Aquí, presentamos un protocolo para describir el aislamiento de las vesículas extracelulares (EVs) en medio de cultivo en vitro de adultos Schistosoma japonicum.
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Aquí, presentamos un protocolo para describir el aislamiento de las vesículas extracelulares (EVs) en medio de cultivo en vitro de adultos Schistosoma japonicum.
Las vesículas extracelulares (EVs) son vesículas membranosas por una variedad de células en el microambiente extracelular. EVs representan una población de vesículas heterogéneas, cuyo rango de tamaño entre 40 y 1.000 nm. Evidencia acumulada indica que EVs desempeñan importantes funciones reguladoras en las interacciones patógeno-host. Una profunda comprensión del schistosome EVs debe proporcionar penetraciones en los mecanismos subyacentes a las interacciones host esquistosoma, permitir el desarrollo de nuevas estrategias contra la esquistosomiasis. Aquí, nuestro objetivo es profundizar el estudio funciones de EVs en esquistosomas presentando un protocolo para el aislamiento y la caracterización de los vehículos eléctricos de adultos Schistosoma japonicum (S. japonicum). EVs se aislaron en vitro el medio de cultivo utilizando centrifugación combinada con un kit de aislamiento comercial exosomas. Los aislados de S. japonicum EVs (SjEVs) por lo general poseen un diámetro de 100-400 nm y se caracterizan por microscopía electrónica de transmisión y el borrar occidental. El uso de PKH67 SjEVs de marcado tinte ha demostrado que SjEVs es internalizados por las células del receptoras. En general, el protocolo proporciona un método alternativo para aislar EVs de esquistosomas adultos; el SjEVs aislado puede ser adecuado para el análisis funcional.
Las vesículas extracelulares (EVs) son una población de pequeñas vesículas de membrana-limita con varias proteínas, lípidos y ácidos nucleicos. Estudios recientes demostraron que EVs desempeñan un papel crucial en la comunicación de la célula y participan en la regulación de numerosos procesos fisiológicos, incluyendo el desarrollo de las células, regulación inmune, angiogénesis y migración de célula2, 3,4,5. La acumulación de pruebas indica que EVs, circulación de exosomas y su carga de miRNA representan potenciales biomarcadores de cierta....
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Todos los experimentos en animales fueron aprobados por el Comité de ética local de Shanghai Instituto de investigación veterinaria, Academia China de ciencias agrícolas (permiso número: SHVRIAU-14-0101).
1. in Vitro cultura de esquistosomas
Nota: Esquistosomas representan un riesgo biológico. Los trabajadores deben usar guantes de látex en todo momento cuando manejo de gusanos, schistosomal suspensiones u otras relacionadas con los materiales biológicos. Conejos de Nueva Zelandia infectaron con ~ 2.000 cercariae vía abdominal la exposición. Se recolectaron esqui....
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Para cuantificar el rendimiento de SjEVs aislados usando el protocolo descrito, se utilizan análisis de proteína BCA para acceder a la concentración de proteína de la SjEVs aislada de esquistosomas adultos de 28 días. Como se muestra en la tabla 1, la concentración de proteína de SjEV sido 208 μg 250 μg por 100 mL de medio (tabla 1). El tamaño de partícula, según lo determinado por análisis de nanopartículas de Malvern, indica que el aislado SjEVs varió d.......
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Estudios recientes sobre EVs han demostrado eso schistosome que EVS juegan un papel importante en huésped-patógeno interacciones3,9,12,16. Atender más sus funciones reguladoras es esencial aislar EVs de esquistosomas. Aquí, describimos un método alternativo para el aislamiento de SjEV. Este método produce un tamaño de amplia gama de SjEVs, de 100 nm a 400 nm, en adultos S. japonicum. E.......
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Los autores no tienen nada que revelar.
Este estudio fue, en parte o en conjunto, apoyados por la Fundación de Ciencias naturales nacionales de China (31472187 y 31672550) y la ciencia agrícola y tecnología programa de innovación de la Academia China de ciencias agrícolas.
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| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| fuerte | |||
| Reactivo de aislamiento total de exosomas (a partir de medios de cultivo celular) | ThermoFisher SCIENTIFIC | 4478359 | Para aislar vesículas extracelulares de S. japonicum |
| PKH67 | Sigma-aldrich | MINI67 | Para el etiquetado de Evs |
| RPMI 1640 Medium | ThermoFisher SCIENTIFIC | 11875119 | Para el cultivo de parásitos |
| Penicilina-estreptomicina | ThermoFisher SCIENTIFIC | 15140122 | |
| 0.22μ m filtro de jeringa | Merck | SLGP033RB | |
| SnakeSkin tubo de diálisis | Thermo SCIENTIFIC | 68035 | |
| PEG8000 | Sangon Biotech | A100159 | |
| RIPA | Beyotime | P0013B | |
| EMD Millipore™ Inmuebles&comercio; Sustrato HRP quimioluminiscente occidental (ECL) | Fisher scientific | WBKLS0100 | |
| Tecnología de señalización celular | DAPI | 4083 | |
| BCA kit | Beyotime | P0010 | |
| Anticuerpos CD63 | Sangon Biotech | D160973-0025 | |
| PVDF | Bio-Rad | 1704273 | |
| Formvar/Carbon 400 malla | Ted Pella | 01754-F | |
| Ácido fosfotúngstico | Ted Pella | 19402 | |
| anti-ratón IgG-HRP | CWBIO | CW0102 | |
| NCTC clon 1469 células | ATCC | ATCC® CCL-9.1 y comercio; | |
| FBS | HyClone | SV30087.02 | |
| Equipments | |||
| imagen de quimioluminiscancia | GE | ImageQuant LAS4000mini | |
| Microscopía electrónica de transmisión | Hitachi | H-7600 | |
| Milli-Q agua | Milli-Q Milli-Q | Elix | |
| Eppendor Centrífuga | Centrífuga Eppendorf | 5804R | |
| Zetasizer Nano | Malvern | Zetasizer Nano ZS | |
| Ultracentrífuga | Beckman | Optima L-100 XP Incubadora de ultracentrífugas | |
| ESCO | CCL-107B | ||
| Microscopio | Zeiss | Zeiss Axin Observer Z1 |
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