Cuantificación del crecimiento intracelular dentro de los macrófagos es un rápido y confiable método para evaluar la virulencia de los parásitos de Leishmania

Amrita Sarkar; Yousuf A. Khan; Maria Fernanda Laranjeira-Silva; Norma W. Andrews; Bidyottam Mittra

doi:10.3791/57486

Artículo de método

Cuantificación del crecimiento intracelular dentro de los macrófagos es un rápido y confiable método para evaluar la virulencia de los parásitos de Leishmania

DOI:

10.3791/57486

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16 de marzo de 2018

Amrita Sarkar¹ , Yousuf A. Khan¹ , Maria Fernanda Laranjeira-Silva¹ , Norma W. Andrews¹ , Bidyottam Mittra¹

¹Department of Cell Biology and Molecular Genetics, University of Maryland

En este artículo

Resumen

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Todas las especies patógenas de Leishmania residen y replican dentro de macrófagos de hospederos vertebrados. Aquí, presentamos un protocolo para infectar macrófagos derivados de médula ósea murinos en cultura con Leishmania, seguida por la cuantificación precisa de la cinética de crecimiento intracelular. Este método es útil para el estudio de los factores individuales que influyen en la interacción huésped-patógeno y virulencia de Leishmania .

Resumen

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El ciclo vital de Leishmania, el agente causal de la leishmaniasis, alterna entre fases de promastigote y amastigote dentro del insecto y anfitriones vertebrados, respectivamente. Mientras que los síntomas patógenos de la leishmaniasis pueden variar ampliamente, desde lesiones cutáneas benignas formas altamente fatal enfermedad visceral dependiendo de la especie infecciosa, todas las especies de Leishmania residen dentro de los macrófagos del huésped durante la etapa de vertebrados de su ciclo de vida. Infectividad de Leishmania por lo tanto está directamente relacionada con su capacidad de invadir, sobrevivir y replicarse dentro de las vacuolas parasitófora (PVs) dentro de los macrófagos. Por lo tanto, evaluar la capacidad del parásito para replicar intracelularmente sirve como un método confiable para determinar la virulencia. Estudiar desarrollo de leishmaniasis utilizando modelos animales es lento, tedioso y a menudo difícil, especialmente con las formas viscerales patógeno importantes. Describimos aquí una metodología para seguir el desarrollo intracelular de Leishmania en los macrófagos derivados de médula ósea (BMMs). Parásito intracelular números se determinan intervalos de 24 h de 72-96 h después de la infección. Este método permite una determinación confiable de los efectos de diferentes factores genéticos en la virulencia de la Leishmania . Como ejemplo, mostramos cómo una canceladura solo alelo del gene del transportador de hierro mitocondrial de Leishmania (LMIT1) perjudica la capacidad de la cepa mutante de Leishmania amazonensis LMIT1/ΔLmit1 para crecer dentro de BMMs, que refleja una drástica reducción en la virulencia, en comparación con el tipo salvaje. Este ensayo también permite un control preciso de las condiciones experimentales, que pueden manipularse individualmente para analizar la influencia de diversos factores (nutrientes, especies reactivas de oxígeno, etcetera) en la interacción huésped-patógeno. Por lo tanto, la ejecución apropiada y cuantificación de los estudios de infección de BMM ofrecen una alternativa no invasiva, rápida, económica, segura y confiable a los estudios modelo animales convencionales.

Introducción

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La leishmaniasis se refiere a un amplio espectro de enfermedades humanas causadas por especies de parásito protozoario del género Leishmania. Cerca de 12 millones de personas están actualmente infectadas con Leishmania en todo el mundo, y más de 350 millones están en riesgo. La patología de la enfermedad depende de la especie de Leishmania y en factores del anfitrión, y los síntomas varían desde lesiones de piel de auto-sanación inofensivo a formas letales de visceralizing. Si la leishmaniasis visceral, sin tratamiento es fatal, ranking sólo después de la malaria como la mortal enfermedad humana causada por infección con un parásito protozoa....

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Protocolo

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Todos los procedimientos experimentales se realizaron según las recomendaciones de la guía para el cuidado y uso de animales de laboratorio por los institutos nacionales de salud y fueron aprobados por la Universidad de Maryland IACUC. Todos los pasos descritos en las secciones 1 a 4 deben realizarse asépticamente dentro de gabinetes de flujo laminar biológicas. Protección personal debe ser utilizada, y debe tener cuidado durante la manipulación de los parásitos de Leishmania vivo en todas las etapas de experimentación.

1. aislamiento y diferenciación de los macrófagos derivados de médula ósea (BMMs)⁸^,

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Resultados

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Leishmania tiene dos formas infectantes - promastigotes métodos que diferencian de promastigotes procíclicas en la fase estacionaria de la cultura y los amastigotes, que son las etapas intracelulares (figura 1). En algunas especies de Leishmania como L. amazonensis, amastigotes puede también diferenciarse en cultivo axénico desplazando las células promastigote para bajar el pH (4.5) y elevada temperatura (32 ° C), condiciones simila.......

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Discusión

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Los datos cuantitativos producidos por el ensayo de infección de BMM descrito anteriormente, permite a los investigadores obtener las tasas de infección y una determinación confiable de cambios en las propiedades de virulencia en un período de tiempo relativamente corto (máximo 2 semanas, en comparación con el 2 meses necesarios para experimentos en vivo ). Este método se basa en el tinte específico DNA DAPI, que específicamente las manchas núcleos macrófago y parásito y permite la rápida identificación y cuanti.......

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Divulgaciones

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Los autores declaran que no tienen intereses financieros que compiten,

Agradecimientos

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Este trabajo fue financiado por los institutos nacionales de la subvención de salud AI067979 to1 a NWA.
YK es beneficiario de beca de pregrado de la Howard Hughes Medical Instituto/Universidad de Maryland College Park.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
Nombre	Empresa	Número de catálogo
Placa de cultivo celular de 6 pocillos	Cellstar	657160
Adenina	Acros Organics	AC147440250
Puntas de pipeta de barrera contra aerosoles (100-1000 μ L)	Fisherbrand	02-707-404
Puntas de pipeta de barrera de aerosol (20-200 μ L)	Fisherbrand	02-707-430
Puntas de pipeta de barrera de aerosol (2-20 μ l)	Fisherbrand	02-707-432
Bard-Parker Cuchilla quirúrgica de acero al carbono con respaldo acanalado # 10	Aspen Surgical	371110
BD Luer-Lok Punta 10 mL Jeringa	Becton Dickinson (BD)	309604
BD Aguja Precisionglide, 25G	Becton Dickinson (BD)	305124
Plato de cultivo celular 35 mm x 10 mm	Cellstar	627 160
Matraz de cultivo celular	Cellstar	660175
Cubrevases: círculos de 12 mm	Fisherbrand	12-545-80
DAPI (4',6-Diamidino-2-Fenilindol, Dihidroclorhidrato)	Invitrogen	D1306
D-Biotina	J.T. Baker	C272-00
EDTA	Sigma Aldrich	EDS
Alcohol etílico 200 grados	Pharmco-AAPER	111000200
Falcon 100 mm x 15 mm poliestireno tratado sin TC Placa de Petri	Corning	351029
Suero fetal bovino	Seradigm	1500-500
Ficoll400	Sigma Aldrich	F8016
Microscopio de fluorescencia	Nikon	E200
Cabra anti-ratón IgG Texas rojo	Invitrogen	T-862
Cabra anti-conejo IgG AlexaFluor488	Invitrogen	A-11034
Hemin	Tokyo Chemical Industry Co. Ltd	H0008
HEPES (1M)	Gibco	15630-080
Isoton II Diluyente	Beckman Coulter
L-glutamina	Gemini	400-106
Medio 199 (10X)	Gibco	11825-015
Na piruvato (100 mM)	Gibco	11360-070
Paraformaldehído	Alfa Aesar	43368
Penicilina/Estreptomicina	Gemini	400-109
Solución salina tamponada con fosfato (-/-)	ThermoFisher	14200166
Tubos de centrífuga cónicos de polipropilena 15 mL	Cellstar	188 271
Tubos de centrífuga cónicos de polipropileno 50 mL	Cellstar	227 261
Reactivo antidecoloración ProLong Gold	ThermoFisher	P36930
Anticuerpo anti-ratón Rat Lamp-1	Estudios del desarrollo Banco de hibridomas	1D4B
M-CSF humano recombinante	PeproTech	300-25
Reichert Bright-Line Hemocitómetro	Hausser Scientific	1492
RPMI Medium 1640 (1X)	Gibco	11875-093
Triton X-100 Surfactante	Millipore Sigma	TX1568-1
Trypan Blue	Sigma Aldrich	T8154
Tijeras Delicadas, 4 1/2"	VWR	82027-582
Pinzas de Disección, Punta Fina	VWR	82027-386
Portaobjetos de microscopio	VWR	16004-368
Z1 Coulter Contador de partículas, doble umbral	Beckman Coulter	6605699

8546719

Referencias

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WHO. Control of the leishmaniases. World Health Organ Tech Rep Ser. (949), (2010).
Naderer, T., McConville, M. J. Intracellular growth and pathogenesis of Leishmania parasites. Essays Biochem. 51, 81-95 (2011).
Rosenzweig, D., et al.

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