Aquí, presentamos un método para diseñar el genoma de C. elegans utilizando ribonucleoproteínas Cas9 CRISPR y plantillas de reparación dependiente de homología.
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Artículo de método
Un rápido y fácil tubería para generar genómica punto mutantes de C. elegans utilizando CRISPR/Cas9 ribonucleoproteínas
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En este artículo
Resumen
Resumen
Las repeticiones palindrómico intercaladas regularmente agrupadas (CRISPR) - CRISPR - asociaron proteína 9 (Cas9) sistema de defensa inmune adaptante procariotas ha sido cooptado como una poderosa herramienta para la ingeniería del genoma eucariota precisa. Aquí, presentamos un método rápido y sencillo usando RNAs quiméricos guía sola (sgRNA) y CRISPR Cas9 ribonucleoproteínas (RNPs) para la generación eficiente y precisa de genómicas mutaciones de punto en C. elegans. Describimos una tubería sgRNA selección de objetivos, diseño de plantilla de reparación dirigido por homología (HDR), secuestrantes de CRISPR Cas9 de RNP, entrega y una estrategia de genotipificación que permite la identificación rápida y robusta de animales correctamente editados. Nuestro enfoque no sólo permite el fácil generación y la identificación del punto deseado de genomic de animales mutantes, sino que también facilita la detección de otros alelos del complejo indel en aproximadamente 4-5 días con alta eficiencia y una proyección reducida carga de trabajo.
Introducción
Recientes avances tecnológicos han transformado radicalmente y acelera la capacidad de genomas de Ingeniero precisamente. En particular, el sistema CRISPR Cas9, que depende de la endonucleasa de RNA-dirigida Cas9 para inducir una rotura de doble cadena (DSB) cerca de la secuencia de destino de interés, se ha utilizado extensivamente para diseñar con precisión el genoma de la mayoría de organismos modelo utilizados en investigación biomédica1,2,3,4. Significativamente, el uso de CRISPR Cas9 ha desbloqueado la edición del genoma en especies di....
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Protocolo
Todos los procedimientos experimentales y cuidado de los animales siguieron la pauta de los institutos nacionales de salud y el cuidado Animal institucional y Comité uso (IACUC) en la Universidad de Michigan. Usar soluciones libres de RNasa y pipetear consejos en todo el protocolo. Limpie el área de trabajo, pipetas, tubos y centrifugar con solución de Rnasa descontaminación siguiendo las pautas del fabricante (ver Tabla de materiales).
1. sgRNA selección de objetivos
- Mediante un explorador web, abra la página web: http://crispor.tefor.net8
- Entrada ~ 60 pares de bases (PB) de secuen....
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Resultados
Mutaciones en humanos de la superóxido dismutasa 1 (SOD1) representan ~ 10-20% de la esclerosis de lateral amiotrófica, una enfermedad neurodegenerativa devastadora que invariablemente conduce a la parálisis y la muerte17. Humano SOD-1 es una proteína conservada evolutivamente compartir similitud de identidad y el 70% del 55% con la proteína SOD-1 de C. elegans (figura 1B). Para demostrar la simplicidad, viabilidad y .......
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Discusión
El sistema CRISPR Cas9 es una herramienta potente y eficaz para modificar precisamente el genoma de organismos modelo. Aquí, demostramos que eso quimérico sgRNAs20 junto con ssODN HDR plantillas permiten la generación altamente eficiente de genómicas mutaciones de punto en C. elegans. Importante aún, demostramos que entrega RNP produce alto rendimiento edición cuando la fluorescencia se utiliza como un marcador de selección Co, destacando la facilidad y la fiabilidad de la técnica.
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Divulgaciones
Agradecemos a los miembros del laboratorio Beg de lectura crítica de este manuscrito. Las cepas fueron proporcionadas por el centro de genética de Caenorhabditis , que es financiado por los NIH oficina de programas de infraestructura de investigación (P40 OD010440). Investigación en el laboratorio de Beg es apoyada por becas del NIH (R01 NS094678) y Asociación de la Distrofia Muscular (MDA382300) a A.A.B.
Agradecimientos
Hay no hay conflictos de intereses relacionados con este informe.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| CRISPRevolution sgRNA EZ Kit | Synthego Inc. | sgRNA quimérico | |
| libre de nucleasas TE | Synthego Inc. | provisto con el kit de sgRNA EZ kit | |
| Agua libre de nucleasas | Synthego Inc. | provisto con el kit de sgRNA EZ kit | |
| 4 nmole Ultramer DNA Oligo | Integrated DNA Technologies | ssODN plantilla HDR | |
| Alt-R S.p. HiFi Cas9 Nucleasa 3NLS | Integrated DNA Technologies | 1078728 | proteína Cas9 |
| pCFJ90 | Addgene | 19327 | Pmyo-2::mCherry Marcador Plásmido |
| KCl | Sigma | P5405 | |
| HEPES | Sigma | H4034 | |
| ADN Limpio & Concentrador | Zymo Research | D4004 | |
| Zymoclean Gel Kit de Recuperación de ADN | Zymo Research | D4002 | |
| Q5 Hot Start High-Fidelity 2X Master Mix New | England Biolabs | M0494L | |
| Proteinasa K | Sigma | P2308 | |
| Vidrio Borosilicato Micropipetas de vidrio | Sutter Instruments | BF100-78-10 | OD: 1.0mm. ID: 0,78 mm |
| Clorhidrato de Trizma | Sigma | T5941 | |
| MgCl2 | Sigma | M2393 | |
| NP-40 | Sigma | 74385 | |
| Tween-20 | Fisher Scientific | BP337-100 | |
| RNaseZap Solución de descontaminación | Fisher Scientific | AM9780 |
Referencias
- Dickinson, D. J., Goldstein, B. CRISPR-Based Methods for Caenorhabditis elegans Genome Engineering. Genetics. 202, 885-901 (2016).
- Doudna, J. A., Charpentier, E. Genome editing. The new frontier of genome engineering with CRISPR-Cas9. Science. 346, 1258096(20....
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Reimpresiones y permisos
