Un modelo de asa Intestinal ligados en pollos libre anestesiados patógenos específicos para el estudio de virulencia de Clostridium Perfringens

Summary

Aquí presentamos un protocolo quirúrgico crear «loops ligados intestinales» en intestino de pollo. Este procedimiento permite la comparación de virulencia en situ en un único host de varias cepas de Clostridium perfringens . Este método disminuye marcadamente el número de pollos generalmente necesarios para experimentos similares en vivo .

Abstract

Enteritis necrótica fue estudiada en pollos utilizando varios en vivo modelos de infección. La mayoría de éstos utiliza una combinación de factores predisponentes, tales como coccidiosis y dieta, con sonda nasogástrica o administración a través de la alimentación usando Clostridium perfringens. En estos modelos, la comparación de múltiples cepas de C. perfringens para estudios de virulencia requiere un gran número de hosts para obtener resultados significativos. Durante el curso del estudio de la mortalidad puede ser alta dependiendo del modelo experimental, por lo tanto, levantando preocupaciones éticas sobre el bienestar de los animales en la investigación. El desarrollo de nuevos modelos de infección que requieran menos animales para estudiar la patogenesia, pero proporciona resultados válidos y estadísticamente significativos, es importante en la reducción del uso de animales en investigación. Modelos de asa intestinal ligados se han utilizado para estudiar las infecciones clostridiales en diversas especies como ratones, conejos y terneros. Después de procedimientos quirúrgicos para crear segmentos ligados lazo, cepas de C. perfringens se inyectan directamente en los lazos para establecer un contacto cercano entre las bacterias y la mucosa intestinal. Se toman muestras de intestino delgado y contenido luminal en la terminación de los procedimientos después de unas horas. Múltiples cepas bacterianas pueden ser inoculadas en cada animal, por lo tanto reduciendo el número de sujetos necesarios en los experimentos. También, los procedimientos se realizan bajo anestesia general para reducir el dolor animal. En los pollos, este modelo sería más adecuado que la administración oral para comparar la patogenicidad de C. perfringens cepa porque se necesitan menos animales, factores predisponentes no deben inducir a la enfermedad y dolor se controla con analgésicos . El modelo de asa intestinal ligados está pobremente descrito en pollos y estandarización es esencial para su uso óptimo. Este manuscrito ofrece todos los pasos necesarios para crear numerosos bucles ligados intestinales en pollos y aporta información sobre los puntos críticos para obtener resultados válidos.

Introduction

El uso de modelos animales para estudiar enfermedades infecciosas que afectan a los seres humanos y animales es una herramienta central en la evaluación de factores de virulencia, regulación de la patogenia de una enfermedad específica, así como a elaborar estrategias para prevenir o curar enfermedades¹. A pesar de numerosas ventajas de la utilización de modelos animales para estudiar diversas enfermedades, han surgido preocupaciones éticas con respecto a esta práctica. Los investigadores deben minimizar el uso de animales y obtención de resultados significativos y válidos. El concepto de los 3 principios de Rs (reemplazar, reducir y refinar) fue elaborado para asegurar que en dichos estudios se abordaron temas de bienestar. En estudios de NE de pollo, en vivo pollo modelos se utilizan para investigar la etiología, prevención y tratamientos de esta condición^2,3,4,5. Las cepas patógenas de C. perfringens que llevan factores de virulencia específicos, tales como la RedB toxina⁶, son administradas para causar enteritis necrótica en pollos⁷. Por lo tanto, el principio de sustitución es difícil de lograr en este caso como estos factores de virulencia pueden no ser tan críticos en otras especies animales. Mayoría de los modelos de enteritis necrótica en los pollos utiliza una combinación de factores de riesgo, tales como coccidiosis y alterado dieta para inducir enteritis necrótica seguida por sonda nasogástrica del caldo de cultivo que contienen grandes cantidades de C. perfringens². Estos modelos inducirán la enfermedad en un gran número de pollos, y la mortalidad puede ser importante en estos ensayos⁸, así levantando preocupaciones acerca de los principios de reducción y refinamiento en la investigación animal.

Modelos de lazos ligados intestinal son una alternativa deseable para el estudio de enfermedades inducidas por patógenos intestinales en relación con el principio de reducción y refinamiento. En estos modelos, se crean segmentos de intestino llamados 'loops' mediante la colocación de ligaduras a lo largo del tracto intestinal para formar compartimentos independientes y herméticos donde patógenos pueden inyectar solo⁹ o con otras moléculas, tales como candidatos vacunales ^{10 , 11}. los patógenos de interés estén en estrecho contacto con las células intestinales y que después de algunas horas de tiempo de infección, las muestras intestinales pueden ser recuperadas para su posterior análisis. Esto permite el uso de múltiples grupos de control y tratamiento en el mismo animal. Análisis estadístico puede realizarse con modelos de medidas repetidas, que aumenta el poder de discriminación entre grupos y reduce el número de gallinas necesarios en comparación con los ensayos orales gavage. También, procedimientos quirúrgicos y los tiempos de infección subsecuente se realizan bajo anestesia general continua y analgesia, por lo tanto, reducir al mínimo el dolor animal. Trompas de lazo cerrado están una plantilla ideal para reducir el número de host y crear un sistema más humano en la investigación animal.

Modelos de lazos ligados intestinal son bien descritos en varias especies, tales como terneros, conejos y ratones^2,9, pero mal descritos en pollos⁷. Para un uso óptimo de este modelo quirúrgico, ejecución y la técnica adecuada son esenciales para la creación de bucles intestinales ligados para evitar daños a la integridad intestinal. El objetivo de este manuscrito es describir un método paso a paso en la creación de múltiples asas intestinales en un modelo de pollo. Esta técnica está limitada por la habilidad del cirujano y la experiencia, como procedimientos precisos son esenciales para el éxito del proyecto.

Protocol

Todos los procedimientos con el uso de animales vivo fueron autorizados por el Comité de ética de la Facultad de medicina veterinaria de la Université de Montréal (CÉUA, 'Comité d' éthique de Deutsch des Animaux').

1. consideraciones antes de la cirugía

1. Seleccionar pollos de Livorno (SPF) libres de 10 semanas de edad de patógenos específicos para la cirugía.
   Nota: Su peso debe estar entre 1.0 y 1.2 kg.
2. Retirar la alimentación 12 horas antes de los procedimientos para vaciar el tracto intestinal.
3. Antes de la cirugía, poner los pollos bajo anestesia general, siguiendo un protocolo verificado por un anestesiólogo. Premedicate cada pollo 15 minutos antes de la cirugía con una inyección intramuscular (IM) de midazolam 1 mg/kg y butorfanol 4 mg/kg. Repetir cada 4 h, la inyección de butorfanol 4 mg/kg IM o cuando los cambios de patrones de respiración y la frecuencia aumenta durante la anestesia. Para la anestesia general, durante todos los procedimientos, administrar isoflurano con una concentración entre 1.5 y 2.5% con un tubo endotraqueal.
   Nota: El uso de premedicación para sedación y analgesia se recomienda como ellos serán significativamente mejorar la profundidad de la anestesia, reducir la cantidad de anestésicos durante todos los procedimientos, así como permiten a los investigadores controlar los niveles de dolor.
4. Monitor de la anestesia mediante el registro de la temperatura corporal, frecuencia cardíaca y Electrocardiograma (ECG), respiratorio tasa y ritmo, saturación de oxígeno, vencidos bióxido de carbono (CO₂) y reflejos neurológicos.
   Nota: Una persona debe asignarse para controlar estos parámetros a lo largo de todos los procedimientos.
5. Siga principios de esterilidad a través de los procedimientos quirúrgicos. Asegúrese de que el cirujano y el cirujano asistente vestido con batas estériles, guantes, una máscara y gafas de acuerdo a los protocolos preoperatorios institucionales. Asegúrese de que el cirujano friega las manos con un cepillo estéril de clorhexidina gluconato impregnado hasta el codo con énfasis en cada superficie de dedos y uñas.
6. Esterilizar los instrumentos quirúrgicos con un esterilizador.

2. preparación del terreno quirúrgico

1. En primer lugar, eliminar manualmente las plumas del abdomen con una tracción suave.
2. Limpiar el sitio quirúrgico con un clorhexidina gluconato detergente impregnado estéril cepillo. Frote suavemente la piel desde el centro hacia el exterior para un tiempo total de contacto de 5 minutos sin volver al centro.
3. Realizar 3 pasos alternativos en el sitio quirúrgico con solución de gluconato de clorhexidina y alcohol isopropílico utilizando gasas estériles.
   Nota: El paso debe comenzar desde el centro del campo quirúrgico a las fronteras para evitar la contaminación de las áreas no desinfectados al sitio quirúrgico.
4. Coloque el paño quirúrgico estéril sobre el pollo.

3. extracción del intestino de la cavidad Abdominal

1. Incidir el paño quirúrgico con unas tijeras para exponer sólo la piel del sitio quirúrgico.
2. Haga una incisión en la piel mediante la realización de una incisión de línea media bajo forma de '' L'' con una hoja de bisturí #3.
   1. Iniciar la primera incisión de 1 cm caudal al esternón y extremo a 1 cm craneal a la cloaca.
   2. Realizar la segunda incisión perpendicular a la primera incisión. Comenzar desde el extremo caudal de la primera incisión y continuar 5 cm en el lado izquierdo del abdomen siguiendo la línea de la pelvis.
      Nota: Esta apertura va a crear un colgajo que permite una fácil extracción de los intestinos.
3. Con las tijeras de cirugía, cortar el peritoneo y los músculos abdominales con el mismo patrón de forma de '' L'' para abrir la cavidad abdominal.
   Nota: Esto lo expondrá los sacos de aire. Los intestinos se encuentran por debajo de estas estructuras. Sacos de aire debe ser humidificados con gasas saturadas con solución salina estéril 0,85% para evitar la desecación y la posible ruptura durante el procedimiento.
4. Esterilización de un robalo gancho en la cavidad abdominal después de la pared abdominal izquierda y funcionan de la manera alrededor de los sacos de aire abdominales.
5. Exteriorizar el intestino y estos repartidos en el campo quirúrgico.
   Nota: Mantenga los intestinos humidificados rociando frecuentemente solución salina estéril 0,9% durante todo el procedimiento. También, pueden colocarse gasas humedecidos con solución salina estéril en los intestinos para evitar desecación.
6. Agarra los intestinos con una gasa estéril seca y extraiga con cuidado el intestino por la tracción manual para exponer el yeyuno.
   Nota: Los recipientes mesentéricos son frágiles y una tensión excesiva que puede conducir a lesiones isquémicas intestinales y afectar grandemente el resultado del procedimiento puede romperse.

4. fabricación de asas intestinales

1. Creación de lazo no. 1.
   1. Colocar una ligadura simple con Poliglactina multifilamento absorbible material sintético en el yeyuno proximal, evitando la ligadura de los vasos mesentéricos principales.
   2. Colocar una ligadura distal de 2 cm de la ligadura proximal.
      Nota: Simples ligaduras hechas con material de sutura multifilamento se colocan a lo largo del tracto intestinal para crear segmentos herméticos. Un esquema (figura 1) describe la ubicación de todas las ligaduras. Los lazos consisten en una ligadura proximal y distal, separada por 2 cm.
2. Creación de interloop Nº 1.
   1. Colocar una ligadura simple 0,5 cm aborally a la ligadura distal de lazo n º 1.
      Nota: Entre los bucles sucesivos, hay interloops de 1 cm, es decir, segmentos que una separación física entre los lazos. Para probablemente reducir el posible riesgo de contaminación cruzada de un circuito a otro, una ligadura simple se coloca en medio del interloop (0,5 cm de la ligadura distal y proximal de 2 bucles adyacentes). Esto reduce el riesgo de un posible contaminante se filtró desde un lazo para llegar a la ligadura de un asa adyacente. Estos segmentos no son obligatorios pero disminuirán el riesgo de contaminación cruzada.
3. Creación de lazos posteriores y interloops.
   1. Repita los pasos 4.1 y 4.2 para obtener el número de bucles deseados.
      Nota: En este experimento, se crearon lazos de 9 y 8 interloops. Longitud total ascendió a 26 cm. El número de bucles se puede ajustar según el estudio.

5. inyección de cepas de Clostridium perfringens en los lazos

1. Inyectar con una jeringa estéril y una aguja de 26 G el patógeno en lazo n º 1. Inserte suavemente la aguja en el lado saculaciones del intestino en un ángulo de 45°.
   Nota: En este experimento, se inyectó 0,2 mL de infusión de cerebro corazón (BHI) que contiene 1 x 10⁶ UFC (unidades formadoras de colonias) de C. perfringens en la fase de crecimiento de registro medio en cada bucle. se inyectaron 5 cepas diferentes en 5 circuitos diferentes y los 4 restantes loops fueron inyectadas con un control negativo que contiene ningunas bacterias (BHI estéril), alternancia de patógenos y bucles BHI estériles.
2. Repita el paso 5.1 para inyectar todos los bucles.
3. Vuelva a colocar el tracto intestinal en la zona dorsal de la cavidad abdominal, por debajo de los sacos de aire.

6. cierre de la cavidad Abdominal

1. La sutura del peritoneo y los músculos abdominales.
   1. Suturar el peritoneo y los músculos abdominales a lo largo de la pelvis (hecho en el paso 3.3) con un patrón de sutura continua simple con Poliglactina multifilamento absorbible material sintético.
   2. Suturar el peritoneo y los músculos abdominales desde el esternón a la cloaca (hecha en el paso 3.3. con un patrón de sutura continua simple con Poliglactina multifilamento absorbible material sintético.
2. La sutura de la piel.
   1. Usando un material multifilamento sintético de Poliglactina y un patrón de sutura continua simple, cerrar la incisión de la piel a lo largo de la pelvis hecha en el paso 3.2.
   2. Usando el mismo material de ligadura multifilamento y un patrón de sutura continua simple, cerrar la incisión de la piel desde el esternón a la cloaca hecha en el paso 3.2.

7. conclusión

1. Después de los procedimientos quirúrgicos, mantenga el pollo bajo anestesia general con el uso apropiado de analgésicos para minimizar el dolor animal durante el tiempo de infección. Continuar la vigilancia anestésica para asegurar un nivel adecuado de anestesia.
2. Después de la hora deseada infección, eutanasia humanamente el pollo por dislocación cervical bajo anestesia general.
   Nota: Para estos procedimientos, el tiempo requerido para inducir lesiones microscópicas con cepas patógenas de C. perfringens fue 7 h.
3. Con una hoja de bisturí #3, corte un cm 0,5 a sección de bucle largo de 1 cm y colocarla en formol al 10% para fijación durante la noche e histopatológicos más análisis.
4. Con la misma hoja de bisturí, cortar la sección de bucle restante y colocar en un tubo de microcentrífuga estéril para el aislamiento de las cepas de C. perfringens en cada análisis bacteriológicos más lazo para su caracterización genética.
5. Repita los pasos 7.2 y 7.3 para todos los bucles cambiando la hoja de bisturí entre cada lazo.

Results

Figura 1muestra un esquema de las asas intestinales 9 y 8 interloops. En este modelo, se crean un total de 9 circuitos y 8 interloops con ligaduras simples. Un bucle consiste en ligaduras proximales y distales, separadas por 2 cm de la ligadura proximal. Dos bucles adyacentes están separados por un interloop de 1 cm. Para disminuir el posible riesgo de contaminación cruzada entre bucles por la fuga de una ligadura, una ligadura interloop se coloca a medio cam...

Discussion

Modelos de asas intestinales se han descrito en numerosas especies para estudiar la interacción huésped-patógeno y patogenia de las enfermedades causadas por varios patógenos intestinales, como Clostridium perfringens, Clostridium difficile y Enterica de las salmonelas^7,9,13,14,15. También se ha utilizado para analizar la respuesta i...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
EZ-Scrub 747	Becton Dickinson and Company		% gluconato de clorhexidina detergente impregnado de detergente. No hay número de catálogo disponible. Dirección web: https://www.bd.com/en-us/offerings/capabilities/infection-prevention/surgical-hand-scrubs/ez-scrub-preoperative-surgical-scrub-brushes
Alcohol isopropílico 70% USP 4 L	Alcohol isopropílico comercial	P016IP70	Dirección web: http://www.comalc.com/products/
Solución	Sigma-Aldrich	282227-1G	, debe diluirse al 4%. Dirección web: http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/282227?lang=fr®ion=CA&gclid=EAIaIQ obChMI8vHr4_OY1wIV3rrACh2Z WQKuEAAYAiAAEgLKx_D_BwE
Cortina quirúrgica pequeña (27 pulgadas x 24 pulgadas) con 3 x 6 pulgadas Fenestración	Productos Especializados Veterinarios	32724	Dirección web: http://www.vetspecialtyproducts.com/index.cfm?fuseaction=ecommercecatalog. detail&productgroup_id=15
Hojas de bisturí #3	Swann-Morton	301	Dirección web: https://www.swann-morton.com/product/16.php
Solución salina estéril NaCl 0.9%	Sigma-Aldrich	S8776-100ML	Dirección web: http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/s8776?lang=fr®ion=CA
Vicryl 3-0	Ethicon	D9003	Material de sutura absorbible multifilamento de poliglactina. Dirección web: http://www.ethicon.com/healthcare-professionals/products/wound-closure/absorbable-sutures/coated-vicryl-polyglactin-910-suture
Jeringa de 1 ml con aguja de 26G	Becton Dickinson and Company	329652	Dirección web: https://www.bd.com/en-us/offerings/capabilities/diabetes-care/insulin-syringes/bd-1-ml-conventional-insulin-syringes
Brain Heart Infusion	Sigma-Aldrich	1104930500	Dirección web: http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/mm/110493?lang=fr®ion=CA&cm_sp=Insite-_-prodRecCold_xorders-_-prodRecCold2-1
tubo Eppendorf	Sigma-Aldrich	T9661-500EA	Tubo de microcentrífuga. Dirección web: http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/t9661?lang=fr®ion=CA&gclid=EAIaIQ obChMI-YizzfiY1wIVRkCGCh 30SQjuEAAYAiAAEgLK5fD_BwE
Solución de formol, neutro tamponado, 10%	Sigma-Aldrich	HT501128-4L	Relación tejido: formol de 1:10 para una fijación adecuada. Dirección web: http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/ht501128?lang=fr®ion=CA
Clostridium perfringens cepas	Université de Montré al, Chaire en recherche avicole	N/A	Específico para cada laboratorio, disponible previa solicitud al autor correspondiente