de entrada. Aplicación de esta técnica en modelos de ratón de la enfermedad humana puede destacar patologías fundamentales en Estados de enfermedad y ayudar a identificar estrategias de tratamiento novedosas. Por voltaje-sujeción totalmente una sola sinapsis, este método proporciona uno de los más detallados análisis de la transmisión sináptica actualmente disponible.
Introducción
Estudio de transmisión sináptica en la Unión neuromuscular proporciona penetraciones en la relación dinámica entre los sistemas nervioso y esqueléticos musculares y es un excelente modelo de examen de Fisiología sináptica. El levator auris longus (LAL) es un músculo delgado, que permite las uniones neuromusculares a visualizarse fácilmente. Informes anteriores han descrito la conveniencia de utilizar el LAL para examinar las toxinas y drogas sinápticas y han caracterizado a las características del tipo de fibra del músculo esquelético de la LAL1,2. Numerosos estudios han utilizado el LAL examinar fisi....
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Protocolo
Animales todos los procedimientos fueron realizados según el cuidado Animal y uso Comité de Wright State University.
1. ratón eutanasia
- En una campana de humos, colocar el ratón en un cristal hermético anestesiar cámara.
- Exponga el ratón mediante la inhalación de una dosis letal de isoflurano (saturar o ~ 25%). Deje el ratón en la cámara hasta que no se observan respiración.
- Quite el ratón de la cámara y realizar una dislocación cervical como método secundario de la eutanasia.
2. retiro del pelo de la superficie Dorsal de la cabeza, cuello y espalda
- Use una afeitadora....
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Resultados
La figura 8 muestra un ejemplo de los pulsos corriente (figura 8A) y las respuestas de tensión (figura 8B) de una fibra LAL debajo de la abrazadera de la corriente de un tipo de salvaje de 12 semanas de edad ratón R6/2. La presencia de mEPPs indica que estos registros fueron tomados de la placa motora. Los registros se obtuvieron en solución salina fisiológica normal. Estos registros de abrazadera de.......
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Discusión
Se describe aquí es la preparación y uso del ratón muscular LAL para la medición de la transmisión neuromuscular en condiciones de fijación de corriente o voltaje. Hay varios puntos importantes a considerar para la disección de la LAL. Limpieza excesiva del tejido conectivo de las ayudas de músculo en empalamiento del electrodo, como los electrodos puede conseguir el tejido conectivo al posicionamiento de empalamiento. Sin embargo, sólo quitar el tejido fino conectivo eso se puede quitar fácilmente para limitar las posib.......
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Agradecemos Dr. Mark M. Rich y Daniel Miranda comentarios editoriales, Ahmad Khedraki para ayudar a establecer esta técnica y la Universidad Estatal de Wright para apoyo financiero (fondos de arranque a A.A.V.).
....Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Microscopio compuesto Olympus | Olympus | BX51WI | |
| 10x Objetivo | Olympus | UMPLFLN10XW | |
| 40x Objetivo | Olympus | LUMPLFLN40XW | |
| Vidrio de borosilicato | Cámara CCD | BF150-86-7.5 | |
| Instruments Santa Bárbara Instruments Group | ST-7XMEI | ||
| Mater-9 Pulse Generador | AMPI | ||
| Iso-flex Aislador de estímulo | AMPI | ||
| pCLAMP 10 Software de adquisición y análisis de datos | Dispositivos moleculares | 1-2500-0180 | |
| Electrodo bipolar concéntrico | FHC | CBDSH75 | |
| Manipulador de rótulas | Narishige | ||
| Jeringas no metálicas Calibre 34 | World Precision Instruments | MF34G-5 | |
| Microscopio estereoscópico Nikon | SMZ800N | ||
| n.º 5 Pinzas | Herramientas | ||
| fina Tijeras de resorte | Herramientas de ciencia fina | 15006-09 | |
| N.º 2 Pinzas | Roboz | RS-5Q41 | |
| Microdisección Tijeras | Roboz | RS-5912SC | |
| Sylgard 184 Kit de elastómero de silicona | Dow Corning | 2404019862 | |
| Crema Depilatoria | Nair | ||
| Grass SD9 Estimulador | Grass Medical | ||
| Model P-1000 Extractor de micropipetas | Sutter Instruments | P-1000 | |
| Axon Digidata 1550 Sistema de Acusión de Datos de Bajo Ruido | Dispositivos | ||
| Filtro Bessell de paso bajo | Warner Instrument Corp. | LPF-8 | |
| Micromanipulador para zurdos | Siskiyou Corp. | MX1641/45DL | |
| Micromanipulador para diestros | Siskiyou Corp. | MX1641/45DR | |
| Controlador de movimiento único | Siskiyou Corp. | MC100e | |
| Siskiyou Corp. | MX1641R | Esto se agregó al eje Z de los micromanipuladores para zurdos y diestros para permitir que el eje z sea motorizado. Esta configuración personalizada es más barata y menos voluminosa que comprar un micromanipulador motorizado de 4 ejes. También nos permite controlar ambos micromanipuladores con un controlador | |
| Todos los productos químicos fueron ordenados por Fisher, excepto, | |||
| BTS | Toronto Research Chemicals | B315190 | |
| CTX | Alomone Labs | C-270 | |
| 4-Di-2-Asp | Molecular Probes | Molecular probes ya no es una empresa. Ahora pedido a través de Fisher |
Referencias
- Angaut-Petit, D., Molgo, J., Connold, A. L., Faille, L. The levator auris longus muscle of the mouse: a convenient preparation for studies of short- and long-term presynaptic effects of drugs or toxins. Neurosci Lett. 82 (1), 83-88 (1987).
- Erzen, I., Cvetko, E., Obreza, S., Angaut-Petit, D.
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Reimpresiones y permisos
