Presentamos aquí protocolos de recogida y microinjecting maíz occidental precellular embriones de gusano de la raíz con el fin de realizar análisis funcional genómica como transformación del germline CRISPR Cas9-genoma de edición.
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Artículo de método
Microinyección de Western gusano de raíz del maíz, Diabrotica virgifera virgifera, embriones para transformación de línea germinal, o edición del genoma CRISPR/Cas9
En este artículo
Resumen
Resumen
El rootworm occidental del maíz (RGC) es una plaga importante del maíz y es bien conocido por su capacidad para adaptarse rápidamente a estrategias de manejo de plagas. Aunque el ARN de interferencia (ARNi) ha demostrado para ser una poderosa herramienta para estudiar la biología de la región del gran Caribe, tiene sus limitaciones. Específicamente, ARNi sí mismo es transitorio (es decir, no resulta en la herencia mendeliana a largo plazo del fenotipo asociado), y requiere conocer la secuencia de ADN del gen objetivo. Este último puede ser limitante si el fenotipo de interés está controlado por genes mal conservados, o incluso novela, porque sería difícil identificar objetivos útiles, si no imposible. Por lo tanto, debería ampliarse el número de herramientas de herramientas genómicas de RGC por el desarrollo de métodos que podrían utilizarse para crear cepas mutantes estables y activar encuestas independientes de la secuencia del genoma del RGC. En este documento, se detallan los métodos utilizados para recoger y microinject precellular embriones WCR con ácidos nucleicos. Mientras que los protocolos descritos tienen como objetivo la creación de transgénico WCR, CRISPR Cas9-genoma edición podría también realizarse utilizando los mismos protocolos, con la única diferencia es la composición de la solución inyectada en los embriones.
Introducción
Rootworm occidental del maíz (RGC), Diabrotica virgifera virgifera, es una plaga importante del maíz1. Curiosamente, WCR parece superar el control de las medidas más rápidamente que las plagas agrícolas más ya que ellos no sólo adaptan fisiológicamente sino también su comportamiento2,3,4,5, 6. en la última década, ARN de interferencia (RNAi), una poderosa herramienta genómica funcional, ha sido investigada como un posible método de control RCM7,....
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Protocolo
1. nivel de la colonia de cría de adultos de la región del gran Caribe
- Obtener una cantidad suficiente de los adultos de la región del gran Caribe (500-1.000) de un laboratorio de investigación o empresa confiable (véase Tabla de materiales por ejemplo) y colocar en una jaula de 30 cm3 .
Nota: Se recomienda uso de una cepa no diapausa. - Preparar la dieta artificial WCR siguiendo el protocolo del fabricante y vierta una 1 cm de espesor capa en un recipiente de 38 oz (véase Tabla de materiales). Después de mezclar, guarde dieta sin usar a 4 ° C hasta por 2 meses.
- Poner un plato de Petri (100 x ....
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Resultados
Una consideración importante en el desarrollo de este protocolo fue la etapa del desarrollo embrionario en el momento de microinyección. Transformación del germline requiere específicamente, microinyección de ADN antes de la cellularization embrionaria. Esto es porque el ADN no puede cruzar fácilmente las membranas celulares. Para visualizar las etapas del desarrollo embrionario de la región del gran Caribe mediante una tinción nuclear las tentativas eran fracasadas porque dechorionation .......
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Discusión
Aunque microinyección de WCR con dsRNAs para RNAi ha reportado9, este es el primer protocolo para establecer las mejores prácticas para microinjecting precellular embriones de la región del gran Caribe, un proceso crítico para llevar a cabo la transformación del germline o CRISPR/Cas9 genoma de esta especie. Exitosa microinyección de embriones WCR es dependiente en muchos factores, como es la eficiencia de transformación. A continuación algunos de los principales problemas afectan el resultado de .......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Este trabajo fue financiado por una beca del programa de investigación de Monsanto maíz Rootworm conocimiento, conceder fondos de puesta en marcha y número AG/1005 (para MDL y YC) a MDL de NCSU. FC fue apoyado por becas del programa de investigación de Monsanto maíz Rootworm conocimiento (AG/1005) y la National Science Foundation, grant número MCB-1244772 (para MDL). Los autores declaran a no hay intereses contrapuestos. FC y MDL concibieron y diseñado los experimentos; FC, PW y SP realizan los experimentos; MDL y analizaron los resultados; y FC, NG y MDL escribieron el manuscrito. Agradecemos a Teresa O'Leary, William Klobasa y Stephanie Gorski por su ayuda experto e....
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Papel de filtro cualitativo (negro) | Ahlstrom | 8613-0900 | Para microinyección de huevos |
| 1 oz Contenedores | Vajilla de plástico Anny's | ASET101 | contenedor de huevos |
| Drosophila Agar Tipo II | Apex | 66-103 | Sustrato para plato de puesta de huevos WCR |
| Pinzas de peso pluma | Bioquip | 4748 | Manejo de larvas y pupas |
| Clorox Regular-Bleach1 | Clorox | 44600-30770 | Lavar el maíz y los platos |
| El favorito del camionero Yellow | Coor Farm Supply | 502 | Maíz para alimentación Sistema |
| microinyección WCR (Hecho en casa) | NA | Piezas e instrucciones disponibles a pedido Controla | presión de inyección (0-20 psi) |
| Elmer's Pegamento no tóxico Elmer's Products | , Inc. | E304 | Pegar huevos en papel de filtro |
| epTIPS Puntas de microcargador | Eppendorf | C2554691 | Relleno Aguja de carga Platos |
| cultivo de tejidos Falcon | Falcon 25383-103 | Maíz germinado /150 x 25 mm | |
| Fisherbrand Círculos de papel de filtro de grado cuantitativo Fisher | Scientific | S47576C | Hacer plato de agar para puesta de huevos/9cm |
| Sparkleen | Fisher Scientific | 04-320-4 | Lavar platos |
| Portaobjetos de microscopio simple | Fisher Scientific | 12-549-3 | Sujetar papel de filtro y huevos para microinyección |
| Gusano de la raíz del maíz occidental sin sustituto del polen | Ciencias Agrícolas de Frontera | F9766B | WCR Adulto |
| Dieta Artificial Bolas de Algodón, | Grandes Genesee Scientific 51-101 | Cerrar el matraz | |
| Globe Scientific 3.0 mL Pipetas de Transferencia de Bulbo Pequeño | Globe Scientific 137035 | Recolectar y transferir huevos | |
| Leica M165 FC Microscopio estereoscópico de fluorescencia | Leica | M165 FC | Proyección de WCR |
| Juego de filtros DsRed para microscopio estereoscópico de fluorescencia | Leica | DSR | Filtro de excitación: 510-560 nm, filtro de emisión: 590-650 nm |
| Filtro EGFP | Leica | GFP2 | Filtro de excitación: 440– 520 nm, filtro de emisión: 510 nm |
| BugDorm | MegaView Science | DP1000_5P | Jaula para colonia adulta |
| Pincel miniatura | MyArtscape | MAS-102-MINI | Liner 2/0 |
| Joystick Micromanipulador | Narishige | MN-151 | Micromanipulador y portaagujas |
| Microscopio XY | Stage Olympus | 265515 | Platina de microscopio (adaptado para su uso con estereoscopio) |
| Grado 90 Estopilla | Tienda Online de Telas | CHEE90 | Para la puesta de huevos |
| Película de parafina de plástico | Empaque de plástico Pechiney | PM-996 | Sellar la placa de agar después de la microinyección/Tamaño del rollo 4 pulgadas x 125 pies |
| Incubadora Percival | Percival | I41VLH3C8 | Cámara de cultivo WCR (incubadora de cría de insectos) |
| Matraces Erlenmeyer de boca estrecha | VWR | 4980-300-PK | Contenedor de agua para colonia de adultos |
| Vasos de precipitados Griffin Low Form | VWR | 1000-600-PK | Para huevo batido |
| Rollos de algodón trenzado | Richmond Dental Cotton Co. | 605-3599 | Uso en el suministro de agua para colonias adultas |
| Placas de Petri (35x10mm) | SIGMA | CLS430588-500EA | Para placas dietéticas |
| Phenol Red | Sigma | 143-78-8 | Tampón de microinyección |
| Extractor de micropipiette basado en láser Instrumento | Sutter P-2000/G Tirador de | aguja/Calor = 335, FIL = 4, VEL = 40, DEL = 200, PUL = 100 | |
| Capa superior de tierra superior | The Scotts Company 71130758 | Suelo para el cultivo | |
| de cronReloc Zippit 2 Mil Bolsas con Cremallera | United States Plastic Corporation | 48342 | Bolsa Placa de agar después de la microinyección/5x7 |
| Placas de Petri (100x15m) | VWR | 89038-968 | Fabricación de placa de agar para puesta de huevos/ 100 x 15 mm |
| Contenedores de 6 oz | Webstaurantstore | 128E506 | WCR cámara de acoplamiento de un solo par |
| Contenedores de 38 oz | Webstaurantstore | 128NC888 | Caja de cría de larvas/38 oz |
| ChoiceHD 16 oz. Contenedor de plástico translúcido para microondas | Webstaurantstore | 128HRD16 | Caja de cría de larvas/16 oz |
| Alcance de microinyección | Wild Heerbrugg | WILD-M8 | equipado con una etapa XY |
| Capilares de vidrio estándar | Precision Instruments | 1B100F-4 | Agujas de microinyección |
| Gusanos de la raíz del maíz occidental adulto Laboratorio de | investigación aqricultural central del norte | Cepa sin diapasa | Solicitud del laboratorio del Dr. Bryan Wade French |
| ADN plasmídico Midi Kit | Qiagen | 12143 | Purificación de ADN plásmido listo para inyección |
Referencias
- Gray, M. E., Sappington, T. W., Miller, N. J., Moeser, J., Bohn, M. O. Adaptation and Invasiveness of Western Corn Rootworm: Intensifying Research on a Worsening Pest. Annual Review of Entomology. 54, 303-321 (2009).
- Gassmann, A. J., Petzold-Maxwell, J. L., Keweshan, R. S., Dunbar, M. W.
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Reimpresiones y permisos
