La Lambda seleccione cII sistema de detección de mutación

Summary

Se describe un protocolo detallado para el ensayo de mutación Lambda seleccione cII en cultivos de células de roedores transgénicos o los correspondientes animales tratados con un agente químico físico de interés. Este enfoque ha sido ampliamente utilizado para las pruebas de mutagenicidad de agentes carcinógenos en células de mamíferos.

Abstract

Un número de modelos animales transgénicos y sistemas de detección de mutación ha sido desarrollado para las pruebas de mutagenicidad de agentes carcinógenos en células de mamíferos. De estos ratones transgénicos y el Lambda (λ) Seleccione cII sistema de detección de mutación han sido utilizados para experimentos de mutagenesis por muchos grupos de investigación en todo el mundo. Aquí, describimos un protocolo detallado para el ensayo de mutación de cII en seleccionar Lambda, que se puede aplicar a cultivos de células de ratones/ratas transgénicas o los correspondientes animales tratados con un agente químico físico de interés. El protocolo consta de los siguientes pasos: (1) aislamiento de ADN genómico de las células o los órganos/tejidos de los animales transgénicos trataron en vitro o en vivo, respectivamente, con un compuesto de prueba; (2) recuperación del vector lanzadera lambda lleva un gen reportero mutacional (es decir, transgén cII ) de la DNA genómico; (3) envases de los vectores rescatados en bacteriófagos infecciosos; (4) que infecta a una bacteria huésped y cultivo selectivo condiciones para permitir la propagación de las mutaciones inducidas cII ; y (5) anotar la cII-mutantes y ADN la secuencia de análisis para determinar la frecuencia de mutantes cII y el espectro de la mutación, respectivamente.

Introduction

Una amplia gama de modelos de animales transgénicos y sistemas de detección de mutación se han desarrollado para las pruebas de mutagenicidad de agentes carcinógenos en células de mamíferos. De estos ratones transgénicos Big Blue (denominado en adelante BB) y λ Select cII sistema de detección de mutación han sido empleados para experimentos de mutagenesis por este grupo y muchos otros investigación grupos en todo el mundo^{1,2, 3,4,5,6,....}

Protocol

1. genómica ADN aislado de fibroblastos embrionarios de ratón

Nota: Los fibroblastos embrionarios de ratón primario son aislados de embriones derivados de ratones transgénicos de BB con fondo genético C57BL/6, según el protocolo publicado⁵³. El material de partida de este protocolo consiste en 1 x 10⁶ a 1 x 10⁷ células de fibroblasto embrionario tratadas con un test compuesto versus control. La recolección y recuento de estas células mediante métodos estándar se describen en referencias^10,54,55.<....

Results

Dependiendo de la distribución de los datos, se utilizan pruebas paramétricas o no paramétricas para determinar la significancia de la diferencia en la frecuencia de mutantes cII entre los grupos tratamiento y control (es decir, inducido versus frecuencias de mutante espontáneas) . Comparación de las frecuencias de mutante inducida por cII en los grupos de tratamiento diferentes es hecha por varios (pares) pruebas estadísticas, según sea el caso. La prueba hiper.......

Discussion

El ensayo Select cII λ se utiliza para la detección de mutaciones en el transgén de la cII de ADN genómico de células derivadas de órganos/tejidos de roedores de BB³. El genoma de estos animales transgénicos contiene múltiples copias de tándem del vector lanzadera λLIZ cromosómico integrado, que lleva la cII (294 bp) y lacI (1.080 bp) los transgenes, como el reportero mutacional de genes^{1, 2 ,}.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agar	MO Bio Laboratorios, Inc.	12112-05	Grado bacteriológico
BigDye Terminator v3.1 Kit de secuenciación de ciclos	Thermo Fisher Scientific	4337455	Ninguno
Caseína Peptona	Alfa Aesar	H26557	Ninguno
Gelatina	J. T. Baker	2124-01	Glicerol en polvo
	Fisher Scientific	BP 229-1 / M-13750	Ninguno
LB Agar	Fisher Scientific	BP 9724-500	Ninguno
QIAquick kit de purificación de PCR	Qiagen	8104	50 reacciones de purificación de PCR
Acetato de sodio Trihidrato	Fisher Scientific	M-15756	Ninguno
Taq5000 ADN polimerasa	Qiagen	201207	Ninguno
Clorhidrato de tiamina	Macron Fine Chemicals	2722-57	Ninguno
Transpack Packaging Extract	Stratagene Corp., adquirida por BioReliance | Sigma-Aldrich Corp.	200223	50 reacciones de envasado
Tris Base	Fisher Scientific	BP 152-1 / EC 201-064-4	Ninguna
Trypton	Biosciences	RC-110	Ninguna