Este protocolo describe un método nuevo para la entrega del virus a la próstata murina. Usando tecnología CRISPR/Cas9, sobreexpresión del gen o entrega del recombinase de Cre, la técnica permite orthotopic alteración de la expresión génica e implementa un modelo novedoso ratón para cáncer de próstata.
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Artículo de método
Virus de la entrega de guías CRISPR para la próstata murina por alteración del gen
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Resumen
Resumen
Con una incidencia creciente del cáncer de próstata, identificación de nuevos controladores de tumor o moduladores es crucial. Modelos de ratón modificados genéticamente (GEMM) para cáncer de próstata se ven obstaculizados por la heterogeneidad del tumor y su dinámica compleja de la microevolución. Modelos de ratón de cáncer de próstata tradicionales incluyen, entre otros, del germline y nocauts condicionales, la expresión transgénica de oncogenes y modelos de xenoinjerto. Generación de mutaciones de novo en estos modelos es complejo, lento y costoso. Además, la mayoría de los modelos tradicionales de destino la mayoría del epitelio prostático, mientras que el cáncer de próstata humano es bien sabido evolucionar como un evento aislado en sólo un pequeño subconjunto de células. Modelos valiosos deben simular no sólo iniciación del cáncer de próstata, pero también la progresión a enfermedad avanzada.
Aquí se describe un método para atacar algunas células en el epitelio de la próstata las células transductoras de partículas virales. La entrega de un virus dirigido a la próstata murina permite la alteración de la expresión génica en el epitelio de la próstata. Cantidad y tipo de virus por este medio definirá el número de células específicas de alteración genética por transducción de algunas células para la iniciación del cáncer y muchas células para la terapia génica. A través de inyección basados en cirugía en el lóbulo anterior, distal de la vía urinaria, el tumor en este modelo puede ampliarse sin deteriorar la función urinaria del animal. Además, dirigiéndose a sólo un subconjunto de células epiteliales prostáticas la técnica permite expansión clonal del tumor y por lo tanto imita la iniciación del tumor humano, progresión, así como invasión a través de la membrana basal.
Esta novedosa técnica ofrece un modelo de cáncer de próstata de gran alcance con mayor relevancia fisiológica. Sufrimiento de los animales es limitado, y ya no cría adicional se requiere, en general animal cuenta se reduce. Al mismo tiempo, se aceleraron el análisis de nuevos genes candidatos y vías, que a su vez es más rentable.
Introducción
Detección y tratamiento del cáncer de próstata han mejorado significativamente durante la última década. Aún así, la incidencia de cáncer de próstata está aumentando, a raíz de la esperanza de vida. Con un estimado 1,1 millones nuevos casos en todo el mundo, es una de las causas más comunes de muerte relacionada con cáncer en los hombres 1. El cáncer de próstata es lento en su desarrollo, pero cuando el cáncer ha progresado a un estado metastásico avanzado, el pronóstico es pobre debido a las opciones de tratamiento limitadas. Hasta ahora, sólo unos pocos genes se han identificado como controladores comunes de este cáncer, y su heterogeneidad y multifocalidad impide la detección de biomarcadores y enfermedad targetable controladores2,3.
Técnicas clásicas de GEMMs generación a menudo se deterioran por su complejidad, gastos de tiempo y costos. Modelos condicionales han sido ampliamente utilizados para el estudio de genes candidatos de cáncer de próstata, que resultan en mortalidad embrionaria cuando inactivado en la línea germinal4. Modelos más comunes implican un recombinase de Cre prostático específico conducido por cualquiera un Probasin modificado5 o promotor PSA6 integrada en el GEMM por cruzamiento adicional. En estos modelos, el gen de interés estará dirigido en la mayoría de las células epiteliales prostáticas, generación de hiperplasia en el órgano entero, que puede perjudicar tracto urinario función7 del animal.
Entrega viral de la proteína de Cre por inyección en el lóbulo anterior de la próstata murina puede resolver este problema dirigiéndose sólo a unas pocas células8. Teniendo en cuenta, los beneficios del método de una amplia gama de variaciones posibles requisitos técnicos de laboratorios, conocimientos y objetivos. Enfoques exitosos utilizando Adenovirus a JunB y Pten9 o Lentivirus a Pten y Trp5310 ha demostrado entre otros. Agregar los transgenes, como luciferasa, el constructo viral o el GEMM además permitirá monitorización no invasiva de progresión de la enfermedad mediante bioluminiscencia imagen11.
La edición del genoma basado en la tecnología CRISPR/Cas9 revela una oportunidad nueva y rápida para el estudio de cáncer a través de la rápida generación de nocauts somática12. Entrega viral solo guía RNAs (sgRNAs) dirigida al lóbulo anterior de la próstata murino establece un modelo fisiológico más relevante del cáncer de próstata. De esta forma, las células con mutaciones solicitadas pueden formar clones capaces de expansión y de invasión. Además, uso de guía RNAs para varios genes diana va a generar clones de células con alteraciones en distintos genes. Esto permitirá que la heterogeneidad del tumor y una presión de selección natural en la progresión del cáncer, que puede revelar la importancia de cada alteración de genes o mecanismos epistáticas.
Aquí presentamos un método para entregar partículas virales a la próstata murina para alteración de la expresión génica. Por una pequeña incisión abdominal, se expone el lóbulo prostático anterior murino y se inyectan partículas virales en el lóbulo. Cinco días después de la cirugía, quirúrgicos clips pueden eliminarse de la piel y el cáncer prostático puede ser analizada desde 8 semanas después. En general, este es un procedimiento rápido y eficiente, que tiene poco impacto en el ratón y permite mayor tumor sin comprometer el ratón.
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Protocolo
Este protocolo trata de un procedimiento quirúrgico en ratones de laboratorio. Todos los experimentos con animales deben ser revisados y aprobados por un cuidado institucional del Animal y el Comité uso (IACUC) individualmente. Como el enfoque se basa en la supervivencia y recuperación de animales, asegurar adecuada anestesia, manejo del dolor y un ambiente quirúrgico aséptico en todos los tiempos. Use una almohadilla de calefacción para prevenir la hipotermia durante la cirugía y hasta la recuperación de la anestesia.
1. a partir de consideraciones
- Dependiendo del virus usado, pueden aplicar requisitos de título diferentes; diluir el virus por consiguiente.
Nota: En este ejemplo, se inyecta un virus Adeno-asociado, diluido en PBS en un título de 1 x 1012 UI/mL. El virus tiene el serotipo 9 y contiene RNA guía Pten y expresión de la proteína de Cre bajo un promotor ubiquitina (figura 1). Pérdida de Pten aumentó pAKT y proliferación del epitelio prostático13. - Utilizar ratones machos en una edad de 8 semanas en el momento de la cirugía para asegurar el desarrollo adecuado de próstata.
Nota: Se muestra en este experimento de ratones son Rosa26-LSL-Cas9-EGFP knockin ratones C57BL/6J fondo12 (figura 1). - Recién prepare una mezcla de anestesia general y si es posible mantenerlo estéril.
Nota: Para mejor recuperación animal después de la cirugía, un antídoto de la anestesia es muy recomendable.- Para preparar un volumen total de 5 mL de anestésico, mezclar clorhidrato de medetomidina 0.15 mL (1 mg/mL), 0.4 mL midazolam (5 mg/mL) y butorfanol 0.25 mL (10 mg/mL) con 4,2 mL de agua salina estéril.
Nota: Pueden utilizarse métodos alternativos de anestesia, como isoflurano inhalable, según las directrices de cuidado institucional de los animales. - Para invertir el efecto de la poste-cirugía de hidrocloruro de medetomidina, mezclar atipamezole 0,1 mL (5 mg/mL) con 4,9 mL de agua salina estéril.
- Para preparar un volumen total de 5 mL de anestésico, mezclar clorhidrato de medetomidina 0.15 mL (1 mg/mL), 0.4 mL midazolam (5 mg/mL) y butorfanol 0.25 mL (10 mg/mL) con 4,2 mL de agua salina estéril.
- Prepare un ambiente aséptico quirúrgico adecuada desinfección y esterilización. Instrumentos quirúrgicos autoclave antes de su uso.
2. virus-entrega a la próstata murina
- Anestesiar el animal por la inyección intraperitoneal con una jeringa estéril de 1 mL y una aguja de 27 x ½". Utilizar una dosis de anestesia de 0.01 mL/g de peso corporal. Si el procedimiento dura más de 30 min, mantener la anestesia mediante la inyección de 1/3 de la a partir de la dosis cada 30 minutos.
- Examinar la profundidad anestésica mediante la evaluación de la relajación muscular y pedal retirada reflejos palpebrales. Cuando se observa pérdida de los reflejos, afeite la parte inferior del abdomen del animal.
- Cuidadosamente cubra los ojos del animal con ungüento oftálmico veterinaria utilizando un hisopo de algodón estéril para prevenir la ceguera debido a la falta de reflejo corneal.
- Limpie el abdomen depilado con 70% etanol y 10% de povidona yodada para la desinfección de la zona quirúrgica. Frote el área quirúrgico del centro de la zona quirúrgica hacia la periferia.
- Realizar una incisión vertical de piel en la línea media abdominal baja de aproximadamente 1 cm con una tijera quirúrgica estéril.
- Levantar el peritoneo mediante unas pinzas de punta fina para no dañar los órganos que están debajo. Cuidadosamente hacer una incisión de < 8 mm con tijeras quirúrgicas a través del peritoneo.
Nota: A diferencia de los humanos, glándula de la próstata de un roedor consta de cuatro lóbulos separados. El lóbulo anterior se une a la vesícula seminal. - Mueva suavemente el tejido adiposo a un lado para descubrir la vesícula seminal. Usando unas pinzas de anillo, levante cuidadosamente la vesícula seminal hasta la próstata anterior puede ser identificados (figura 1).
- Inyectar un volumen total de 30 μL solución de virus (3 x 1010 partículas virales) en el epitelio prostático anterior utilizando una jeringa de insulina de 0,5 mL con aguja 30 x 8 mm. Minimizar las fugas y garantizar que el líquido es absorbido dentro del tejido, formando una pequeña burbuja. Vuelva a colocar la vesícula seminal en la cavidad abdominal.
- La sutura del peritoneo con 2-3 suturas interrumpidos simple utilizando suturas absorbibles 6-0 y 13 mm, 3/8 círculo, una aguja de punto de forma cónica.
- Sujete con grapa la piel con 3 pinzas estériles 4.8 x 6.5 mm levantando la piel con pinzas para evitar dañar el peritoneo.
- Para la mejor recuperación, aplicar el antídoto de la anestesia en dosis de 0.01 mL/g de peso corporal por inyección intraperitoneal utilizando una jeringa estéril de 1 mL y una aguja de 27 x ½". Coloque con cuidado la espalda animal en su jaula.
3. después de la cirugía procedimientos
- Mantener la jaula con los ratones que experimentaron la cirugía sobre una almohadilla de calefacción durante 1 h después del procedimiento, para prevenir la hipotermia hasta que se recuperó completamente. Si se aplica el antídoto, el animal debe ser despierto unos minutos después de la inyección.
- Monitorear los animales diariamente indicaciones apropiadas herida curación y el dolor. Si es necesario, administrar analgésicos adicionales según las pautas de cuidado institucional de los animales.
- Eliminar clips de la piel después de 4-5 días, una vez que la herida se cierra.
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Resultados
Evaluar la distribución de virus a la próstata murina, analizaron muestras de tres meses después de la cirugía. Rosa26-LSL-Cas9-EGFP ratones12 expresan GFP en células que han sido expuestos a la proteína de Cre expresada por el virus. Las muestras de la próstata fueron examinadas con un microscopio de fluorescencia para identificar áreas con señal de GFP (figura 2A). La señal GFP indica actividad Cre en el epitelio de la próstata pero ...
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Discusión
En este protocolo, se describe un método para alterar la expresión génica en el lóbulo anterior de la próstata murina por inyección de virus, creando un poderoso nuevo modelo de ratón para cáncer de próstata (figura 2). La administración exitosa de un Adenovirus primero fue descrita por Leow et en 20058. Anteriormente hemos mostrado cómo un Adenovirus que codifica para una proteína del recombinase de Cre puede substituir cruces desperdiciadora de tiempo de un...
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Señor fue financiado por una beca de la sociedad danesa del cáncer (R146-A9394-16-S2). MFB y MKT fueron financiados por AUFF NOVA (AUFF-E-2015-FLS-9-8). Señor y MFB fueron financiado por la escuela de postgrado, salud, AU. El laboratorio E.F.W. es apoyado por becas del Ministerio de economía (SAF2015-70857, cofinanciado por el FEDER de la UE) y una ERC advanced grant (741888 - CSI-Fun).
Queremos agradecer a Liliana Fajardo Mellor (Genes, desarrollo y enfermedad; Centro Nacional de investigación de cáncer) para la lectura crítica del manuscrito.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Equipo | |||
| B6J.129(B6N)-Gt(ROSA)26Sortm1(CAG-cas9*,-EGFP)Fezh/J | ratones The Jackson Laboratory | 26175 | |
| 0,5 ml Jeringa de insulina U-100 | BD 324825 | para inyección de virus | |
| Jeringa de 1 ml | BD | 300013 | para inyección de anestesia |
| 30 G 1/2' ' aguja | BD | 304000 | para inyección de anestesia |
| 6-0 Sutura Polysorb | Medtronic | GL889 | para cerrar el peritoneo |
| Cortina de cirugía esterilizada desechable | múltiples proveedores | ||
| Almohadilla térmica | múltiples proveedores | ||
| Povidona-Yodo Almohadilla de preparación | Fisher Scientific | 06-669-70 | |
| Recorte máquina | Aesculap | GT415 | para afeitar el abdomen |
| Pinzas Dumont | F.S.T | 11252-00 | |
| Halsey Micro Portaagujas | F.S.T | 12500-12 | |
| Tijeras de iris | F.S.T | 14094-11 | |
| Pinza de patrón estrecho | F.S.T | 11002-12 | |
| Pinzas de anillo | F.S.T | 11106-09 | |
| Mango del sistema de pinzas para heridas incl. clips | F.S.T | 12030-01 | para cerrar la piel |
| Removedor del sistema de pinzas para heridas | F.S.T | 12030-04 | |
| Microscopio | Leica | han utilizado diferentes modelos | |
| Reagents | |||
| 1x PBS | Gibco | 10010-023 | |
| Antisedan | obtenido del animalario | ||
| Butorfanol | obtenido del animalario | ||
| Medetomidinaclorhidrato | obtenido del animalario | ||
| Midazolam | obtenido del animalario | ||
| 100% etanol | Fisher Scientific | 22-032-103 | |
| Pomada ocular | Takeda | 7242 | |
| Virus (AAV, AV) | múltiples proveedores | virus utilizado en este protocolo es un | |
| anticuerpo pAKT | CST | 4060 | utilizado 1:200 dillution |
| GFP anitbody | CST | 2956 | utilizado 1:100 dillution |
Referencias
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Reimpresiones y permisos
