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Artículo de método

Microinyección de Western gusano de raíz del maíz, Diabrotica virgifera virgifera, embriones para transformación de línea germinal, o edición del genoma CRISPR/Cas9

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DOI:

10.3791/57497

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27 de abril de 2018

 ,  ,  ,  , 
1Department of Entomology and Plant Pathology, North Carolina State University

En este artículo

Resumen

Presentamos aquí protocolos de recogida y microinjecting maíz occidental precellular embriones de gusano de la raíz con el fin de realizar análisis funcional genómica como transformación del germline CRISPR Cas9-genoma de edición.

Resumen

El rootworm occidental del maíz (RGC) es una plaga importante del maíz y es bien conocido por su capacidad para adaptarse rápidamente a estrategias de manejo de plagas. Aunque el ARN de interferencia (ARNi) ha demostrado para ser una poderosa herramienta para estudiar la biología de la región del gran Caribe, tiene sus limitaciones. Específicamente, ARNi sí mismo es transitorio (es decir, no resulta en la herencia mendeliana a largo plazo del fenotipo asociado), y requiere conocer la secuencia de ADN del gen objetivo. Este último puede ser limitante si el fenotipo de interés está controlado por genes mal conservados, o incluso novela, porque sería difícil identificar objetivos útiles, si no imposible. Por lo tanto, debería ampliarse el número de herramientas de herramientas genómicas de RGC por el desarrollo de métodos que podrían utilizarse para crear cepas mutantes estables y activar encuestas independientes de la secuencia del genoma del RGC. En este documento, se detallan los métodos utilizados para recoger y microinject precellular embriones WCR con ácidos nucleicos. Mientras que los protocolos descritos tienen como objetivo la creación de transgénico WCR, CRISPR Cas9-genoma edición podría también realizarse utilizando los mismos protocolos, con la única diferencia es la composición de la solución inyectada en los embriones.

Introducción

Rootworm occidental del maíz (RGC), Diabrotica virgifera virgifera, es una plaga importante del maíz1. Curiosamente, WCR parece superar el control de las medidas más rápidamente que las plagas agrícolas más ya que ellos no sólo adaptan fisiológicamente sino también su comportamiento2,3,4,5, 6. en la última década, ARN de interferencia (RNAi), una poderosa herramienta genómica funcional, ha sido investigada como un posible método de control RCM7,8y también se ha utilizado como un medio para el estudio de la función del gen9. Sin embargo, mientras que el ARNi es realizada con frecuencia por microinyección de ARN bicatenario (dsRNA) en otras especies, ARNi basada en inyección es raro en RGC. De hecho, hay solamente algunos informes de RNAi vía microinyección de dsARN en RGC9. La razón es que RCM puede alcanzar niveles altos de gene precipitación a través de la ingestión de dsARN7,10, permitiendo incluso el estudio de efectos embrionarios de dsRNA de alimentación a la madre11. Mientras que este método hace WCR un excelente tema para análisis genómico funcional mediante RNAi, ha ralentizado el progreso en el desarrollo de metodologías para la microinyección embrionario en esta especie.

A pesar del poder de RNAi, existen algunas desventajas. Por ejemplo, no todos los genes responden igualmente a ARNi. Esta variabilidad puede hacer interpretación de los resultados de un análisis de genómica funcional más difícil. Además, ARNi es transitoria y no genera mutaciones heredables. Por otro lado, la transformación del germline, otra herramienta genómica funcional, puede generar mutaciones heredables mediante inserción de un elemento marcado transponibles en el genoma12,13. Esto hace del germline transformación una excelente herramienta para la creación de estirpes mutantes para el uso en los estudios genéticos a largo plazo. Transformación puede utilizarse también para rescatar una mutación mediante la entrega de una copia funcional del gen a un genoma mutante14. Por otra parte, la transformación del germline es la piedra angular de una gran variedad de técnicas de genética molecular. Además de noquear o rescatar la función del gene, transformación de la línea germinal puede utilizarse para potenciador captura15, gen captura16, Gal4-basado de la expresión ectópica17y genoma mutagénesis18.

Más recientemente, han desarrollado herramientas que permiten la edición del genoma sofisticado. Estas herramientas incluyen la transcripción Activator-Like efectoras nucleasas (jugadores) y el sistema CRISPR/Cas9-nucleasa19,20. La ventaja de estas nuevas herramientas es que ofrecen a los investigadores la capacidad para inducir una rotura de ADN de doble hebra en casi cualquier ubicación a casi cualquier genoma. Una vez inducida, estas roturas pueden repararse a través de ambos extremos no homóloga unirse a, que pueden introducir supresiones o inserciones en el gen específica, o reparación dirigida por homología, que en presencia de una construcción de ingeniería, puede catalizar la reemplazo de genes enteros o regiones genéticas21,22. Sin embargo, estos métodos requieren microinyección de DNA, RNA o proteínas en embriones muy jóvenes.

Lo importante, a diferencia de los dsARNs utilizados para RNAi, ácidos nucleicos y proteínas utilizadas para germline transformación y la edición del genoma no pueden fácilmente cruzar las membranas celulares. Por lo tanto, microinyección de ADN plásmido, mRNAs y proteínas debe ocurrir durante la etapa del blastoderm sincitial (es decir, antes de que el embrión insecto cellularizes). Esto hace que la sincronización de las inyecciones de un factor crítico. Por ejemplo, en Drosophila melanogaster, embriones deban ser inyectado dentro de dos horas después de huevo ponga12. Por lo tanto, el desarrollo de un protocolo exitoso microinjection embrionario para RGC debe tener en cuenta las mejores condiciones para la colocación del óvulo, así como el mejor método para la recolección de suficientes cantidades de embriones precellular.

Un esfuerzo para traer una amplia gama de herramientas genéticas moleculares en biología de la región del gran Caribe requiere desarrollar métodos para la recogida y microinjecting precellular embriones de RGC. Aquí proporcionamos instrucciones detalladas, junto con consejos y sugerencias, para ayudar a otros a utilizar técnicas basadas en la transformación en la investigación de la región del gran Caribe. Además de extender Tecnologías transgénicas a RGC para su uso en estudios de genómica funcional, estas técnicas también permiten potentes nuevas estrategias de control de plagas como gen unidad23,24 a probarse en esta importancia económica plaga.

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Protocolo

1. nivel de la colonia de cría de adultos de la región del gran Caribe

  1. Obtener una cantidad suficiente de los adultos de la región del gran Caribe (500-1.000) de un laboratorio de investigación o empresa confiable (véase Tabla de materiales por ejemplo) y colocar en una jaula de 30 cm3 .
    Nota: Se recomienda uso de una cepa no diapausa.
  2. Preparar la dieta artificial WCR siguiendo el protocolo del fabricante y vierta una 1 cm de espesor capa en un recipiente de 38 oz (véase Tabla de materiales). Después de mezclar, guarde dieta sin usar a 4 ° C hasta por 2 meses.
  3. Poner un plato de Petri (100 x 15 mm) con dieta adultos (10-15 g) en una jaula de 30 cm3 . Añadir más dieta cuando la comida sea baja o seca.
  4. Coloque un matraz (300 mL) con agua, cubierto con una bola de algodón, que se utiliza para mantener en su lugar un trozo de algodón (6 "x 3/8"), para servir como una fuente de agua. Cambie el agua cuando está baja.
  5. Mantener la región del gran Caribe a 26 ° C con una humedad de 60% y un 14:10 luz del ciclo de un insecto que se cría la incubadora.

2. alineación y la colección embrionaria

  1. Hacer una cámara de recogida del huevo utilizando agar al 1% en agua estéril de 100 x 15 mm2 caja de Petri. Almacenar a 4 ° C después de que el agar se solidifica.
  2. Para recoger los huevos recién puestos, coloque una sola capa de papel de filtro, seguido por 4 capas de Gasa (cada corte a tamaño) en la superficie del agar (figura 1A).
    Nota: Estopilla se puede reutilizar, después de ser lavado en lejía y esterilizado, pero no es necesario hacer esto para el primer uso. Papel de filtro no debe ser reutilizado y no necesita ser esterilizado.
  3. Coloque la placa de colección de huevo en jaula de la región del gran Caribe como tarde en el día como sea posible (final de la jornada de trabajo) y cubrir con una carpa de papel de estaño. Dejar durante la noche.
    Nota: Tener las luces encendidas de 10:00 a la ponedora de retrasos de 12 de la mañana (14 h), facilitando así la recolección de huevos más jóvenes para microinyección sin necesidad de personal de laboratorio colocar cámara de recogida en jaula por la noche.
  4. Retire la cámara de colección de huevo alrededor de 8 o 9:00
  5. Use pinzas para recoger 1 capa de estopilla en tiempo y lugar en un vaso de precipitados (500 mL) de agua. Lavar huevos de estopilla agitando suavemente (figura 1B y 1C).
  6. Use una pipeta de bulbo para transferir huevos otro vaso de precipitados (500 mL) de agua. Repetir 2-3 x para limpiar los huevos.
  7. Utilizar la pipeta de bulbo para transferir huevos en papel de filtro (figura 1) y reducir al mínimo la cantidad de remanente de agua.
  8. Cortar papel filtro negro tiras tan amplia como una diapositiva de cristal y cinta firmemente al portaobjetos para asegurarse de que el libro pone plana (figura 2A).
    Nota: Papel filtro negro ayuda a mejorar la visibilidad en el microscopio al reducir la cantidad de luz reflejada.
  9. Aplicar pegamento no tóxico (véase Tabla de materiales por ejemplo) para el papel de filtro en las líneas finas (figura 2B). Mantener las líneas de cola más delgada que el diámetro de un huevo para evitar que los huevos con pegamento.
  10. Utilizar un pincel fino para mover suavemente huevos WCR uno por uno desde su papel de filtro a la línea de pegamento. Trate de poner los huevos sobre el pegamento antes de se seca y mantener la distancia de por lo menos un huevo entre cada huevo.
  11. Maximizar la eficiencia de la inyección mediante la colocación de múltiples líneas de huevos en la diapositiva de un papel de filtro (figura 3).
  12. Después de todos los huevos se ponen hacia fuera en el papel de filtro, espere hasta que el pegamento se seque antes de microinyección.
    Nota: Para la transformación de la línea germinal y para la edición genómica CRISPR/Cas9-mediada, inyectar todos los embriones al mediodía (12:00) para que el embrión más viejo es viejo no más de 19 h. Sin embargo, para RNAi, hay ninguna limitación de tiempo porque en RGC, dsRNA puede moverse entre células. De hecho, para RNAi, embriones envejecimiento podrían resultar en mejores tasas de supervivencia.

3. preparación de plásmido DNAs y agujas de inyección

  1. Preparación de ADN plasmídico superenrollado de alta calidad mediante un comercial libre de endotoxina kit (véase Tabla de materiales por ejemplo).
  2. Para preparar la solución de la inyección, Compruebe la concentración de cada plásmido y luego combinar plásmido helper (concentración final de 250 ng/μL), plásmido donante (concentración final de 750 ng/μL) y buffer de rojo de fenol (concentración final de 20%). Mezclar la solución brevemente y centrifugar durante 3 minutos en velocidad máxima para precipitar partículas que podrían obstruir la aguja.
  3. Tire las agujas de vidrio borosilicato (O.D. 1 mm I.D. 0,58 mm, longitud 10 cm) usando un extractor de micropipeta tipo llamas/marrón. Para el almacenamiento, asegurar agujas tiradas sobre la cinta adhesiva de doble cara en una placa de Petri u otro recipiente transparente.
    Nota: Para el sistema de tirador de la micropipeta, los valores utilizados fueron: calor = 335, FIL = 4, VEL = 40, DEL = 200, PUL = 100.
  4. Relleno la aguja de inyección utilizando un cargador de micro punta (véase Tabla de materiales) de pipetear 0,5 - 1,0 μL abajo dentro de la aguja, cerca de la punta cónica. Elimine las burbujas de la punta de la aguja si se produce alguna.
  5. Inserte la aguja en el portaagujas.
  6. Abra la punta de la aguja rompiendo suavemente con un buen par de pinzas, o tocar/arrastrando suavemente la punta sobre el portaobjetos cubreobjetos o vidrio.
    Nota: La meta es que la abertura más pequeña que permite la mezcla de inyección volver a salir (las aberturas más pequeñas generalmente requieren mayor presión de inyección). Agujas biseladas no requieren este paso puesto que ya están abiertas.

4. microinyección y el cuidado después de la inyección

  1. Con un pincel fino, humedezca la superficie de 1-3 huevos con agua estéril con cuidado Inserte la aguja e inyectar la solución. Inyectar cada huevo antes de que se seque la superficie. Busque la aparición una pequeña cantidad de color rojo dentro de huevos durante la inyección para indicar que la exitosa microinyección. Aplastar o eliminar los huevos que parecen dañados, vacío, o de lo contrario no inyectar.
    Nota: Aunque la presión de la inyección varía dependiendo de tamaño de alesaje de la aguja, 10-13 psi es un buen punto de partida.
  2. Después se inyectan todos los huevos, quitar el papel de filtro de lo portaobjetos de vidrio.
  3. Coloque el papel de filtro sobre la superficie de un plato de agar al 1% (ver arriba).
  4. Use película de parafina plástico para sellar el plato y poner en un insecto de 26 ° C la incubadora de cría durante 12 días.
    Nota: La película de parafina le ayudará a evitar la contaminación del molde entre platos. Sin embargo, cualquier otro tratamiento para prevenir el crecimiento de bacterias y moho podría reducir la supervivencia de los embriones inyectados.

5. cultivo e incubación de embriones

  1. Iniciar control de embriones 12 días después de la inyección para las larvas recién nacidas y continuar diariamente durante 2 semanas.
  2. Transferencia de larvas, utilizando un pincel fino, a una caja de cría con germinado de maíz y el suelo.
    Nota: Molde podría crecer en el plato de agar, pero las larvas eclosionan aún en la mayoría de los casos. Busque larvas cuidadosamente en el molde para cogerlos todos. Algunas larvas pueden pasar a la tapa del plato y pueden atascarse en la condensación.
  3. Posterior de las larvas a 26 ° C siguiendo el estándar WCR cría métodos25.

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Resultados

Una consideración importante en el desarrollo de este protocolo fue la etapa del desarrollo embrionario en el momento de microinyección. Transformación del germline requiere específicamente, microinyección de ADN antes de la cellularization embrionaria. Esto es porque el ADN no puede cruzar fácilmente las membranas celulares. Para visualizar las etapas del desarrollo embrionario de la región del gran Caribe mediante una tinción nuclear las tentativas eran fracasadas porque dechorionation ...

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Discusión

Aunque microinyección de WCR con dsRNAs para RNAi ha reportado9, este es el primer protocolo para establecer las mejores prácticas para microinjecting precellular embriones de la región del gran Caribe, un proceso crítico para llevar a cabo la transformación del germline o CRISPR/Cas9 genoma de esta especie. Exitosa microinyección de embriones WCR es dependiente en muchos factores, como es la eficiencia de transformación. A continuación algunos de los principales problemas afectan el resultado de ...

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Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Este trabajo fue financiado por una beca del programa de investigación de Monsanto maíz Rootworm conocimiento, conceder fondos de puesta en marcha y número AG/1005 (para MDL y YC) a MDL de NCSU. FC fue apoyado por becas del programa de investigación de Monsanto maíz Rootworm conocimiento (AG/1005) y la National Science Foundation, grant número MCB-1244772 (para MDL). Los autores declaran a no hay intereses contrapuestos. FC y MDL concibieron y diseñado los experimentos; FC, PW y SP realizan los experimentos; MDL y analizaron los resultados; y FC, NG y MDL escribieron el manuscrito. Agradecemos a Teresa O'Leary, William Klobasa y Stephanie Gorski por su ayuda experto en investigación de la región del gran Caribe. También agradecemos a Dr. Wade French (USDA-ARS, Laboratorio Central de investigación agrícola del norte, Brookings, SD) para los envíos de huevos para establecer colonias de laboratorio y proporcionar protocolos de cría.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Papel de filtro cualitativo (negro)Ahlstrom8613-0900Para microinyección de huevos
1 oz Contenedores Vajilla de plástico Anny'sASET101contenedor de huevos
Drosophila Agar Tipo IIApex66-103Sustrato para plato de puesta de huevos WCR
Pinzas de peso pluma Bioquip4748Manejo de larvas y pupas 
Clorox Regular-Bleach1Clorox44600-30770Lavar el maíz y los platos
El favorito del camionero YellowCoor Farm Supply502Maíz para alimentación Sistema
microinyección WCR (Hecho en casa)NAPiezas e instrucciones disponibles a pedido Controlapresión de inyección (0-20 psi)
Elmer's Pegamento no tóxico Elmer's Products, Inc.E304Pegar huevos en papel de filtro
epTIPS Puntas de microcargadorEppendorfC2554691Relleno Aguja de carga Platos
cultivo de tejidos FalconFalcon 25383-103Maíz germinado /150 x 25 mm
Fisherbrand  Círculos de papel de filtro de grado cuantitativo FisherScientificS47576CHacer plato de agar para puesta de huevos/9cm
SparkleenFisher Scientific04-320-4Lavar platos
Portaobjetos de microscopio simpleFisher Scientific12-549-3Sujetar papel de filtro y huevos para microinyección
Gusano de la raíz del maíz occidental sin sustituto del polenCiencias Agrícolas de Frontera F9766BWCR Adulto
Dieta Artificial Bolas de Algodón,Grandes Genesee Scientific 51-101Cerrar el matraz
Globe Scientific 3.0 mL Pipetas de Transferencia de Bulbo PequeñoGlobe Scientific 137035Recolectar y transferir huevos
Leica M165 FC Microscopio estereoscópico de fluorescencia LeicaM165 FC Proyección de WCR
Juego de filtros DsRed para microscopio estereoscópico de fluorescenciaLeicaDSRFiltro de excitación: 510-560 nm, filtro de emisión: 590-650 nm
Filtro EGFPLeicaGFP2Filtro de excitación: 440– 520 nm, filtro de emisión: 510 nm
BugDormMegaView ScienceDP1000_5PJaula para colonia adulta
Pincel miniaturaMyArtscapeMAS-102-MINILiner 2/0 
Joystick MicromanipuladorNarishigeMN-151Micromanipulador y portaagujas
Microscopio XYStage Olympus265515Platina de microscopio (adaptado para su uso con estereoscopio)
Grado 90 EstopillaTienda Online de TelasCHEE90Para la puesta de huevos
Película de parafina de plástico Empaque de plástico PechineyPM-996Sellar la placa de agar después de la microinyección/Tamaño del rollo 4 pulgadas x 125 pies
Incubadora PercivalPercival I41VLH3C8Cámara de cultivo WCR (incubadora de cría de insectos)
Matraces Erlenmeyer de boca estrechaVWR4980-300-PKContenedor de agua para colonia de adultos 
Vasos de precipitados Griffin Low FormVWR1000-600-PKPara huevo batido
Rollos de algodón trenzadoRichmond Dental Cotton Co.605-3599Uso en el suministro de agua para colonias adultas 
Placas de Petri (35x10mm)SIGMACLS430588-500EAPara placas dietéticas
Phenol RedSigma143-78-8Tampón de microinyección
Extractor de micropipiette basado en láser InstrumentoSutter P-2000/G Tirador deaguja/Calor = 335, FIL = 4, VEL = 40, DEL = 200, PUL = 100
Capa superior de tierra superiorThe Scotts Company 71130758Suelo para el cultivo
de cronReloc Zippit 2 Mil Bolsas con CremalleraUnited States Plastic Corporation48342Bolsa Placa de agar después de la microinyección/5x7
Placas de Petri (100x15m)VWR89038-968Fabricación de placa de agar para puesta de huevos/ 100 x 15 mm
Contenedores de 6 ozWebstaurantstore128E506WCR cámara de acoplamiento de un solo par 
Contenedores de 38 ozWebstaurantstore128NC888Caja de cría de larvas/38 oz
ChoiceHD 16 oz. Contenedor de plástico translúcido para microondasWebstaurantstore128HRD16Caja de cría de larvas/16 oz
Alcance de microinyección Wild HeerbruggWILD-M8equipado con una etapa XY
Capilares de vidrio estándarPrecision Instruments1B100F-4Agujas de microinyección
Gusanos de la raíz del maíz occidental adulto Laboratorio deinvestigación aqricultural central del norteCepa sin diapasaSolicitud del laboratorio del Dr. Bryan Wade French
ADN plasmídico Midi KitQiagen12143Purificación de ADN plásmido listo para inyección
de la deEndoscopio de microinyección World

Referencias

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