Artículo de método

Un ecdisona basada en Receptor Singular gen interruptor para deliberada expresión del transgén con robustez, reversibilidad y filtración insignificante

DOI:

10.3791/57494

⸱

7 de mayo de 2018

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1Department of Biological Sciences, College of Bioscience and Biotechnology, Chungnam National University, 2Department of Pharmacology, College of Medicine, Chungnam National University, 3Department of Nursing, Gwangju Women's University

* These authors contributed equally

En este artículo

Resumen

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Aquí, presentamos un protocolo para la modulación de la expresión transgénica mediante interruptor gen singular de pEUI(+) tratamiento de tebufenozide.

Resumen

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Control preciso de la expresión del transgén es deseable en estudios biológicos y clínicos. Sin embargo, debido a la función binaria de interruptores Gen actualmente empleada requiere a la transferencia de dos unidades de expresión terapéutica al mismo tiempo en una sola celda, la aplicación práctica del sistema de terapia génica es limitada. Para simplificar el sistema de expresión del transgen, hemos generado un interruptor gen designado como pEUI(+) que abarca un conjunto completo de módulos de expresión del transgen en un solo vector. Que comprende el dominio de unión al ADN de GAL4 y modificado EcR (GvEcR), un mínimo dominio de activación VP16 fusionado con un dominio de unión al ADN de GAL4, así como un receptor de ecdisona Drosophila modificado (EcR), el interruptor nuevo gene singular es altamente respuesta a la administración de un inductor químico en una forma dependiente de dosis y tiempo. El vector de pEUI(+) es una herramienta potencialmente poderosa para mejorar el control de la expresión del transgen en investigación biológica y estudios pre-clínicos. Aquí, presentamos un protocolo detallado para la modulación de una expresión transitoria y estable del transgén pEUI(+) vector mediante el tratamiento de tebufenozide (Teb). Además, compartimos importantes directrices para el uso de Teb como un inductor químico.

Introducción

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Varios genes diferentes interruptores han sido explorados por su capacidad para regular precisamente expresión de transgenes en los cultivos celulares y modelos animales, con diversos grados de éxito1,2,3. Sistemas de interruptor de genes potenciales deben cumplir varios criterios estrictos, incluyendo: precisa expresión direccional del transgen, capacidad de respuesta de dosis y tiempo dependiente inductores, insignificante filtración del promotor, reversibilidad del transgén activación a través de la eliminación del inductor, inductor de la toxicidad niveles y tolerable para líneas celulares y animales de laboratorio1,2,3. Han explotado varios inductores de molécula pequeña, como tetraciclina4,5, rapamicina6,7,8, mifepristona9,10, y ecdisona11,12,13,14. En general, estos sistemas requieren al menos dos plásmidos que contienen dos o tres unidades de expresión discreta, uno o dos de los cuales componen un elemento regulador (plásmido inductor) que se une un inductor de molécula pequeña para obtener actividad transcripcional; y otro plásmido (plásmido efectoras) que contiene el transgén bajo el control de una región reguladora de ADN que permite el acceso del elemento inductor-limite reglamentario. El principal inconveniente del sistema binario es que requiere la introducción concomitante de dos vectores (inductor y efectoras) en la célula diana. En experimentos de expresión transitoria del transgén, la transfección simultánea de dos plásmidos inevitablemente produce una población de células individualmente transfectadas con el inductor o generador de efectos, o co transfected desigual. Además, el sistema binario requiere al menos dos rondas de selección antibiótica para establecer líneas celulares estables, que es lento y laborioso. Así, combinando todos los componentes necesarios para la expresión del transgen y regulación en un único vector sería lo ideal para garantizar la expresión concomitante de todos los elementos necesarios en una sola célula y permiten la regulación de la expresión del transgén mediante el tratamiento con inductores de molécula pequeña.

Para superar las deficiencias de los interruptores binarios gen, recientemente desarrollamos un interruptor gen singular, utilizando a Drosophila melanogaster de sistema inducible gene basadas en REC. p.15. Ecdisona media expresión génica cuando se une al heterodímero REC/ultraspiracle (USP), que a su vez induce la Unión de la EcR a ADN elementos reguladores3,11. El receptor de vertebrados retinoide X (RXR), un ortólogo de insecto USP, recluta a REC para formar un activador transcripcional activa16. Así, para la expresión específica de un transgén en las células de vertebrados o tejido, el EcR y RXR deben ser co expresado simultáneamente antes de ser estimulado por la ecdisona o sus agonistas. Puesto que la característica heterodiméricos del interruptor gen REC-basado puede ser influenciada por el endógeno RXR nivel, Padidam et al. reemplazado los dominios Rec. p. ADN y activación con heteróloga GAL4 DNA-que atan, Vmw65 del proteína del virus del herpes simple (VP16) dominios de activación fusionada en el dominio ligand-obligatorio de EcR, que luego se convirtió en insensible a RXR endógeno y formados de un homodímero para obtener actividad transcripcional17. El interruptor de genes basados en EcR fue mejorado mediante la construcción de una proteína quimérica de un mínimo dominio de activación VP16 combinado con GvEcR, que forma un homodímero y localizada en el citosol en ausencia de los agonistas de la ecdisona, Teb16, 18. Atando a Teb, la GvEcR cambió su localización subcelular desde el citosol al núcleo para reconocer un promotor híbrido de pez cebra E1b promotor mínimo combinado con un tándem diez repite secuencias de activación ascendente (UASs) para iniciar la transcripción del gen objetivo16.

Para simplificar el gen previamente divulgado basados en EcR interruptores16,18, combinamos las características binarias del sistema en un solo vector equipado con todos los elementos necesarios para la expresión de transgenes estimulante y luego designado el vector recién generado, pEUI(+) (número de GenBank: KP123436, figura 1A)15. El efector respondiendo al conductor GvEcR (en adelante el conductor) está formada por diez tándem UAS repite junto a un promotor mínimo de E1b, seguido por un sitio múltiple de clonado (MCS) con EcoRI PmlI, NheI, Piling, AfeI y AflII secuencias de reconocimiento (figura 1B). Además facilitar la selección de transfected las células, un puromicina impulsado por el promotor SV40 N-acetil-gen de la transferasa (PAC) se colocó entre las regiones controlador y generador de efectos para mantener líneas de células estables (figura 1).

Se describe un protocolo detallado para la modulación transitoria y estable de la expresión del transgen mediante pEUI(+). Además, proporcionamos instrucciones detalladas para el uso exitoso de Teb como un agonista de la ecdisona.

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Protocolo

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1. transgén Subcloning

  1. Elija un sitio de reconocimiento de la enzima de restricción apropiada (o sitios) en el MCS de pEUI(+) y subclone el gen de interés en la dirección deseada (figura 1).
    Nota: La EGFP o bandera del epítopo tagged ankyrin repite dominio 13A transgén (ANKRD13A) fue subcloned en el sitio de EcoRI del vector pEUI(+) con polimerasa de la DNA de T4 en una secuencia de ligadura independientes y clonación método19.
  2. Alinear el pEUI(+) con EcoRI para 1 h a 37 ° C. Mezcle 50 ng/μl de lineal pEUI(+) con 40 ng/μl de PCR amplificado EGFP o ANKRD13A y reaccionan con polimerasa de la DNA de T4 (1 U) durante 1 min a temperatura ambiente (RT) antes de la incubación en hielo durante 10 minutos agregar 10 μl de la mezcla de reacción directamente a 100 μl de DH10B células competentes para la transformación siguiente experimentan.
    Nota: Aunque varios sitios de reconocimiento de enzimas de restricción fueron agregados a los MCS de pEUI(+) (figura 1B), le recomendamos subcloning el gene de la blanco en el sitio de EcoRI, independiente de la ligadura clonación tecnología19,20.
  3. Verificar la inserción por la secuencia y luego purificar el ADN utilizando un kit de purificación de DNA que es conveniente para la transfección.

2. transitorios de la transfección y Teb tratamiento

  1. Preparar cuatro platos de la cultura celular (60 mm de diámetro) que contienen los recién HEK293 las células en 5 mL de medio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) suplidas con 5-10% suero bovino fetal (FBS) y antibióticos (100 U/mL de penicilina, estreptomicina 100 de μg/mL). En adelante, el "medio de cultivo celular" o "medio de cultivo" representa el DMEM suplementado con SBF y antibióticos. Mantener las células HEK293 a 37 ° C.
  2. Transfectar 1 μg de DNA purificado en las células HEK293 a densidad de 50-60% con 3 μl de reactivo de transfección. Añadir el reactivo de transfección a 200 μL de diluyente (DMEM sin FBS y antibióticos) que contiene el ADN. Después de la incubación de la mezcla de reacción durante 30 minutos a temperatura ambiente, agregar la mezcla a las células HEK-293 en el plato de cultura. Dos platos para transfección y dejar los otros dos no se tratan como controles.
  3. Después de 12-24 h de la transfección, agregue Teb (concentraciones finales, 0.2 - 10 μmol) a una de las muestras transfected y uno de los controles no transfectadas. Deje las otras dos muestras que no se tratan como controles experimentales.
    Nota: Se puede diluir la solución madre de Teb (50 mM disuelto en dimetil sulfóxido) en medio de cultivo celular, DMEM o solución salina con tampón fosfato (PBS) en una concentración adecuada antes de agregar a las células cultivadas según los parámetros experimentales. Sin embargo, debido a la baja solubilidad del Teb en solución acuosa, evitar la preparación de una mezcla de maestro con una alta concentración de Teb en medio; en su lugar, sustituir el medio de cultivo de célula completa con medio fresco que contiene Teb a la concentración deseada.
  4. Cultivar las células Teb-tratadas y no tratadas durante 12-48 h a 37 ° C.
  5. Si se usa la EGFP Inserte, analizar la expresión de EGFP bajo un microscopio de fluorescencia ( figura 2). De lo contrario, la cosecha las células para un ensayo de inmunotransferencia.
    1. Para el análisis de immunoblotting, enjuague las células dos veces con PBS helado y luego los raspar hacia fuera usando un raspador celular.
    2. Para las células de la viruta, desactivación de las cosechas en un tubo cónico de 15 mL a 21.000 x g durante 2 min a 18-25 ° C (RT).
    3. Después de descartar el PBS completamente, Añadir 0,5 mL del reactivo de extracción de proteína mamífera helada (M-por), junto con inhibidor de la proteasa (5 μl de 100 x inhibidor de la proteasa cóctel), a la pelotilla si las células se cultivan en un plato de 60 mm.
    4. Resuspender las células con varias rondas de pipeteo y luego incubar las células suspendidas durante 15 min a 18-25 ° C (RT).
    5. Girar la celda lisada a 21.000 x g por 10 min a 4 ° C.
    6. Transferir el sobrenadante acuoso en un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL fresco.
    7. Analizar el sobrenadante por immunoblotting, siguientes protocolos estándar con los anticuerpos adecuados.

3. generación de líneas de células HEK293 estable con integración genómica de la pEUI(+) Gene Switch

  1. Transfectar 5-10 μg de la pEUI(+) purificada con el transgén en las células HEK293 que son confluentes de 50-60% en una placa de cultivo celular del diámetro 90 mm, con 15-30 μl de reactivo de transfección. Añadir el reactivo de transfección a 500 μl del diluyente (DMEM sin FBS y antibióticos) que contiene el ADN. Después de la incubación de la mezcla de reacción durante 30 minutos a temperatura ambiente, agregar la mezcla a las células HEK-293 en el plato de cultura.
  2. Después de la transfección, deje los transfectants crecer y expresar los productos de gen de resistencia a puromicina en medio de cultivo no selectivo (sin puromicina) durante 24-48 h a 37 ° C.
  3. Disociar las células de los platos de la cultura por tripsinización. Después de descartar el medio de cultivo, enjuagar transfectants con PBS precalentado (37 ° C), agregar 1 mL de ácido de 0.25% tripsina/etilendiaminotetracético (EDTA) e Incube por 1 min a 37 ° C. Después de apagar el tripsina/EDTA agregando con medio de cultivo (10 mL, 37 ° C), cosechar las células usando un raspador celular, seguido por centrifugación en un tubo cónico de 15 mL a 21.000 x g durante 2 min a 18-25 ° C.
  4. Vuelva a suspender los transfectants en 50 mL de medio de cultivo precalentado (37 ° C) y 10 mL de las células de transferencia en platos de cultivo celular fresco 90 mm. La cultura de las células a 37 ° C hasta confluencia de 50-60% antes del tratamiento de puromicina (en general, esto toma aproximadamente 24-48 h).
  5. Cultivar los transfectants a 37 ° C en medio de cultivo celular complementado con 3 puromicina μg/mL durante 3-4 semanas. Durante el período de selección, cambiar el medio de cultivo celular que contenga puromicina (3 μg/mL) cada 2-3 días para mantener la presión de selección. Cuando las células se vuelven completamente confluentes, divididos los mismos procedimientos en pasos 3.3-3.4, con medio de cultivo que contiene la puromicina. Deseche las células restantes en el medio de cultivo, si no es necesario.
    Nota: Las condiciones de selección de puromicina deben establecerse experimentalmente para tipos específicos de la célula. Utilizamos 3 μg/mL de puromicina en el medio de cultivo celular; Esto fue suficiente para inducir la muerte celular en HEK293 transfectadas no.
  6. Cosechar las células de colonias individuales, utilizando un cilindro de clonación y siga las instrucciones del fabricante.
    1. Descartar el medio de cultivo celular. Lavar la placa dos veces con precalentado (37 ° C) PBS para eliminar las células flotantes.
    2. Utilizando pinzas estériles, coloque el cilindro de clonación sobre las colonias individuales.
    3. Añadir 0,2 mL de 0.35% tripsina/EDTA a cada cilindro.
    4. Incubar la placa a 37 ° C por 1 min hasta que las células son separadas y luego añadir unas gotas de medio de cultivo de precalentado (37 ° C) a los cilindros.
    5. Transferencia de las células de cada cilindro a pozos individuales de una placa de 6 pozos, con 2 mL de medio de cultivo y 1 μg/mL de puromicina en cada pozo.
      Nota: Cuando las células se vuelven confluentes, ampliar la cultura. Ahora se puede establecer clone(s).
  7. Mantener clones individuales en medio de cultivo celular 1 μg/ml de puromicina.
  8. Validar las colonias individuales por prueba de su sensibilidad al tratamiento Teb (concentración final, 10 μm) por 24 h. prueba de la capacidad de respuesta de los clones en el Teb analizando el nivel de expresión del transgen con el immunoblotting. Seleccione un deseado clon (o clones). Cultivar una Teb-tratados y una muestra sin tratar en medio de cultivo durante 12-48 h a 37 ° C antes de analizar el nivel de inducción del transgén. El nivel de expresión del transgen puede medirse mediante immunoblotting, siguiendo los procedimientos en pasos 2.5.1 - 2.5.7.

4. agotamiento de Teb

  1. Saciar los estímulos Teb sustituyendo Teb conteniendo medio de cultivo celular con medio libre de Teb.
    Nota: Se recomienda reemplazar los medios de crecimiento sin primera resiembra las células en un nuevo plato de cultura. Teb residual parece aferrarse al plato plástico y elicite una expresión sólida formación del transgén. Antes de volver a sembrar las células en una placa de cultivo nuevo, enjuagar las células cosechadas varias veces con medio de cultivo o PBS.
    1. Disociar las células de los platos de la cultura por tripsinización. Después de descartar el Teb conteniendo medio de cultivo, enjuagar el Teb-estimulado las células dos veces con PBS precalentado (37 ° C), agregar 1 mL de 0.25% tripsina/EDTA e incubar 1 minuto a 37 ° C. Después de apagar el tripsina/EDTA por agregar a precalentado Teb-libre medio de cultivo (10 mL, 37 ° C), cosechar las células usando un raspador celular, seguido por centrifugación en un tubo cónico de 15 mL a 21.000 x g durante 2 min a 18-25 ° C.
    2. Resuspenda las células en 50 mL de Teb-libre con medio de cultivo (37 ° C) y 5 mL de las células de transferencia en tres platos para cultivo celular fresco 60 mm. La cultura las células a 37 ° C durante 24, 48 y 72 h respectivamente.
    3. Las células en diferentes momentos de la cosecha y medir el nivel de expresión del transgen mediante el uso de immunoblotting.
      Nota: Bajo estas condiciones experimentales, la expresión del transgen se convirtió indetectable aproximadamente 3 días después la cultura de las células en el medio cultural libre de Teb (figura 3). El nivel de expresión del transgen puede medirse por immunoblotting, según pasos 2.5.1 - 2.5.7.

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Resultados

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El interruptor gen singular basado en el GvEcR se muestra en la figura 1A. El vector de pEUI(+) fue optimizado para la expresión del transgen regulados por el tratamiento con Teb. La región efectora de pEUI(+) consta de un 10xUAS y un promotor mínimo seguido de un MCS que contienen sitios de reconocimiento de enzimas de restricción EcoRI, PmlI, NheI, Piling, AfeI y AflII de E1b. Una señal de poly(A) de SV40 fue agregada detrás de MCS (fig...

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Discusión

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El principal inconveniente de la utilización de un interruptor de expresión del gen binario es la necesidad de ofrecer simultáneamente dos plásmidos separados (controlador y generador de efectos) en la célula diana. Esto puede conducir a una distribución desigual de plásmidos y resultar en una respuesta incoherente del interruptor para los inductores1,2,3. Otra deficiencia del sistema de dos vectores es que un mínimo de dos rond...

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Divulgaciones

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No tenemos conflictos de interés relacionados con este informe.

Agradecimientos

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Los autores agradecen S Y Choi (Universidad Nacional de Chonnam) valiosos comentarios y la lectura cuidadosa de nuestro manuscrito. Este trabajo fue financiado por un fondo de investigación de la Universidad Nacional de Chungnam.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
pEUI(+)TransLabLa licencia de la patente fue transferida a TransLab Inc. 
Reactivo de transfección Gene-FectTransLabTLC-001
HEK293ATCCCRL-1573
TebufenozideFluka31652
Cilindro de clonaciónSigmaCLS31668
PuromicinaCorning58-58-2
AntibióticosGibco15240-062
Tripsina-EDTAWelgeneLS015-01
DMEMWelgeneLM001-05
Suero fetal bovinoWelgeneS001-01
Placa de cultivo celularSPL ciencias de la vida11090
ratón FLAG M2SigmaF3165
anticuerpo anti-alfa tubulinaCalbiochemCP06
Cilindro de clonaciónSigmaCLS31668
NucleoBond Xtra MidiMacherey-Nagel740410.1
M-PER Reactivo de extracción de proteínas de mamíferos
Thermo Fisher78505
100X Inhibidor de la proteasa Cock. IIIT& IBPI-9200

Referencias

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