Este protocolo describe un método nuevo para la entrega del virus a la próstata murina. Usando tecnología CRISPR/Cas9, sobreexpresión del gen o entrega del recombinase de Cre, la técnica permite orthotopic alteración de la expresión génica e implementa un modelo novedoso ratón para cáncer de próstata.
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Artículo de método
Virus de la entrega de guías CRISPR para la próstata murina por alteración del gen
En este artículo
Resumen
Resumen
Con una incidencia creciente del cáncer de próstata, identificación de nuevos controladores de tumor o moduladores es crucial. Modelos de ratón modificados genéticamente (GEMM) para cáncer de próstata se ven obstaculizados por la heterogeneidad del tumor y su dinámica compleja de la microevolución. Modelos de ratón de cáncer de próstata tradicionales incluyen, entre otros, del germline y nocauts condicionales, la expresión transgénica de oncogenes y modelos de xenoinjerto. Generación de mutaciones de novo en estos modelos es complejo, lento y costoso. Además, la mayoría de los modelos tradicionales de destino la mayoría del epitelio prostático, mientras que el cáncer de próstata humano es bien sabido evolucionar como un evento aislado en sólo un pequeño subconjunto de células. Modelos valiosos deben simular no sólo iniciación del cáncer de próstata, pero también la progresión a enfermedad avanzada.
Aquí se describe un método para atacar algunas células en el epitelio de la próstata las células transductoras de partículas virales. La entrega de un virus dirigido a la próstata murina permite la alteración de la expresión génica en el epitelio de la próstata. Cantidad y tipo de virus por este medio definirá el número de células específicas de alteración genética por transducción de algunas células para la iniciación del cáncer y muchas células para la terapia génica. A través de inyección basados en cirugía en el lóbulo anterior, distal de la vía urinaria, el tumor en este modelo puede ampliarse sin deteriorar la función urinaria del animal. Además, dirigiéndose a sólo un subconjunto de células epiteliales prostáticas la técnica permite expansión clonal del tumor y por lo tanto imita la iniciación del tumor humano, progresión, así como invasión a través de la membrana basal.
Esta novedosa técnica ofrece un modelo de cáncer de próstata de gran alcance con mayor relevancia fisiológica. Sufrimiento de los animales es limitado, y ya no cría adicional se requiere, en general animal cuenta se reduce. Al mismo tiempo, se aceleraron el análisis de nuevos genes candidatos y vías, que a su vez es más rentable.
Introducción
Detección y tratamiento del cáncer de próstata han mejorado significativamente durante la última década. Aún así, la incidencia de cáncer de próstata está aumentando, a raíz de la esperanza de vida. Con un estimado 1,1 millones nuevos casos en todo el mundo, es una de las causas más comunes de muerte relacionada con cáncer en los hombres 1. El cáncer de próstata es lento en su desarrollo, pero cuando el cáncer ha progresado a un estado metastásico avanzado, el pronóstico es pobre debido a las opciones de tratamiento limitadas. Hasta ahora, sólo unos pocos genes se han identificado como controladores comunes de este cáncer, y su heterogeneidad y....
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Protocolo
Este protocolo trata de un procedimiento quirúrgico en ratones de laboratorio. Todos los experimentos con animales deben ser revisados y aprobados por un cuidado institucional del Animal y el Comité uso (IACUC) individualmente. Como el enfoque se basa en la supervivencia y recuperación de animales, asegurar adecuada anestesia, manejo del dolor y un ambiente quirúrgico aséptico en todos los tiempos. Use una almohadilla de calefacción para prevenir la hipotermia durante la cirugía y hasta la recuperación de la anestesia.
1. a partir de consideraciones
- Dependiendo del virus usado, pueden aplicar requisitos de título diferentes; dilui....
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Resultados
Evaluar la distribución de virus a la próstata murina, analizaron muestras de tres meses después de la cirugía. Rosa26-LSL-Cas9-EGFP ratones12 expresan GFP en células que han sido expuestos a la proteína de Cre expresada por el virus. Las muestras de la próstata fueron examinadas con un microscopio de fluorescencia para identificar áreas con señal de GFP (figura 2A). La señal GFP indica actividad Cre en el epitelio de la próstata pero .......
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Discusión
En este protocolo, se describe un método para alterar la expresión génica en el lóbulo anterior de la próstata murina por inyección de virus, creando un poderoso nuevo modelo de ratón para cáncer de próstata (figura 2). La administración exitosa de un Adenovirus primero fue descrita por Leow et en 20058. Anteriormente hemos mostrado cómo un Adenovirus que codifica para una proteína del recombinase de Cre puede substituir cruces desperdiciadora de tiempo de un.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Señor fue financiado por una beca de la sociedad danesa del cáncer (R146-A9394-16-S2). MFB y MKT fueron financiados por AUFF NOVA (AUFF-E-2015-FLS-9-8). Señor y MFB fueron financiado por la escuela de postgrado, salud, AU. El laboratorio E.F.W. es apoyado por becas del Ministerio de economía (SAF2015-70857, cofinanciado por el FEDER de la UE) y una ERC advanced grant (741888 - CSI-Fun).
Queremos agradecer a Liliana Fajardo Mellor (Genes, desarrollo y enfermedad; Centro Nacional de investigación de cáncer) para la lectura crítica del manuscrito.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Equipo | |||
| B6J.129(B6N)-Gt(ROSA)26Sortm1(CAG-cas9*,-EGFP)Fezh/J | ratones The Jackson Laboratory | 26175 | |
| 0,5 ml Jeringa de insulina U-100 | BD 324825 | para inyección de virus | |
| Jeringa de 1 ml | BD | 300013 | para inyección de anestesia |
| 30 G 1/2' ' aguja | BD | 304000 | para inyección de anestesia |
| 6-0 Sutura Polysorb | Medtronic | GL889 | para cerrar el peritoneo |
| Cortina de cirugía esterilizada desechable | múltiples proveedores | ||
| Almohadilla térmica | múltiples proveedores | ||
| Povidona-Yodo Almohadilla de preparación | Fisher Scientific | 06-669-70 | |
| Recorte máquina | Aesculap | GT415 | para afeitar el abdomen |
| Pinzas Dumont | F.S.T | 11252-00 | |
| Halsey Micro Portaagujas | F.S.T | 12500-12 | |
| Tijeras de iris | F.S.T | 14094-11 | |
| Pinza de patrón estrecho | F.S.T | 11002-12 | |
| Pinzas de anillo | F.S.T | 11106-09 | |
| Mango del sistema de pinzas para heridas incl. clips | F.S.T | 12030-01 | para cerrar la piel |
| Removedor del sistema de pinzas para heridas | F.S.T | 12030-04 | |
| Microscopio | Leica | han utilizado diferentes modelos | |
| Reagents | |||
| 1x PBS | Gibco | 10010-023 | |
| Antisedan | obtenido del animalario | ||
| Butorfanol | obtenido del animalario | ||
| Medetomidinaclorhidrato | obtenido del animalario | ||
| Midazolam | obtenido del animalario | ||
| 100% etanol | Fisher Scientific | 22-032-103 | |
| Pomada ocular | Takeda | 7242 | |
| Virus (AAV, AV) | múltiples proveedores | virus utilizado en este protocolo es un | |
| anticuerpo pAKT | CST | 4060 | utilizado 1:200 dillution |
| GFP anitbody | CST | 2956 | utilizado 1:100 dillution |
Referencias
- Ferlay, J., et al. Cancer incidence and mortality worldwide: sources, methods and major patterns in GLOBOCAN 2012. Int J Cancer. 136, E359-E386 (2015).
- Gerlinger, M., et al. Intratumor heterogeneity and branched evoluti....
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Reimpresiones y permisos
