Aquí se describe un método para generar culturas esferoide tridimensional de células epiteliales nasales humanas. Esferoides son estimulados luego a unidad de regulador de conductancia transmembrana de la Fibrosis Quística (CFTR)-ion dependiente y secreción flúida, cuantificar el cambio en el tamaño luminal esferoide como un proxy para la función CFTR.
Se requiere una suscripción a JoVE para ver este contenido. Inicie sesión o comience su prueba gratuita.
Artículo de método
Generación de células epiteliales nasales humanas esferoides para estudio de regulador de conductancia de la transmembrana individualizada la Fibrosis quística
En este artículo
Resumen
Resumen
Mientras que la introducción del regulador de conductancia transmembrana (CFTR) Fibrosis Quística modulador medicamentos ha revolucionado el cuidado en la Fibrosis Quística (FQ), el modelo de la terapia dirigida de genotipo actualmente en uso tiene varias limitaciones. Grupos de primera, raras o escasamente mutación están excluidos de ensayos clínicos definitivos. Por otra parte, como drogas modulador podrá entran en el mercado, será difícil optimizar las opciones de modulador para un tema individual. Ambos problemas se tratan con el uso de sistemas modelo preclínico derivados del paciente, individualizado de la función CFTR y modulación. Las células epiteliales nasales humanas (HNEs) son una fuente accesible de tejido respiratorio de este modelo. Adjunto, describimos a la generación de un modelo esferoide tridimensional de la función CFTR y modulación usando HNEs primarias. HNEs están aislados de los sujetos de manera mínimamente invasiva, ampliado en condiciones de reprogramación condicionales y sembrado en la cultura del esferoide. Dentro de 2 semanas de la siembra, las culturas esferoide generan esferoides HNE que pueden ser estimulados con 3', 5'-cíclico del monofosfato de adenosina (cAMP)-generación de agonistas para activar la función CFTR. Hinchazón del esferoide se cuantifica entonces como un proxy de la actividad CFTR. Esferoides HNE capitalizan el origen mínimamente invasivo, sin embargo, respiratorio de las células nasales para generar un modelo accesible, personalizado correspondiente a un epitelio que refleja la mortalidad y la morbilidad de la enfermedad. En comparación con las culturas de gran interfaz aire-líquido, esferoides son relativamente rápidos a madurar, que reduce la tasa de contaminación. En su forma actual, el modelo es limitado por bajo rendimiento, aunque esto es compensado por la relativa facilidad de adquisición de tejido. Esferoides HNE pueden utilizarse confiablemente cuantificar y caracterizar la actividad CFTR a nivel individual. Un estudio en curso hacer esta cuantificación en vivo respuesta fármaco determinará si esferoides HNE son un verdadero predictor preclínico de respuesta del paciente a la modulación de la CFTR.
Introducción
Fibrosis Quística (FQ) es una enfermedad recesiva fatal, de un autosoma que afecta a más de 70.000 personas en todo el mundo1. Esta enfermedad genética del vida-acortamiento es causada por mutaciones en la conductancia transmembrana de la Fibrosis Quística regulador de la proteína (CFTR)2. CFTR es miembro de la familia de cassette de unión a trifosfato de adenosina y funciones como un canal iónico que permite el movimiento de cloruro y bicarbonato a través de las membranas apicales del epitelio polarizado múltiples incluyendo el tracto gastrointestinal, glándulas sudoríparas, y respiratoria del árbol, entre otros
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Protocolo
Muestras de gran fueron procuradas de los sujetos reclutados a través Hospital Centro médico CF centro de los niños de Cincinnati de investigación. Todos los métodos aquí descritos han sido aprobados por la Junta de revisión institucional (IRB) del centro médico del Hospital infantil de Cincinnati. Se obtuvo consentimiento por escrito de todos los temas antes de la prueba.
1. preparar la expansión y antibióticos
- Se reúnen componentes de los medios enumerados en la tabla 1. Materiales congelados a temperatura de descongelar y hacen necesarias soluciones como se indica en la tabla 1 bajo "Medios de ....
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Resultados
HNEs deben conectar a la placa de cultivo y forman pequeñas islas de células dentro de las 72 h de la siembra; ejemplos de formación de la isla buena y mala a la semana se muestran en la figura 1A y 1B, respectivamente. Estas islas deben ampliar para cubrir el plato en el transcurso de 15-30 días. Muestras pequeñas o subóptimas pueden tomar más tiempo y a menudo no dan útiles esferoides. Contaminación con agentes infecciosos se demuestra por .......
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Discusión
Este protocolo describe la generación de culturas de células nasales paciente esferoide capaces de producir un modelo individualizado, específico de la función CFTR. Hay varios pasos claves en el proceso que debe ser atendido cerca para evitar la dificultad. En primer lugar es una adquisición de buena muestra de la nariz del paciente. Una buena muestra debe tener > 50.000 células, limitada moco/escombros y estar listo para el procesamiento dentro de 4 h (aunque el éxito también es fácilmente alcanzable con envío en hielo.......
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Este trabajo fue financiado por la Fundación Fibrosis quística, número CLANCY14XX0 y a través de la Fundación de Fibrosis quística, número CLANCY15R0 de la concesión. Los autores desean agradecer a Kristina Ray por su asistencia en el reclutamiento de pacientes y supervisión reguladora. Los autores también desean agradecer al grupo de trabajo de gran apoyado de la Fundación de Fibrosis quística, que ayudó en la generación de capacidades de gran cultura: Preston Bratcher, Calvin Cotton, Martina Gentzsch, Elizabeth Joseloff, Michael Myerburg, Dave Nichols, Scott Randell, Steve Rowe, g. Salomón Marty y Katherine Tuggle.
....Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Tubo Eppendorf de 1,5 mL | EE. UU. Scientific | 4036-3204 | |
| Matraz de filtro de 150 mL | Midsci | TP99150 | Para filtrar los medios |
| 15 mL Tubo cónico | Midsci | ||
| matraz filtrante de 1 L | Midsci | TP99950 | Para filtrar Medios |
| 35 mm Plato con fondo de vidrio | MatTek Corporation | P35G-0-20-C | Opcional |
| 3-isobutil-1-metilxantina (IBMX) | Fisher Scientific | AC228420010 | Prepare una solución madre de 100 mM de 22,0 mg en 1 mL de DMSO |
| 50 mL Tubo Cónico | Midsci | ||
| Accutase | Innovative Cell Technologies, Inc. | AT-104 | Solución de desprendimiento de células |
| Adenina | Sigma-Aldrich | A2786-25G | Ver Tabla 1 |
| Anfotericina B | Sigma-Aldrich | A9528-100MG | Ver Tabla 1 |
| Extracto de Cerebro Bovino (9mg/mL) | Lonza | CC-4098 | Ver Tabla 2 |
| Hidrato de Ceftazidima | Sigma-Aldrich | C3809-1G | Ver Tabla 1 |
| Raspadores de Celdas 20 cm | Midsci | ||
| CFTR Inh172 | Tocris Bioscience | 3430 | Prepare una solución madre de 10 mM de 4,0 mg en 1 mL de DMSO |
| Toxina B del cólera (de Vibrio cholerae) | Sigma-Aldrich | C8052-.5MG | Ver Tabla 1 |
| CYB-1 | Medical Packaging Corporation | CYB-1 | Cepillo de citología |
| Dimetilsulfóxido (DMSO) | Sigma-Aldrich | D5879-500ML | |
| Medios de águila modificados de Dulbecco (DMEM)/F12 Hepes | Tecnologías de la Vida | 11330-057 | Base Media; Ver Tablas 1 y 2 |
| Factor de Crecimiento Epidérmico (Proteína Humana Recombinante, Libre de Origen Animal) | Thermo Fisher Scientific | PHG6045 | Ver Tabla 1 |
| Epinefrina | Sigma-Aldrich | E4250-1G | Ver Tabla 2 |
| Etanol Fisher Scientific | 2701 | ||
| Etanolamina | Sigma-Aldrich | E0135-500ML | solución de 16,6 mM; Ver Tabla 2 |
| Ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) | TCI America | E0084 | |
| Suero fetal bovino (FBS de alto rendimiento) | Invitrogen | 10082147 | Ver Tabla 1 |
| Forskolin | Sigma-Aldrich | F6886-50 | Prepare una solución madre de 10 mM de 4,1 mg en 1 mL de |
| DMSO Factor de Crecimiento Reducido Matrigel | Corning, Inc. | 356231 | Matriz de membrana basal reducida con factor de crecimiento (GFR) de Corning Matrigel Growth Factor, sin rojo fenol, sin LDEV, 10 mL. |
| Hemacitómetro | Hausser Scientific | 1483 | |
| Solución de Colágeno Humano, Tipo I (VitroCol; 3 mg/mL) | Advanced BioMatrix | 5007-A | Solución de Colágeno |
| HyClone (también conocido como FetalClone II) | GE Cuidado de la salud | SH30066.03HI | Ver Tabla 2 |
| Hidrocortisona | StemCell Technologies | 07904 | Ver Tablas 1 y 2 |
| Insulina, recombinante humana, solución de zinc | Life Technologies | 12585014 | solución de 4 mg/mL; ver Tabla 2 |
| Placa de FIV de 4 pocillos, NUNC no tratada | (vía Fisher Scientific) | 12566350 | Placa de 4 pocillos para esferoides; tamaño de pocillo similar a una placa de 24 pocillos |
| MEF-CF1-IRR | Globalstem | GSC-6001G | Fibroblastos embrionarios murinos irradiados |
| Metamorph 7.7 | Dispositivos | molecularesSoftware de análisis; https://www.moleculardevices.com/systems/metamorph-research-imaging/metamorph-microscopy-automation-and-image-analysis-software para obtener un presupuesto | |
| Microscopio invertido Olympus IX51 | Olympus Corporation | Microscopio de imágenes descontinuado | . Sustitución: Olympus IX53, https://www.olympus-lifescience.com/pt/microscopes/inverted/ix53/ para una cotización |
| Pen Strep | Life Technologies | 15140122 | Ver Tabla 2 |
| Fsoforileteanolamina | Sigma-Aldrich | P0503-5G | Ver Tabla 2 |
| Ácido retinoico | Sigma-Aldrich | R2625-50MG | Ver Tabla 2 |
| Rhinoprobe | Arlington Scientific, Inc. | 96-0905 | Cureta nasal |
| Slidebook 5.5 | 3i, Intelligent Imaging Innovations | Software de imagen descontinuado | . Reemplazo: Libro de diapositivas 6, https://www.intelligent-imaging.com/slidebook para obtener un presupuesto |
| Solución salina tamponada con fosfato estéril (PBS) | Thermo Fisher Scientific 20012050 | ||
| Agua estéril | Sigma-Aldrich | W3500-6X500ML | |
| Plato de cultivo de tejidos 100 | Productos de tecno plástico | 93100 | Plato de cultivo de tejidos para expansión |
| Tobramicina | Sigma-Aldrich | T4014-100MG | Ver Tabla 1 |
| Transferrina (Transferrina Humana 0.5 mL) | Lonza | CC-4205 | Ver Tabla 2 |
| Triyodotrionina | Sigma-Aldrich | T6397-1G | 3,3′,5-Triyodo-L-tironina sal de sodio [T3]; Ver Tabla 2 |
| Tripsina del páncreas porcino | Sigma-Aldrich | T4799-10G | |
| Ultroser-G | Crescent Chemical (vía Fisher Scientific) | NC0393024 | 20 mL de polvo lipofiliado; Ver Tabla 2 |
| Clorhidrato de vancomicina de Streptomyces orientalis | Sigma-Aldrich | V2002-5G | Ver Tabla 1 |
| VX770 | Selleck Chemicals | S1144 | Prepare una solución madre de 1 mM de 0,4 mg en 1 mL de DMSO |
| VX809 | Selleck Chemicals | S1565 | Compre o prepare una solución madre de 10 mM de 4.5 mg en 1 mL de DMSO |
| Y-27632 Dihidroclorhidrato Inhibidor de ROCK | Enzo Ciencias de la Vida | ALX-270-333-M025 | Ver Tabla 1 |
Referencias
- Rowe, S. M., Miller, S., Sorscher, E. J. Cystic fibrosis. N Engl J Med. 352 (19), 1992-2001 (2005).
- Rommens, J. M., et al. Identification of the cystic fibrosis gene: chromosome walking and jumping. Science. 245 (4922), 1059-1065 (1989).
- Anderson, M. P., et al.
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Reimpresiones y permisos
Explorar más artículos
Células epiteliales nasales humanasestudio de la función de CFTRgeneración de cultivos de esferoidescondiciones de reprogramación condicionalagonistas generadores de cAMPensayo de hinchamiento de esferoidesincubación en medio de diferenciaciónmatriz de membrana basalevaluación mediante microscopio invertidoprueba de moduladores de CFTR
