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Un rápido y fácil tubería para generar genómica punto mutantes de C. elegans utilizando CRISPR/Cas9 ribonucleoproteínas

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DOI:

10.3791/57518

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30 de abril de 2018

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1Department of Pharmacology, University of Michigan

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En este artículo

Resumen

Aquí, presentamos un método para diseñar el genoma de C. elegans utilizando ribonucleoproteínas Cas9 CRISPR y plantillas de reparación dependiente de homología.

Resumen

Las repeticiones palindrómico intercaladas regularmente agrupadas (CRISPR) - CRISPR - asociaron proteína 9 (Cas9) sistema de defensa inmune adaptante procariotas ha sido cooptado como una poderosa herramienta para la ingeniería del genoma eucariota precisa. Aquí, presentamos un método rápido y sencillo usando RNAs quiméricos guía sola (sgRNA) y CRISPR Cas9 ribonucleoproteínas (RNPs) para la generación eficiente y precisa de genómicas mutaciones de punto en C. elegans. Describimos una tubería sgRNA selección de objetivos, diseño de plantilla de reparación dirigido por homología (HDR), secuestrantes de CRISPR Cas9 de RNP, entrega y una estrategia de genotipificación que permite la identificación rápida y robusta de animales correctamente editados. Nuestro enfoque no sólo permite el fácil generación y la identificación del punto deseado de genomic de animales mutantes, sino que también facilita la detección de otros alelos del complejo indel en aproximadamente 4-5 días con alta eficiencia y una proyección reducida carga de trabajo.

Introducción

Recientes avances tecnológicos han transformado radicalmente y acelera la capacidad de genomas de Ingeniero precisamente. En particular, el sistema CRISPR Cas9, que depende de la endonucleasa de RNA-dirigida Cas9 para inducir una rotura de doble cadena (DSB) cerca de la secuencia de destino de interés, se ha utilizado extensivamente para diseñar con precisión el genoma de la mayoría de organismos modelo utilizados en investigación biomédica1,2,3,4. Significativamente, el uso de CRISPR Cas9 ha desbloqueado la edición del genoma en especies difíciles como C. elegans5. Independientemente de la especie, generando mutaciones puntuales con el genoma de CRISPR-Cas9 basado en sistema de edición se basa en tres componentes básicos: 1) Cas9 endonucleasa, 2) un guía única RNA (sgRNA) que dirige la endonucleasa Cas9 para una secuencia de destino y 3) un usuario diseñado plantilla de reparación dirigido por homología (HDR) que contiene la edit(s) de interés2.

Hay varios métodos que pueden utilizar para introducir la segmentación sgRNA e Cas9 nucleasa en células como plásmido, RNA y entrega viral basado en métodos6. Recientemente, entrega directa de pre-complexed sgRNA-Cas9 ribonucleoproteínas (RNPs) ha emergido como una herramienta potente y eficaz en el genoma basado en el Cas9 CRISPR edición7. La entrega directa de pre-complexed CRISPR Cas9 RNPs tiene varias ventajas, a saber: 1) RNPs omitir la necesidad de transcripción celular y traducción 2) RNPs se eliminan rápidamente, que puede aumentar la especificidad al reducir el tiempo disponible para objetivo escote y 3) RNPs no contienen ninguna elementos extranjeros de ADN/ARN que evita la introducción de secuencias de no nativos en el genoma del anfitrión a través de la integración al azar. En conjunto, estos atributos probablemente proporcionan una breve ráfaga de objetivos CRISPR edición minimizando efectos off-target.

Se describe un protocolo sencillo y eficaz para introducir cambios genomic específico en C. elegans. Este protocolo incluye la focalización sgRNA y diseño de plantillas de informe único oligonucleótido trenzado (ssODN), secuestrantes de RNP sgRNA Cas9 y entrega y una estrategia de genotipación para la identificación inequívoca de los animales debidamente editados. Usando esta estrategia, no sólo pueden recuperar los cambios específicos del sitio que desee, pero otras mutaciones indel no específicos pueden también ser recuperados. Por lo tanto, nuestra estrategia permite la generación de una serie alélica mediante una estrategia única, donde mono-alélica, bi-alélicos y indel mutantes pueden generarse en la generación de1 F.

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Protocolo

Todos los procedimientos experimentales y cuidado de los animales siguieron la pauta de los institutos nacionales de salud y el cuidado Animal institucional y Comité uso (IACUC) en la Universidad de Michigan. Usar soluciones libres de RNasa y pipetear consejos en todo el protocolo. Limpie el área de trabajo, pipetas, tubos y centrifugar con solución de Rnasa descontaminación siguiendo las pautas del fabricante (ver Tabla de materiales).

1. sgRNA selección de objetivos

  1. Mediante un explorador web, abra la página web: http://crispor.tefor.net8
    1. Entrada ~ 60 pares de bases (PB) de secuencia que flanquean la edición deseada de interés (es decir, 30 bp 5' y 3' de la edición deseada).
    2. Seleccione el genoma de Caenorhabditis elegans en el menú desplegable.
    3. Seleccione el motivo adyacente de Protospacer (bp-NGG - SpCas9, 20 SpCas9-HF1, eSPCas9 1.1) desde el menú desplegable.
    4. Haga clic en enviar. En la página de resultados, seleccione la secuencia de destino ordenada superior más cercana a la edición de interés. Si no hay ningún sitios de destino adecuado dentro de la secuencia de entrada de la bp 60 de flanqueo, ampliar la secuencia de consulta hasta 100 bp (es decir, 50 bp ambos lados de la edición).
  2. A partir de una fuente disponible, por ejemplo, synthego, obtener un 20-mer objetivo sgRNA con las siguientes especificaciones: 3 nmol; sin modificaciones.
  3. Tras la recepción, centrifugar sgRNA liofilizado que contienen tubo en > 12.000 x g durante 1 min a temperatura ambiente. Añadir 60 μL de TE libre de nucleasas en el tubo y Resuspenda suavemente mediante pipeteo arriba y abajo de 15 a 20 veces con una pipeta de P200. La concentración final es de 50 μm.

2. homología indica reparación plantilla diseño

  1. Diseñar una plantilla HDR ssODN contiene: 1) la mutación de interés, 2) un sitio único endonuclease de la restricción en-marco, 3) una mutación silenciosa de uno o ambos de los Gs dentro de la secuencia de NGG PAM y 4) 50 bp 5' y 3' homología de armas que flanquea la mutación de la primera y la última. (Figura 1) 9 , 10.
    1. Si no es posible la mutación de la secuencia de PAM NGG, introducir mutaciones silenciosas 5-6 dentro de la secuencia de reconocimiento de destino sgRNA para evitar escote sgRNA-mediada de la plantilla de informe de ssODN.
  2. A partir de una fuente disponible, por ejemplo, idtdna, obtener un "oligonucleótidos de ADN Ultramer" con los siguientes parámetros: escala: 4 nmol; Formulación: Ninguno; Purificación: La desalación estándar.
  3. Al recibir, de centrífuga ssODN liofilizado que contienen tubo > 12.000 x g durante 1 min a temperatura ambiente. Resuspenda suavemente ssODN a una concentración final de 100 μm en ddH libre de nucleasa2O mediante pipeteo arriba y abajo de 15 a 20 veces con una pipeta de P200.

3. diseño Primers de genotipado

  1. Diseño de un primer set que flanqueaban la modificación del genoma para generar un ~ 400-700 bp PCR amplicon11.
  2. Optimizar condiciones ciclo PCR para producir productos individuales y específicos11.

4. preparar la mezcla de inyección

  1. Centrífuga de mesa 1 reactivos a la velocidad máxima por 2 min a 4 ° C.
  2. En el orden indicado, añadir los reactivos de la tabla 1 a un tubo PCR libre de nucleasas.
  3. Mezclar bien mediante pipeteo suavemente hacia arriba y hacia abajo 10 veces con una pipeta de P20.
  4. Incubar la mezcla de inyección durante 10 min a temperatura ambiente.

5. inyección protocolo

  1. Micropipeta de inyección de carga con aproximadamente la mitad de la mezcla de inyección12. Guarde el resto de mezcla de inyección en caso de que la aguja se atasca o se rompe.
  2. Romper la punta de la micropipeta para que ~ 20-30 PSI produce un flujo gradual de solución12.
    Nota: Más grande de punta negativamente afecta la salud animal y disminuir la producción de progenie F1 .
  3. Inyectar 10 a 15 jóvenes adulto gusanos en ambos brazos gonadales si es posible12. Si no, la inyección en un brazo gonadal es suficiente.
  4. Permiten animales inyectados (P0) recuperar para 1-2 h a temperatura ambiente en una placa de los medios de comunicación (NGM) crecimiento nematodos OP50 semillas 35 mm. Posteriormente, solo inyectados P0 animales placas NGM individuales sembradas OP50 35 mm con un gusano de alambre de platino escoger12.

6. pantalla P0 placas y1sola mCherry(+) F s

  1. Después de la inyección dos días, identificar placas,0 P con progenie de1 F expresando mCherry en la faringe mediante un estereomicroscopio fluorescente (figura 1, día 2 - 3). Seleccione las placas de0 de tres P que contienen la mayoría de los animales1 mCherry(+) F.
  2. De cada una de las tres placas de0 de P seleccionadas, solo 8-12 mCherry(+) F1 animales para un total de 24-36 mCherry(+) F1s usando un gusano pick (figura 1, día 2 - 3).
    Nota: mCherry(-) animales también pueden ser destacados de estas placas de P0 , pero la probabilidad de identificar correctamente editado animales es mucho menor (figura 2A).
  3. Permiten individuales F1s para fertilizarse y poner huevos 1-2 días a temperatura ambiente.

7. sencillo PCR y genotipificación del gusano

  1. Después de 1-2 días de puesta de huevos, transferir la F1s en cada PCR tira casquillos del tubo que contiene 7 μl de tampón de lisis del gusano utilizando una púa de gusano (tabla 2, figura 1, día 4-5).
  2. Tubos de PCR de centrífuga a máxima velocidad durante 1 min a temperatura ambiente para traer animales a la parte inferior del tubo y la congelación de los tubos a-80 ° C durante 1 h.
    Nota: Gusanos pueden ser almacenados a-80 ° C indefinidamente.
  3. Lyse gusanos congelados en un termociclador con el siguiente programa: 60 ° C durante 60 min, 95 ° C durante 15 min, 4 ° C mantener.
  4. Mastermix PCR de configuración como se muestra en la tabla 3.
  5. Añadir 21 μl del mastermix PCR en tubos PCR limpios y luego añadir 4 μL de lisis de gusano del paso 3. Mezclar con una pipeta y ejecutar programa PCR siguiendo las pautas del fabricante (ver Tabla de materiales).
  6. Purificar las reacciones de PCR utilizando un kit de ADN limpio y concentrado, siguiendo las instrucciones del fabricante (ver Tabla de materiales). Eluir el ADN agregando 10 μl de agua a la columna de vuelta.
  7. Mastermix de enzima de la restricción de configuración como se muestra en la tabla 4.
  8. Añadir 10 μl de la enzima de la restricción mastermix a cada reacción de PCR limpio e incubar durante 1-2 h a 37 ° C13.
  9. Separado digerido productos de la PCR en un gel de agarosa 1.5% a 120 V con 1 x Tris-acetato-EDTA (TAE) buffer14.

8. identificación y verificación de la secuencia de los animales editados

  1. Examinar muestras de la enzima que digiere la presencia de bandas que indican potencial editado animales14 (figura 1, día 4-5).
    Nota: Cargar un control de N2 para identificar posibles mutaciones indel que pueden ser observadas como cambios en el tamaño de la banda o inesperado y complejo enzimático de la restricción digestión, los patrones de bandas.
  2. Después de identificar los posibles animales editados, utilice las restantes 3 μl de lisis de gusano y repetir la reacción de PCR. No limpie o enzimas de restricción digiere la reacción de PCR después de completar el programa. La reacción de PCR en gel de agarosa al 1%, independiente de la carga y extraer la banda utilizando un gel de extracción kit15 (ver Tabla de materiales).
  3. Gel de16 secuencia Sanger extrajo ADN utilizando la cartilla de F1 para identificar animales correctamente editados (figura 1A)
    Nota: Lee contendrán heterocigoto overlaid picos debido a la presencia del tipo salvaje y alelo de ingeniería.
  4. Para obtener animales homocigóticos de animales editados heterozigóticos verificados, solo 8-122 animales y realice los pasos 7-8.

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Resultados

Mutaciones en humanos de la superóxido dismutasa 1 (SOD1) representan ~ 10-20% de la esclerosis de lateral amiotrófica, una enfermedad neurodegenerativa devastadora que invariablemente conduce a la parálisis y la muerte17. Humano SOD-1 es una proteína conservada evolutivamente compartir similitud de identidad y el 70% del 55% con la proteína SOD-1 de C. elegans (figura 1B). Para demostrar la simplicidad, viabilidad y ...

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Discusión

El sistema CRISPR Cas9 es una herramienta potente y eficaz para modificar precisamente el genoma de organismos modelo. Aquí, demostramos que eso quimérico sgRNAs20 junto con ssODN HDR plantillas permiten la generación altamente eficiente de genómicas mutaciones de punto en C. elegans. Importante aún, demostramos que entrega RNP produce alto rendimiento edición cuando la fluorescencia se utiliza como un marcador de selección Co, destacando la facilidad y la fiabilidad de la técnica.

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Divulgaciones

Agradecemos a los miembros del laboratorio Beg de lectura crítica de este manuscrito. Las cepas fueron proporcionadas por el centro de genética de Caenorhabditis , que es financiado por los NIH oficina de programas de infraestructura de investigación (P40 OD010440). Investigación en el laboratorio de Beg es apoyada por becas del NIH (R01 NS094678) y Asociación de la Distrofia Muscular (MDA382300) a A.A.B.

Agradecimientos

Hay no hay conflictos de intereses relacionados con este informe.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
CRISPRevolution sgRNA  EZ KitSynthego Inc.sgRNA quimérico
libre de nucleasas TESynthego Inc.provisto con el kit de sgRNA EZ kit
Agua libre de nucleasasSynthego Inc.provisto con el kit de sgRNA EZ kit
4 nmole Ultramer DNA OligoIntegrated DNA TechnologiesssODN plantilla HDR
Alt-R S.p. HiFi Cas9 Nucleasa 3NLSIntegrated DNA Technologies1078728proteína Cas9
pCFJ90 Addgene19327Pmyo-2::mCherry Marcador Plásmido
KClSigmaP5405
HEPESSigmaH4034
ADN Limpio & ConcentradorZymo ResearchD4004
Zymoclean Gel Kit de Recuperación de ADNZymo ResearchD4002
Q5 Hot Start High-Fidelity 2X Master Mix NewEngland BiolabsM0494L
Proteinasa KSigmaP2308
Vidrio Borosilicato Micropipetas de vidrioSutter InstrumentsBF100-78-10OD: 1.0mm. ID: 0,78 mm
Clorhidrato de TrizmaSigmaT5941
MgCl2SigmaM2393
NP-40Sigma74385
Tween-20Fisher ScientificBP337-100
RNaseZap Solución de descontaminaciónFisher ScientificAM9780

Referencias

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