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Artículo de método

Cuantificación del crecimiento intracelular dentro de los macrófagos es un rápido y confiable método para evaluar la virulencia de los parásitos de Leishmania

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DOI:

10.3791/57486

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16 de marzo de 2018

 ,  ,  ,  , 
1Department of Cell Biology and Molecular Genetics, University of Maryland

En este artículo

Resumen

Todas las especies patógenas de Leishmania residen y replican dentro de macrófagos de hospederos vertebrados. Aquí, presentamos un protocolo para infectar macrófagos derivados de médula ósea murinos en cultura con Leishmania, seguida por la cuantificación precisa de la cinética de crecimiento intracelular. Este método es útil para el estudio de los factores individuales que influyen en la interacción huésped-patógeno y virulencia de Leishmania .

Resumen

El ciclo vital de Leishmania, el agente causal de la leishmaniasis, alterna entre fases de promastigote y amastigote dentro del insecto y anfitriones vertebrados, respectivamente. Mientras que los síntomas patógenos de la leishmaniasis pueden variar ampliamente, desde lesiones cutáneas benignas formas altamente fatal enfermedad visceral dependiendo de la especie infecciosa, todas las especies de Leishmania residen dentro de los macrófagos del huésped durante la etapa de vertebrados de su ciclo de vida. Infectividad de Leishmania por lo tanto está directamente relacionada con su capacidad de invadir, sobrevivir y replicarse dentro de las vacuolas parasitófora (PVs) dentro de los macrófagos. Por lo tanto, evaluar la capacidad del parásito para replicar intracelularmente sirve como un método confiable para determinar la virulencia. Estudiar desarrollo de leishmaniasis utilizando modelos animales es lento, tedioso y a menudo difícil, especialmente con las formas viscerales patógeno importantes. Describimos aquí una metodología para seguir el desarrollo intracelular de Leishmania en los macrófagos derivados de médula ósea (BMMs). Parásito intracelular números se determinan intervalos de 24 h de 72-96 h después de la infección. Este método permite una determinación confiable de los efectos de diferentes factores genéticos en la virulencia de la Leishmania . Como ejemplo, mostramos cómo una canceladura solo alelo del gene del transportador de hierro mitocondrial de Leishmania (LMIT1) perjudica la capacidad de la cepa mutante de Leishmania amazonensis LMIT1/ΔLmit1 para crecer dentro de BMMs, que refleja una drástica reducción en la virulencia, en comparación con el tipo salvaje. Este ensayo también permite un control preciso de las condiciones experimentales, que pueden manipularse individualmente para analizar la influencia de diversos factores (nutrientes, especies reactivas de oxígeno, etcetera) en la interacción huésped-patógeno. Por lo tanto, la ejecución apropiada y cuantificación de los estudios de infección de BMM ofrecen una alternativa no invasiva, rápida, económica, segura y confiable a los estudios modelo animales convencionales.

Introducción

La leishmaniasis se refiere a un amplio espectro de enfermedades humanas causadas por especies de parásito protozoario del género Leishmania. Cerca de 12 millones de personas están actualmente infectadas con Leishmania en todo el mundo, y más de 350 millones están en riesgo. La patología de la enfermedad depende de la especie de Leishmania y en factores del anfitrión, y los síntomas varían desde lesiones de piel de auto-sanación inofensivo a formas letales de visceralizing. Si la leishmaniasis visceral, sin tratamiento es fatal, ranking sólo después de la malaria como la mortal enfermedad humana causada por infección con un parásito protozoario1. A pesar de las amplias diferencias en patología de la enfermedad y los síntomas, todas las especies de Leishmania tienen un ciclo de vida digenic alternando etapas de promastigote y amastigote dentro de insectos huéspedes vertebrados, respectivamente. Dentro de vertebrados, Leishmania macrófagos host para invasión de destino e inducen la formación de vacuolas parasitófora (PVs), compartimientos ácidos con propiedades de phagolysosomes donde replican las formas de amastigote altamente virulenta. Los amastigotes persisten en los tejidos del huésped durante las infecciones crónicas y pueden pasarse hacia adelante para no infectada flebótomos, completando el ciclo de transmisión. Por lo tanto, en el contexto de desarrollo humano de la enfermedad, los amastigotes son la Leishmania más importantes del ciclo de vida forma2. Investigar cómo replicar amastigotes dentro del macrófago PVs es fundamental para comprensión Leishmania virulencia3,4,5,6,7 y para el desarrollo de nuevas terapias eficaces.

Aquí describimos un método que se utiliza regularmente por nuestro laboratorio para el estudio de infección por Leishmania y replicación en macrófagos derivados de médula ósea (BMMs), lo que implica la evaluación cuantitativa del número de intracelular de Leishmania en el tiempo. Este proceso involucra la recolección de los monocitos de la médula ósea de ratón y diferenciación a macrófagos en la cultura, en vitro infección con formas infectantes (promastigotes métodos o amastigotes) de Leishmania y cuantificación de la número de parásitos intracelulares en cada intervalo de 24 h para un periodo de 72-96 h después de la infección. Este análisis se ha utilizado en nuestro laboratorio para determinar el impacto de varios factores ambientales y genes del parásito, incluyendo la identificación de la función crítica de hierro en la promoción de virulencia de L. amazonensis que además fue validado por bandolero estudios de desarrollo de la lesión en ratones6,8,9,10,11,12,13,14,15 . Como todas las especies patógenas de Leishmania establecen su nicho replicativa dentro de macrófagos del huésped, este ensayo puede utilizarse universalmente para determinar la virulencia en todas las especies de Leishmania .

Realizar infecciones BMM permite el análisis de las interacciones huésped-parásito en el nivel de la célula y así una comprensión más amplia de cómo interactúan los parásitos de Leishmania con su microambiente anfitrión favorito, el PVs de los macrófagos. Análisis de la infección de macrófagos se han utilizado con éxito por múltiples grupos16,17,18,19,20,21,22 a explorar funciones de los macrófagos del huésped y genes específicos de Leishmania y su posible participación en la compleja interacción que caracteriza la infección intracelular. Infecciones de BMM permiten la cuantificación del crecimiento del parásito como un indicador del impacto de factores del huésped que influyen en la supervivencia intracelular, como la producción de óxido nítrico de microbicidas, generación de especies reactivas de oxígeno y otras condiciones adversas encontrados dentro del lisosoma-como PVs23. Análisis de la infección de macrófagos también han sido utilizados para identificar potenciales leishmanial anti drogas conduce para desarrollo terapéutico13,24.

La naturaleza en vitro de las infecciones de BMM proporciona varias ventajas sobre otros métodos para evaluar la virulencia de la Leishmania . Sin embargo, varios estudios anteriores examinando mecanismos de supervivencia del parásito intracelular con el tiempo no se cuantificó la infección como una tasa de21,20,24. Además, muchos estudios se centró en seguir en vivo las infecciones con el tiempo lo hicieron midiendo el tamaño de la lesión cutánea y otros síntomas fisiológicos que están sólo indirectamente relacionados con parásito replicación25,26 , 27. infección in vivo es un enfoque riguroso para evaluar la virulencia del parásito, pero mediciones de tamaño de lesión basadas en bandolero solo la hinchazón a menudo son insuficientes, ya que reflejan la respuesta inflamatoria en los tejidos infectados y no la número absoluto de parásitos. Por esta razón, el desarrollo de la lesión de bandolero ensayos tienen que ser seguida por la cuantificación de la carga del parásito en tejidos infectados, un procedimiento que requiere dilución limitante largo ensayos de28. Además, en vivo los estudios implican a menudo sacrificar varios animales en diferentes puntos en el tiempo para extraer los tejidos de interés6,8,9,10, 11 , 13. en cambio, gran número de BMMs puede obtenerse en un animal, y estas células pueden ser bajo condiciones que permiten la evaluación de la infección en varios puntos en el tiempo. Además, en comparación con estudios en vivo , realizar en vitro infecciones BMM permite un mayor control sobre las condiciones experimentales. Cuantificación de los macrófagos infectados con los parásitos permite un control preciso de la multiplicidad de infección (MOI) y de las condiciones de cultivo. Control fino sobre estos factores puede ser clave en la identificación de las características de las vías celulares discretas y en la comprensión de su impacto en el curso de la infección.

Dadas estas ventajas, es algo sorprendente que muy pocos grupos de estudio de virulencia de Leishmania han tomado hasta ahora aprovechando el gravamen cuantitativo de la replicación intracelular en los macrófagos. En este artículo, discutimos los errores comunes que pueden obstaculizar la utilización más amplia de este ensayo y proporcionar un protocolo paso a paso para facilitar su correcta ejecución. Teniendo en cuenta su precisión y versatilidad, el ensayo de infección de BMM que se describe aquí puede no sólo utilizarse para explorar las interacciones huésped-patógeno que influyen en la virulencia de la Leishmania , pero también para el estudio de otros microorganismos que repliegan dentro de los macrófagos29. Lo importante es que, este ensayo se puede desarrollar como un método de cribado clínico previo rápido y económico para el desarrollo de fármacos anti-leishmanial.

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Protocolo

Todos los procedimientos experimentales se realizaron según las recomendaciones de la guía para el cuidado y uso de animales de laboratorio por los institutos nacionales de salud y fueron aprobados por la Universidad de Maryland IACUC. Todos los pasos descritos en las secciones 1 a 4 deben realizarse asépticamente dentro de gabinetes de flujo laminar biológicas. Protección personal debe ser utilizada, y debe tener cuidado durante la manipulación de los parásitos de Leishmania vivo en todas las etapas de experimentación.

1. aislamiento y diferenciación de los macrófagos derivados de médula ósea (BMMs)8,30,31

  1. Día 0: 4 - 6 semanas de edad hembra C57BL/6 o el ratón BALB/c en CO2 cámara de sacrificio y confirmar muerte por dislocación cervical. Asegurar la esterilización de tijeras y pinzas manteniéndolos empapado en etanol al 70%. Pulverice los guantes con etanol al 70% para permitir que la estéril manejo durante todo el proceso de aislamiento de células de médula ósea.
  2. Fijando sus patas delanteras para asegurar ratón sacrificado para tablero de disección y desinfectar rociando copiosamente con etanol al 70%.
  3. Hacer una incisión pequeña (1 cm) con unas tijeras cerca de la articulación de la cadera. Inserte con cuidado las tijeras debajo de la piel para separar el músculo subyacente y cortar la piel alrededor de la articulación de la cadera.
    Nota: La tabla de disección puede girarse para permitir mejorar el acceso a la articulación de la cadera.
  4. Deglove piel de la pierna tirando hacia el tobillo y retire cuidadosamente. Corte el pie en el tobillo, teniendo cuidado de cortar en o debajo del tobillo empalme dejar intacta la tibia.
    Nota: El peroné en esta etapa se une libremente y se puede separar fácilmente con el fórceps.
  5. Localizar manualmente la articulación de la cadera mediante la manipulación del fémur para identificar el punto de rotación. Cuidadosamente use tijeras para cortar la pierna por encima de la articulación de la cadera para dejar intacta la cabeza proximal del fémur.
  6. Quite tanto músculo y tejido conectivo posible de la pierna con unas tijeras. Retire cualquier resto piel del tobillo y cualquier material de hueso sobrante por encima de la articulación de la cadera.
  7. Coloque los huesos de la pierna limpia en estéril RPMI suplementado con penicilina/estreptomicina (concentración final de 1%) en una placa Petri sobre hielo.
  8. Repita los pasos 1.4 por 1.6 para aislar la tibia y el fémur de la otra pata trasera.
  9. Retire cualquier resto tejido muscular y conjuntivo de los huesos en RPMI usando pinzas esterilizadas y estéril cuchilla #10.
  10. Coloque los huesos en la tapa de la caja de Petri. Corte cuidadosamente la tibia con la hoja inmediatamente por encima de la articulación del tobillo a la médula. Retire la tibia el resto de la pierna por corte inmediatamente por debajo de la articulación de la rodilla.
  11. Extraer 10 mL estéril RPMI suplementado con penicilina/estreptomicina (concentración final de 1%) en una jeringa de 10 mL y conecte una aguja de 25G.
  12. Mantenga la tibia firmemente con unas pinzas, verticalmente sobre un tubo cónico de 50 mL en hielo. Utilice la jeringa para inyectar suavemente unos 5 mL RPMI en el extremo del hueso para eliminar la médula ósea en el otro extremo en el tubo cónico. Enjuague la médula ósea con un total de 10 mL RPMI hasta que el hueso se pone blanco.
    Nota: Después del lavado cuidadoso, el hueso debe virar a blanco. Si no, continúe enjuagando para extraer médula ósea. El extremo distal de la tibia puede que se deba recortar con la hoja si es demasiado estrecho para introducir la aguja.
  13. Corte del fémur inmediatamente por encima de la articulación de la rodilla e inmediatamente por debajo de la articulación de la cadera para exponer ambos extremos del hueso a la médula. Limpiar la médula ósea de fémur con un total de 10 mL RPMI en la misma forma que la tibia.
  14. Repetir limpieza y lavado pasos 1.6 a través de 1.13 con los huesos restantes y recoger las células de médula ósea lavada en un tubo cónico de 50 mL solo
    Nota: Si un hueso se rompe en cualquier punto durante la disección antes de hueso lavado, use el tuétano de este hueso.
  15. Centrifugar el tubo cónico utilizado para recolectar la médula ósea, lavada de todos los huesos de cuatro por 10 min a 4 ° C a 300 x g.
  16. Coloque 60 mL de medio estéril de BMM (RPMI con una concentración final de 20% FBS, 1% de penicilina/estreptomicina, 1,2 mM Na-piruvato, 25 μg/mL M-CSF humano) en un matraz de cultura de célula de 175 cm2 con tapa de filtro.
  17. Deseche el sobrenadante centrifugado siguiente y resuspender el precipitado de células por suave arriba y abajo de pipeteo con 5 mL de medio BMM del frasco.
  18. Suspensión de células de transferencia en el matraz de cultivo y enjuague el tubo cónico dos veces con medio BMM del frasco de cultivo para garantizar la recuperación máxima de la célula. Asegurar la suspensión celular se mezcla completamente en el medio y distribuir 30 mL del frasco de cultivo celular inicial de 175 cm2 a un segundo 175 cm2 célula cultura matraz con tapa de filtro.
  19. Incubar ambos matraces que contienen la suspensión de células de 30 mL cada noche a 37 ° C, 5% CO2 para permitir la separación de cualquier contaminante de los fibroblastos, los macrófagos residentes y otras células adherentes.
  20. Día 1: Transferir el sobrenadante que contiene las células indiferenciadas de la médula de matraces de 100 x 15 mm tratados de TC no poliestireno cajas Petri en aproximadamente 10 mL, incubar a 37 ° C, 5% CO2. y plato Deseche los frascos.
  21. Día 3 o 4: Añadir un medio BMM adicional 5 mL (previamente calentado a 37 ° C) a cada placa de Petri y continuar la incubación a 37 ° C, 5% CO2.

2. galjanoplastia BMMs de cubreobjetos para la infección (día 7 o 8)

  1. Preparar platos para cultivo de tejidos 6 bien colocando cuatro 4 estéril 12 mm vidrio cubreobjetos (autoclave y almacenados en un recipiente de vidrio cerrado) en la parte inferior de cada vacío bien.
    Nota: Recoger cada cubreobjetos estériles 12 mm con una punta de aspiración para una línea de vacío. Coloque un cubreobjetos los pozos sin traslapo, soltar en la posición deseada por pellizcar el tubo para interrumpir el vacío.
  2. Medios (y Aspire las células no adherentes) de platos de Petri recubiertas con médula ósea adherente derivan macrófagos y suavemente adherente de enjuague células x 2 con solución salina amortiguadora de fosfatos estéril de Dulbecco sin cloruro de calcio y magnesio (PBS- / -) previamente calentado a 37 ° C.
  3. Gota a gota, añada 5 mL estéril 1 x PBS- / - con una concentración final de 1 mM EDTA a cada placa de Petri e incubar 5 min a 37 ° C para separar el adherente BMMs. verificar que las células son separadas usando un microscopio.
  4. Recoger todo separado las células suspendidas en PBS 1 x- / - suplementados con 1 mM de EDTA en un tubo cónico de 50 mL. Enjuague cada plato x 2 con 5 mL de PBS- / - y añadir a la piscina de suspensión celular.
    Nota: Suspensión de la célula puede diluirse con PBS adicional- / - para proteger a los macrófagos de la toxicidad del EDTA durante el proceso de recolección.
  5. Centrifugar a 300 x g durante 10 min a 4 ° C. Deseche el sobrenadante y resuspender los macrófagos en medio BMM de 5-10 mL por pipeteo. Lugar serán suspendidas las células en hielo para evitar la fijación tubos y aglutinación.
  6. Contar las células viables mediante exclusión del azul tripán en el hemocitómetro.
    Nota: Para contar células BMM suspendidas en medio de 5 mL, una mezcla de dilución de la suspensión celular de 25 μL en 445 de μl PBS- / - y solución de azul de tripano 0.4% 30 μL típicamente permite fácil cuantificación en un hemocitómetro (teniendo en cuenta un factor de dilución de 20 x para el cálculo final ). Contar sólo las células que no conseguir teñidas con azul de tripán (células viables). El volumen de la suspensión celular se puede alterar si esta mezcla es muy concentrada o diluida. En general, el rendimiento de BMM por preparación varía entre 2 x 107 y 5 x 107 células de un ratón.
  7. Preparación de la suspensión celular en medio BMM en la concentración deseada de la galjanoplastia (5 x 105/ml) y dispersar suspensión a 6 platos bien en medio de 2 mL por pozo, para que así cada uno recibe 1 x 106 macrófagos.
    Nota: Este es un paso crítico que asegura cada bien consigue el número suficiente de macrófagos para cubrir uniformemente el cubreobjetos. Asegúrese de cubreobjetos en pozos no están superpuestos o flotando en el medio. Si es así, ajuste suavemente con una pipeta estéril.
  8. Incubar durante una noche a 37 ° C, 5% CO2.

3. purificación de formas infectivas de L. amazonensis

Nota: Preparar Leishmania infecciones purificar métodos promastigotes del promastigote estacionario culturas8,13o promastigotes en cultivo se diferencian en la forma de amastigote utilizando estándar L. amazonensis diferenciación axénicos protocolo6,8.

  1. Purificación de métodos promastigotes de Leishmania mediante media(Materials) gradiente de densidad 33
    1. Prepare solución 40% de la media de gradiente de densidad en agua estéril, libre de endotoxinas.
    2. Diluir la solución de gradiente de densidad en medio de x M199 10 (sin suero) para preparar la concentración de 10% en medio M199.
    3. Todas las soluciones de filtro por filtro de 0,22 μm.
      Nota: Las soluciones Stock pueden almacenarse a 4 oC en la oscuridad durante no más de 1 mes.
    4. Añadir 2 mL de solución de medios gradiente de densidad de 40% en la parte inferior de un tubo de centrífuga cónico de 15 mL.
    5. La capa 2 mL de solución de medios gradiente de densidad 10% en M199 encima de la capa de gradiente media densidad 40% cuidadosamente, utilizando una pipeta Pasteur para evitar cualquier mezcla entre las dos capas.
    6. Recoger 1 x 109 parásitos de la cultura de la fase estacionaria por centrifugación a 1.900 x g por 10 min.
    7. Resuspender las células en de 6 mL Dulbecco modificado medio esencial (DMEM).
    8. Capa 2 mL de la suspensión de células directamente en la parte superior la densidad 10% gradiente media capa, suavemente, usando una pipeta Pasteur para evitar la mezcla entre las capas.
    9. Centrifugue el gradiente durante 10 min a 1.300 x g a temperatura ambiente.
      Nota: Debido a las diferencias en las propiedades físicas entre las especies de Leishmania , condiciones de centrifugación para cada uno pueden tener que ajustarse ligeramente para asegurar rendimiento máximo.
    10. Recoger parásitos (enriquecidos en forma promastigote métodos) de la banda formada en el límite de medios gradiente de densidad 10% superior (interfaz entre las capas de medios gradiente de densidad 0% y 10%).
    11. Diluir los parásitos con un volumen de DMEM y recogen por centrifugación (1.900 x g durante 10 min a temperatura ambiente).
    12. Resuspender en 500 μl de medio DMEM y contar en un hemocitómetro para cuantificar el rendimiento.
  2. Generación de amastigotes de L. amazonensis bajo condiciones de cultivo axénicos (bajo pH / elevada temperatura)6,8,13
    1. Mezclar 5 mL de cultivo de promastigote de fase logarítmica (pH 7.4 a 26 oC) con un volumen igual de medio de amastigote (pH 4.5), utilizando matraces de 25 cm2 (medio total 10 mL) e incubar a 26 ° C durante la noche.
    2. Cambiar el frasco de 26 ° C a 32 ° C.
    3. Después de 3 o 4 días, fractura cultura 1:5 en amastigote media a 32 ° C.
    4. Controlar los parásitos en los próximos 3-4 días (máximo 7 días) para ver si están listos para su uso en infecciones.
      Nota: Amastigotes axénicos saludables debe tener una forma ovalada, sin flagelos visibles. Amastigotes parcialmente diferenciados tienen una forma oval grande con flagelos cortos. La cultura no debe tener un montón de grupos - muchos grupos son una indicación de no crecimiento, mueren los parásitos. La cultura de amastigote se puede dividir 1:5 y mantenida durante un máximo de 3 semanas.

4. infección con L. amazonensis

  1. Diluir la suspensión de parásitos según MOI deseada (generalmente 3-5 métodos promastigotes por macrófagos [MOI de 1:3 o 1:5]) y 1 amastigote por macrófagos [MOI 1:1]. Añadir Leishmania en PBS- / - en un volumen de 50-100 μl a cada pozo ya que contiene medio de 2 mL.
  2. Incubar BMMs durante 1 h con amastigotes y 3 h con métodos promastigotes en 34 oC infección.
    Nota: Temperatura óptima de la infección puede variar según las especies.
  3. Tras la incubación, lavar cuidadosamente lejos parásitos libres en cada bien 3 veces con 2 mL de PBS- / - precalentado a 37 ° C.
    Nota: Dispersar PBS suavemente para asegurar que cubreobjetos no flota sobre la otra. Agitar suavemente la placa y luego aspirar el líquido. Use la boquilla de aspiración independiente si utiliza múltiples cepas de parásitos para evitar la contaminación cruzada.
  4. Fijar 1 h o 3 h-momento muestras incubando cada una con 1.5-2 mL 2% PFA en PBS- / - durante 10 minutos lavar 3 veces con PBS- / -. No aspirar el último lavado y refrigerar las placas que contienen cubreobjetos en PBS hasta manchas.
  5. Añadir medio fresco de BMM de 2 mL en cada pocillo de las placas para más puntos de tiempo e incubar a 34 ° C.
  6. Fijar los restantes momentos deseados como se describe en el paso 4.3, y refrigere las placas hasta que la coloración.

5. DAPI tinción y montaje de cubreobjetos

  1. Aspire de PBS de los pozos que contienen cubreobjetos y añadir 1,5 mL de PBS- / - con 0,1% detergente no iónico. Incubar 10 min a temperatura ambiente, seguido de lavado 3 veces con 2 mL de PBS- / -.
  2. Añadir 1 mL de PBS- / - con 2 μg/mL de DAPI (diluido de 5 mg/mL de solución stock en agua) en los pocillos que contienen cubreobjetos e incubar durante otro 1 h a temperatura ambiente.
    Nota: El tiempo de incubación con DAPI es fundamental para la correcta visualización de los parásitos de Leishmania intracelulares. Núcleos de macrófago de la mancha rápidamente, debido a su mayor tamaño y ADN contenido pero la coloración de los núcleos de los parásitos intracelulares es más lento. Así, prolongando tiempo de la incubación más allá de lo que es necesaria para visualizar los núcleos BMM es necesario para permitir la DAPI para permear a través y la membrana de plasma del parásito y la membrana nuclear de parásito. Con la correcta tinción DAPI, el cinetoplasto mitocondrial ADN cerca del bolsillo flagelar del parásito se puede también visualizar, además del ADN nuclear.
  3. Lavar bien cada uno que contienen cubreobjetos 3 x con 2 mL de PBS- / - y luego elevación y tapa cubreobjetos con pinzas ponga el lado de la celda abajo y montar en microscopio de vidrio se desliza con un reactivo de montaje antifade comercialmente disponibles.
    Nota: Cubreobjetos son extremadamente frágiles y necesitan manejo cauteloso. Evitar la presión sobre ellos, especialmente contra el flanco de los pozos cuando se levante. Agregando unas pocas gotas de PBS- / - reduce la tensión superficial entre el cubreobjetos y pozo y facilita el proceso de elevación. Puede utilizarse una aguja de calibre fino para alzaprimar el cubreobjetos en el fondo del pozo. Después de colocar un cubreobjetos sobre el portaobjetos, presione suavemente con unas pinzas para extraer cualquier burbuja de aire en los medios de montaje. Si un cubreobjetos está roto o ha volteado posiblemente durante el proceso de elevación, no vuelva a montar; simplemente use el cubreobjetos cuarto de repuesto.
  4. Refrigere diapositivas hasta la cuantificación.

6. cuantificación de la infección

  1. Examinar diapositivas manchadas de DAPI bajo un microscopio de fluorescencia concentrándose en macrófagos con objetivo de 100 X con aceite de inmersión (excitación a 358 nm; emisión óptima en 461 nm).
    Asegúrese de que el foco está en la capa de macrófagos entre el vidrio portaobjetos y cubreobjetos.
  2. Cuantificar el número de macrófagos (grandes núcleos teñidos con DAPI) y el número de pequeños núcleos de amastigote agrupadas alrededor de cada núcleo de macrófagos (véase la figura 2A, DAPI) para cada campo de visión, utilizando un contador manual.
    Nota: Amastigote núcleos pueden no todos ser visibles en un plano de enfoque debido a su pequeño tamaño. Cuenta aquellos que son visibles cuando se centró en núcleos de macrófagos y luego usar foco fino para detectar núcleos de parásito en planos por encima y por debajo de los núcleos de macrófagos.
  3. Hacia otro campo de visión para repetir la cuantificación. Usa un contador separado para seguimiento del número de campos contados. Mover a través de los campos visuales en filas paralelas a través de cada cubreobjetos, para evitar superposición de conteo.
  4. Cuantificar un mínimo de 200 macrófagos por cubreobjetos. Cuantificar cada momento de la infección en triplicado (3 cubreobjetos). Cuenta el cubreobjetos cuarto si uno de los anteriores no es adecuada para el recuento debido a la superposición de cubreobjetos, pobre montaje, rotura de cristales, etc.
    Nota: Si los 200 macrófagos no se puede contar en cualquier un cubreobjetos, contar la de repuesto cuarto.
  5. Calcular las tasas de infección como macrófagos macrófago amastigotes o amastigotes/100 y determinar los macrófagos infectados por ciento de los datos de cuantificación de materia prima.

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Resultados

Leishmania tiene dos formas infectantes - promastigotes métodos que diferencian de promastigotes procíclicas en la fase estacionaria de la cultura y los amastigotes, que son las etapas intracelulares (figura 1). En algunas especies de Leishmania como L. amazonensis, amastigotes puede también diferenciarse en cultivo axénico desplazando las células promastigote para bajar el pH (4.5) y elevada temperatura (32 ° C), condiciones simila...

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Discusión

Los datos cuantitativos producidos por el ensayo de infección de BMM descrito anteriormente, permite a los investigadores obtener las tasas de infección y una determinación confiable de cambios en las propiedades de virulencia en un período de tiempo relativamente corto (máximo 2 semanas, en comparación con el 2 meses necesarios para experimentos en vivo ). Este método se basa en el tinte específico DNA DAPI, que específicamente las manchas núcleos macrófago y parásito y permite la rápida identificación y cuanti...

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Divulgaciones

Los autores declaran que no tienen intereses financieros que compiten,

Agradecimientos

Este trabajo fue financiado por los institutos nacionales de la subvención de salud AI067979 to1 a NWA.
YK es beneficiario de beca de pregrado de la Howard Hughes Medical Instituto/Universidad de Maryland College Park.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Placa de cultivo celular de 6 pocillosCellstar657160
AdeninaAcros OrganicsAC147440250
Puntas de pipeta de barrera contra aerosoles (100-1000 μ L)Fisherbrand02-707-404
Puntas de pipeta de barrera de aerosol (20-200 μ L)Fisherbrand02-707-430
Puntas de pipeta de barrera de aerosol (2-20 μ l)Fisherbrand02-707-432
Bard-Parker Cuchilla quirúrgica de acero al carbono con respaldo acanalado # 10Aspen Surgical371110
BD Luer-Lok Punta 10 mL JeringaBecton Dickinson (BD)309604
BD Aguja Precisionglide, 25G Becton Dickinson (BD)305124
Plato de cultivo celular 35 mm x 10 mmCellstar627 160
Matraz de cultivo celularCellstar660175
Cubrevases: círculos de 12 mmFisherbrand12-545-80
DAPI (4',6-Diamidino-2-Fenilindol, Dihidroclorhidrato)InvitrogenD1306
D-BiotinaJ.T. BakerC272-00
EDTASigma AldrichEDS
Alcohol etílico 200 gradosPharmco-AAPER111000200
Falcon 100 mm x 15 mm poliestireno tratado sin TC Placa de PetriCorning351029
Suero fetal bovinoSeradigm1500-500
Ficoll400Sigma AldrichF8016
Microscopio de fluorescenciaNikonE200
Cabra anti-ratón IgG Texas rojoInvitrogenT-862
Cabra anti-conejo IgG AlexaFluor488InvitrogenA-11034
HeminTokyo Chemical Industry Co. LtdH0008
HEPES (1M)Gibco15630-080
Isoton II DiluyenteBeckman Coulter
L-glutaminaGemini400-106
Medio 199 (10X)Gibco11825-015
Na piruvato (100 mM)Gibco11360-070
ParaformaldehídoAlfa Aesar43368
Penicilina/EstreptomicinaGemini400-109
Solución salina tamponada con fosfato (-/-)ThermoFisher14200166
Tubos de centrífuga cónicos de polipropilena 15 mLCellstar188 271
Tubos de centrífuga cónicos de polipropileno 50 mLCellstar227 261
Reactivo antidecoloración ProLong GoldThermoFisherP36930
Anticuerpo anti-ratón Rat Lamp-1Estudios del desarrollo Banco de hibridomas1D4B
M-CSF humano recombinantePeproTech300-25
Reichert Bright-Line  Hemocitómetro Hausser Scientific1492
RPMI Medium 1640 (1X)Gibco11875-093
Triton X-100 SurfactanteMillipore SigmaTX1568-1
Trypan BlueSigma AldrichT8154
Tijeras Delicadas, 4 1/2"VWR82027-582
Pinzas de Disección, Punta FinaVWR82027-386
Portaobjetos de microscopioVWR16004-368
Z1 Coulter Contador de partículas, doble umbralBeckman Coulter6605699
8546719

Referencias

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