Se requiere una suscripción a JoVE para ver este contenido. Inicie sesión o comience su prueba gratuita.

Artículo de método

Culturas Organotypic tridimensionales de órganos sensoriales vestibulares y auditivas

7.7K vistas

⸱

DOI:

10.3791/57527

⸱

1 de junio de 2018

 ,  , 
1Department of Stem Cell Biology and Regenerative Medicine, Keck School of Medicine of the University of Southern California, 2Caruso Department of Otolaryngology-Head and Neck Surgery, Keck School of Medicine of the University of Southern California, 3Howard Hughes Medical Institute and Laboratory of Sensory Neuroscience, The Rockefeller University

En este artículo

Resumen

Culturas organotypic tridimensional del utrículo murino y cóclea en ópticamente claro colágeno geles preservar tejido natural morfología, permiten estimulación mecánica mediante ajuste de la rigidez de la matriz y permitan de genes mediada por virus.

Resumen

Los órganos sensoriales del oído interno son desafiantes para estudiar en los mamíferos debido a su inaccesibilidad a la manipulación experimental y observación óptica. Por otra parte, aunque las técnicas de cultivo existentes permiten perturbaciones bioquímicas, estos métodos no proporcionan un medio para estudiar los efectos de fuerza mecánica y rigidez del tejido durante el desarrollo de los órganos sensoriales del oído interno. Aquí se describe un método de cultura organotypic tridimensional del utrículo murino intacto y cóclea que supera estas limitaciones. La técnica para el ajuste de una rigidez de la matriz tridimensional que se describe aquí permite la manipulación de la fuerza elástica contra crecimiento del tejido. Por lo tanto, este método puede utilizarse para estudiar el papel de las fuerzas mecánicas durante el desarrollo del oído interno. Además, las culturas permiten entrega de genes mediada por virus, que puede ser utilizada para experimentos de ganancia y pérdida de función. Este método de cultivo conserva innata de las células ciliadas y las células y sirve como una alternativa potencialmente superior a la tradicional cultura bidimensional de órganos sensoriales vestibulares y auditivos.

Introducción

El estudio de la mayoría de los aspectos del desarrollo del órgano de los mamíferos ha sido facilitado por sistemas in vitro . Ahora se utilizan dos métodos principales para el cultivo de órganos sensoriales vestibulares: flotante1 y adherente2 preparados. Ambos métodos permiten la investigación de la célula de pelo vulnerabilidades3 regeneración1,4 y in vitro. Además, el papel del desarrollo de la muesca5,67,de Wnt8y factor de crecimiento epidérmico receptor (EGFR)9,10 señalización cascadas en el oído interno tiene se ha establecido, en parte, mediante el uso de cultivos en vitro de epitelio sensorial. Sin embargo, se controlan la diferenciación y crecimiento celular, no sólo a través de la señalización por morfógenos, sino también a través de estímulos físicos y mecánicos como contactos intercelulares, la rigidez de la matriz extracelular y mecánicos de estiramiento o constricción. El papel de tales estímulos mecánicos es un desafío para investigar en el desarrollo del oído interno en vivo. Por otra parte, los métodos existentes de cultura libre-flotación y adherentes no son adecuados para estos estudios in vitro. Aquí describimos un método de cultura organotypic tridimensional de colágeno geles de rigidez variable. En gran parte, este método conserva la arquitectura en vivo de los órganos sensoriales vestibulares y cocleares y permite la investigación de los efectos de la fuerza mecánica en el crecimiento y la diferenciación11.

Debido a estímulos mecánicos son conocidos para activar eventos moleculares posteriores, como el hipopótamo señalización vía12,13,14,15, es importante ser capaz de combinar la estimulación mecánica con manipulaciones bioquímicas y genéticas. El método de cultivo que se describe aquí permite la entrega de genes mediada por virus y puede ser utilizado para el estudio de mecánicos y moleculares de señalización durante el desarrollo de oído interno11.

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Protocolo

Todos los métodos aquí descritos han sido aprobados por el cuidado Animal y comités de uso de la Universidad de Rockefeller y de la Universidad de California del sur.

1. (opcional) preparación del colágeno I solución de tendones Mouse-tail

Nota: Colágeno las soluciones están disponibles comercialmente. Siga las instrucciones del fabricante para la preparación del gel.

  1. Eutanasia a ratones del adulto joven (3-5 semanas) de 5-10 de cualquier cepa de tipo salvaje con dióxido de carbono según el protocolo aprobado por el Comité de uso y cuidado institucional del Animal relevantes16. Recoger las colas y desinfectar sumergiendo en etanol al 70% durante un mínimo de 4 h a temperatura ambiente.
    Nota: Incubación por más de 48 h debe evitarse, ya que resulta en deshidratación excesiva del tejido y dificulta el proceso de extracción del tendón.
  2. Retire la piel de cada cola introduciendo un corte longitudinal con una hoja de bisturí y retrayendo la piel todo con pinzas. Transferencia de las colas sin piel en un plato de Petri de 100 mm lleno de etanol al 70% limpio y cortado en segmentos de 10 mm.
    Nota: Desechar las partes más finas de las colas, que son difíciles de manipular.
  3. Con unas pinzas, Asegure cada segmento de la cola a la parte inferior de la caja Petri y usar un segundo par de Pinzas finas para extraer los tendones de la cola una a la vez. Las fibras individuales del tendón deberán surgir con resistencia mínima.
    Nota: Fórceps #5 viejo, sordo funcionan bien para este paso.
  4. Preparar 100 mL de una solución al 0.1% (por volumen) de ácido acético en agua estéril grado molecular y añadir 10 mL de esta solución a un plato de Petri de 100 mm estériles. Transferir los tendones a la placa de Petri y dejar durante 1 hora a temperatura ambiente para desnaturalizar el colágeno I.
  5. Utilice una tijera estéril de bisturí o iridectomía con puntas romas, curva para picar el tendón en fragmentos de 1-2 mm. Transferir los tendones picaditos a un tubo estéril de 50 mL y Añadir ácido acético al 0.1% para llevar el volumen a 50 mL.
    Nota: Utilice cuatro o cinco colas por cada 50 mL de ácido para lograr un colágeno concentración de 2.0-2.5 mg/mL.
  6. Refrigere el colágeno solución a 4 ° C durante un mínimo de 48 h para facilitar la desnaturalización de la proteína completa. Vortex con un vórtex mesa situado a la máxima velocidad durante 1 minuto dos veces al día.
  7. Medir la concentración de la solución usando el análisis de ácido bicinchoninic, ajustar el colágeno I concentración a 2.0-2.5 mg/mL mediante la adición de solución al 0.1% de ácido acético y almacenar a 4 ° C.
    Nota: Colágeno solución se puede conservar por uno o dos años.
  8. (Opcional) Centrifugue el colágeno solución a 2.000 x g durante 1 h a 4 ° C y usar geles de la fracción superior translúcida (aproximadamente de la mitad del volumen), para conseguir colágeno ópticamente claro en la sección 4.

2. disección de los órganos vestibulares y auditivas

  1. Eutanasia a ratones embarazadas de cualquier tensión con dióxido de carbono según el protocolo aprobado por el Comité de uso y cuidado institucional del Animal relevantes16. Extraer y decapitar a los embriones.
    Nota: Lfng CreERT2/tdTomato ratones pueden usarse para permitir el etiquetado permanente de apoyar a las células a la exposición 4-hydroxytamoxifen17.
  2. Esterilizar todos los superficies de trabajo e instrumentos de disección, incluyendo dos pares de #5 pinzas y cuchillo pelo18, limpiar con etanol al 70%.
  3. Dividir cada cabeza en dos mitades mediante la introducción de un corte longitudinal con una hoja de bisturí estéril o con dos pares de pinzas #5. Extraer los huesos temporales, que contienen los oídos interno19y colocarlos en 15 mL de solución salina equilibrada fría de Hank (HBSS) en caja Petri de 60 mm. Mantener el plato en el hielo.
    Nota: Embriones en una serie de etapas desde E13.5 E18.5 se han utilizado con éxito.
  4. (Opcional) Lavar los oídos interno agitando suavemente les en un tubo cónico de 50 mL que contenga 30 mL helado HBSS y reemplazar la HBSS tres o cuatro veces. Mantenga el tubo en hielo.
    Nota: Este paso limita la posible contaminación de la cultura de tejido y lleva rápidamente la temperatura a 4 ° C, que impide que el tejido la degradación y la muerte celular.
  5. Usando dos pares de Pinzas finas para #5, separar las orejas del interior del hueso temporal y transferir las orejas, tres o cuatro a la vez, en un plato de Petri de 60 mm con HBSS helada.
  6. Disecar los órganos sensoriales vestibulares.
    1. Orientar el lado medial de la orejas para arriba y busque el utrículo. Con dos pares de pinzas #5, quitar el cartílago que rodea los órganos vestibulares. Suavemente separa el nervio vestibular, la conexión entre el utrículo y el sáculo y los canales semicirculares, como se muestra en la figura 1. Tire el utrículo y el ámpula adjunta de los canales semicirculares superiores y horizontales de la oreja.
      Nota: Este método puede utilizarse en interior de etapas E16.5 - E18.5. Preservar los fragmentos de cartílago para la sección 3 más abajo.
  7. Diseccionar la cóclea.
    1. Retire el tejido cartilaginoso que rodea el órgano de la audición con dos pares de pinzas #5. Suavemente separa la conexión entre la base coclear y el sáculo, como se muestra en la figura 1.
      Nota: Para etapas E13.5 - E14.5, suavizan el cartílago antes de la disección por el tratamiento interno oídos con colagenasa 0.25% I en solución salina tamponada con fosfato (PBS) por 5 min a temperatura ambiente. Preservar los fragmentos de cartílago para la sección 3 más abajo.
  8. Utilizando una pipeta de 200 μL cabido con una punta ancha antiadherente, transferir a un plato de Petri de 30 mm con medio de cultivo compuesto por DMEM/F12 suplementado con 33 mM DGlucosa, bicarbonato de sodio de 19 mM, 15 mM 4(2hydroxyethyl) - el utricles y cócleas 1piperazineethanesulfonic ácido (HEPES), glutamina 1 mM, nicotinamida de 1 mM, 20 mg/L factor de crecimiento epidérmico, factor de crecimiento fibroblástico de 20 mg/L, 10 mg/L insulina, transferrina de 5.5 mg/L y selenito de sodio de 5 μg/L.
  9. Mantener los preparativos del utrículo de hasta 3 h a 37 ° C en una incubadora de cultivo de tejidos gaseada con 5% de dióxido de carbono para permitir la cicatrización de los cortes en el epitelio introducidas durante la disección. Preparaciones de cóclea deben ser transferidas al gel de colágeno 10 min después de la disección.
    Nota: Ya que la disección se realiza en HBSS helada, no hay ninguna necesidad de precalentar el medio de cultivo a 37 ° C.

3. (opcional) ajuste colágeno Gel rigidez mediante la adición de concentraciones variables de condrocitos

Nota: Fue modificado el método para el aislamiento de condrocitos de Gosset et al. 20

  1. Preparar una solución de 1% de colagenasa en estéril 1 x PBS y tienda 100-200 μL partes alícuotas a-80 ° C. Descongela el hielo cuando sea necesario, evitando múltiples ciclos de hielo-deshielo.
  2. Uso finas pinzas para recoger los pedazos de cartílago de la disección de los órganos vestibulares y auditivos de 10-12 orejas. Tejidos conectivos y del oído interno separados del cartílago. El cartílago de la transferencia a un plato de Petri de 30 mm y añadir 300 μL de medio de cultivo estéril.
  3. Utilice unas tijeras de hoja o iridectomía estéril de bisturí con puntas romas y curvadas para picar el tejido para lograr piezas de cartílago aproximadamente 0,5 mm de longitud.
  4. Añadir colagenasa I al medio con cartílago para lograr una concentración de la enzima final del 0,25%. Transferir el plato a una incubadora de cultivo de tejidos a 37 ° C gas 5% dióxido de carbono. Pipeta vigorosamente utilizando una pipeta de 1000 μl cada 20 min hasta pedazos de cartílago se disocian y no son distinguibles en la solución, luego incubar un 20 minutos adicionales.
    Nota: En el caso de las preparaciones del utrículo, aislamiento de condrocitos se puede realizar en el paso 2.9; tarda aproximadamente 2 horas (3-4 rondas de pipeteo).
  5. Recoge la suspensión de células en un tubo cónico de 15 mL y ajustar el volumen a 10 mL con PBS estéril 1 x. Centrifugar a 800 x g durante 5 min a 4 ° C. Quite el sobrenadante y resuspender las células en 10 mL de PBS estéril 1 x. Centrifugue a 800 x g durante 5 min a 4 ° C y eliminar el sobrenadante.
    Nota: Es importante lavar las células dos veces; cualquier restante colagenasa que digiero el colágeno que gel.
  6. Utilizando una pipeta de 200 μL, añada 100 μl de medio de cultivo al pellet celular y pipetee suavemente para resuspender. Contar las células usando un hemocitómetro y mantenerlas en antes hielo.
  7. Para aumentar la rigidez del gel, agregar condrocitos para el colágeno neutralizado gel solución (sección 1) y mezclar rápidamente para distribuir las células en el gel antes de la solidificación.
    Nota: El módulo de elasticidad del colágeno (una medida de la rigidez) del gel, aumenta linealmente con el número de condrocitos agregó11. La relación es descrita por la función lineal determinada experimentalmente E = 206· NC + 15, en la que E es el módulo elástico en pascales y Nc es el número de condrocitos en millones. Para un protocolo detallado para gel medidas de rigidez consulte el original artículo11.

4. Coloque el órgano sensorial Vestibular o auditivo en un colágeno que gel

  1. En un tubo de 1,5 mL estéril, preparación de colágeno I solución de polimerización mediante la mezcla de 160 μl de PBS de x 10 con indicador de pH rojo de fenol, 133 μl 0,34 M de hidróxido de sodio, 70 μl 0,9 M de bicarbonato de sodio y 40 μl de 1 M HEPES. Mantenga el tubo en hielo.
    Nota: Esta receta proporciona la solución de polimerización necesaria para preparar 2 mL de colágeno gel, pero puede ampliarse según sea necesario.
  2. Mezclar 100 μl de solución de polimerización y 400 μL de colágeno I solución sobre hielo transfiriendo suavemente hacia arriba y hacia abajo en un tubo de 1,5 mL refrigerado. Para aumentar la rigidez del gel, agregar 50 μl de medio de cultivo que contiene condrocitos y mezclar suavemente como se describe en la sección 3.
  3. Transferir 500 μl del colágeno neutralizado solución a un plato de Petri de 30 mm enfriada con un relleno de fondo de cristal de 10 mm o a un pozo de una placa de la pozo cuatro.
    Nota: Es fundamental guardar todos los reactivos en el hielo para evitar una polimerización rápida y desigual del colágeno I.
  4. Transferir rápidamente las cócleas o utricles al colágeno neutralizado solución y ajustar los órganos a la posición deseada con un pelo estéril cuchillo18 o un par de Pinzas finas.
    Nota: Colágeno la polimerización se hace perceptible después de 1-2 min como la solución se vuelve turbia.
  5. Después de la solución alrededor del tejido ha polimerizado, coloque el plato de Petri o la placa de la pozo cuatro por 20 min a 37 ° C en una incubadora de cultivo de tejidos gaseada con 5% de dióxido de carbono para asegurar la polimerización completa.
  6. Añadir 3 mL de medio de cultivo suplementado con suero bovino fetal (FBS) de 0,5% por caja de Petri o 500 μl del mismo medio por pozo de una placa de la pozo cuatro. Mantener el cultivo a 37 ° C en una incubadora de cultivo de tejidos gaseada con 5% de dióxido de carbono. Si lo desea, complementar el medio de cultivo con 10 μm 5-ethynyl-2´-desoxiuridina (EdU) para etiquetar las células proliferantes.
    Nota: Concentraciones más altas de FBS se pueden utilizar si se desea.

5. virales inyecciones en cultivos tridimensionales de órganos sensoriales vestibulares y auditivos

  1. Descongelar el virus deseado en el hielo y mezclar con solución de azul tripán en un tubo cónico de 0,5 mL para alcanzar una concentración del tinte final de 0.05%. Utilizar tintura de 10-20 x para evitar la dilución sustancial del virus. Mantener en hielo.
    Nota: Adenovirus serotipo 5 trabajos mejores para infectar células de soporte en el utrículo19, mientras que virus adeno-asociado Anc80 puede infectar las células de pelo y células de apoyo en el utrículo y la cóclea21.
  2. Romper la punta de una aguja de vidrio preparada en un tirador de la micropipeta con pinzas limpias bien observando en el máximo aumento de un binocular microscopio de disección.
    Nota: Es importante optimizar la configuración del extractor de aguja. Agujas con caña del 9 - 12 mm y 20 - 30 μm aberturas funcionan mejor.
  3. Eliminar la cultura de una órgano sensorial de la incubadora. Conecte la aguja a la microinyectora y rellene con 2-3 μl de mezcla de tinte y virus. Avanzar la aguja en el órgano sensorial mientras observa con binoculares microscopio de disección.
  4. Conduce suavemente la punta de la aguja a través de capas epiteliales y mesenquimales de la azotea de una cultura utricular tridimensional. Inyectar la mezcla viral hasta llenan las cavidades del utrículo y ámpula con colorante azul.
    Nota: Ya que permite fácil acceso a los órganos sensoriales, un plato de Petri de fondo de cristal de 10 mm es óptimo para las inyecciones.
  5. Incubar a 37 ° C en una incubadora de cultivo de tejidos gaseada con 5% de dióxido de carbono.
    Nota: Cuando la proteína fluorescente verde o roja es utilizada en la estructura viral, la fluorescencia es evidente 24 h después de transducción viral.

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Resultados

Órganos sensoriales vestibulares y auditivos de oídos embrionarios, cultivadas en 40 Pa colágeno geles mímico rigidez bajo condiciones embrionarias11, retener relativamente normales estructuras tridimensionales (figura 1) y mantener las células de pelo y apoyo a las células (figura 2 y figura 3). Aunque apoyo la densidad celular disminuye en más del 30% (prueba tde St...

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Discusión

Las señales moleculares que medie crecimiento y la diferenciación en el oído interno durante el desarrollo se han estudiaron extensivamente5,6,7,8,9,10. Sin embargo, la evidencia obtenida desde el sistema utricular modelo sugiere que señales mecánicas, detectados a través de uniones celulares y la activación de la señalizació...

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Agradecemos a Dr. A. Jacobo, Dr. J. Salvi y Petelski A. por sus contribuciones a la investigación original en que se basa este protocolo. También agradecemos a Llamas J. y W. Makmura asistencia técnica y agricultura animal. Reconocemos la beca de formación de NIDCD T32 DC009975, NIDCD conceder R01DC015530, Fondo de desarrollo terapéutico de Robertson y la Fundación de la familia Caruso para la financiación. Finalmente, reconocemos el apoyo del Instituto médico de Howard Hughes, que es un investigador Dr. Hudspeth.

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
#10 Cuchillas quirúrgicasMiltex4-110
#5 PinzasDumont11252-20
Placa de Petri de 100 mmSigmaP5856-500EA
250 uL puntas de pipeta de orificio grandeUSA Scientific1011-8406
Placa de Petri con fondo de vidrio de 30 mmMatsunami Glass USA CorporationD35-14-1.5-U
4 pocillos placaThermo Fisher Scientific176740
4-Hidroxitamoxifeno SigmaH7904
60  mm Placa de PetriThermo Fisher Scientific123TS1
Ácido acético Sigma537020
Ad-GFPVector Biolabs1060
Anti-GFP, fracción IgY de polloInvitrogenA10262 
Anti-Myo7AProteus Biosciences25-6790
Anticuerpo anti-Sox2 (Y-17)Santa Cruzsc-17320
Ensayo de ácido bicinconínicoThermo Fisher Scientific23225
Click-iT EdU Alexa Fluor 647 Kit de imágenesThermo Fisher ScientificC10340
Colagenasa IGibco17100017
D-glucosaSigmaG8270
DMEM/F12 Gibco11320033
Factor de crecimiento epidérmicoSigmaE9644
Suero fetal bovino (FBS)Thermo Fisher Scientific16140063
Factor de crecimiento de fibroblastosSigmaF5392
Tirador de micropipetas Flaming/BrownSutter InstrumentP-97
GlutaminaSigmaG8540
HBSSGibco14025092
Hemocitómetro DaiggerEF16034F
HEPESSigmaH4034
InsulinaSigmaI3536
Tijeras de iridictomía Zepf Instrumentos Médicos08-1201-10   
MicroinyectorNarishigeIM-6
NicotinamidaSigma N0636
PBS (10X), pH 7.4Gibco70011044
PBS (1X), pH 7.4Gibco10010023
Rojo de Fenol Indicador de pH SigmaP4633 
Etanol puro, 200 pruebas Decon Labs 2716
RFP anticuerpoChromoTek  5F8
Bicarbonato de sodioSigmaS5761
Hidróxido de sodioSigmaS8045
Selenito de sodioSigmaS5261
Vórtice de sobremesa VWR97043-562
TransferrinSigmaT8158
Azul tripano SigmaT6146

Referencias

  1. Oesterle, E. C., Tsue, T. T., Reh, T. A., Rubel, E. W. Hair-cell regeneration in organ cultures of the postnatal chicken inner ear. Hear Res. 70 (1), 85-108 (1993).
  2. Meyers, J. R., Corwin, J. T. Shape change controls supporting cell proliferation in lesioned mammalian balance epithelium. J Neurosci Off J Soc Neurosci. 27 (16), 4313-4325 (2007).
  3. Cunningham, L. L. The adult mouse utricle as an in vitro preparation for studies of ototoxic-drug-induced sensory hair cell death. Brain Res. 1091 (1), 277-281 (2006).
  4. Warchol, M. E., Lambert, P. R., Goldstein, B. J., Forge, A., Corwin, J. T. Regenerative proliferation in inner ear sensory epithelia from adult guinea pigs and humans. Science. 259 (5101), 1619-1622 (1993).
  5. Lin, V., Golub, J. S., Nguyen, T. B., Hume, C. R., Oesterle, E. C., Stone, J. S. Inhibition of Notch activity promotes nonmitotic regeneration of hair cells in the adult mouse utricles. J Neurosci Off J Soc Neurosci. 31 (43), 15329-15339 (2011).
  6. Wu, J., et al. Co-regulation of the Notch and Wnt signaling pathways promotes supporting cell proliferation and hair cell regeneration in mouse utricles. Sci Rep. 6, 29418(2016).
  7. Chai, R., et al. Wnt signaling induces proliferation of sensory precursors in the postnatal mouse cochlea. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (21), 8167-8172 (2012).
  8. Wang, T., et al. Lgr5+ cells regenerate hair cells via proliferation and direct transdifferentiation in damaged neonatal mouse utricle. Nat Commun. 6, 6613(2015).
  9. Doetzlhofer, A., White, P. M., Johnson, J. E., Segil, N., Groves, A. K. In vitro growth and differentiation of mammalian sensory hair cell progenitors: a requirement for EGF and periotic mesenchyme. Dev Biol. 272 (2), 432-447 (2004).
  10. White, P. M., Stone, J. S., Groves, A. K., Segil, N. EGFR signaling is required for regenerative proliferation in the cochlea: conservation in birds and mammals. Dev Biol. 363 (1), 191-200 (2012).
  11. Gnedeva, K., Jacobo, A., Salvi, J. D., Petelski, A. A., Hudspeth, A. J. Elastic force restricts growth of the murine utricle. eLife. 6, (2017).
  12. Aragona, M., et al. A mechanical checkpoint controls multicellular growth through YAP/TAZ regulation by actin-processing factors. Cell. 154 (5), 1047-1059 (2013).
  13. Dong, J., et al. Elucidation of a universal size-control mechanism in Drosophila and mammals. Cell. 130 (6), 1120-1133 (2007).
  14. Low, B. C., Pan, C. Q., Shivashankar, G. V., Bershadsky, A., Sudol, M., Sheetz, M. YAP/TAZ as mechanosensors and mechanotransducers in regulating organ size and tumor growth. FEBS Lett. 588 (16), 2663-2670 (2014).
  15. Zhao, B., et al. Inactivation of YAP oncoprotein by the Hippo pathway is involved in cell contact inhibition and tissue growth control. Genes Dev. 21 (21), 2747-2761 (2007).
  16. AVMA Guidelines for the Euthanasia of Animals: 2013 Edition. , (2013).
  17. Semerci, F., et al. Lunatic fringe-mediated Notch signaling regulates adult hippocampal neural stem cell maintenance. eLife. 6, (2017).
  18. Tuan, R. S., Lo, C. W. Developmental biology protocols. Methods in molecular biology. , Humana Press. Totowa, N.J. 137(2000).
  19. Brandon, C. S., Voelkel-Johnson, C., May, L. A., Cunningham, L. L. Dissection of adult mouse utricle and adenovirus-mediated supporting-cell infection. J Vis Exp JoVE. (61), (2012).
  20. Gosset, M., Berenbaum, F., Thirion, S., Jacques, C. Primary culture and phenotyping of murine chondrocytes. Nat Protoc. 3 (8), 1253-1260 (2008).
  21. Landegger, L. D., et al. A synthetic AAV vector enables safe and efficient gene transfer to the mammalian inner ear. Nat Biotechnol. 35 (3), 280-284 (2017).
  22. Burns, J. C., et al. Reinforcement of cell junctions correlates with the absence of hair cell regeneration in mammals and its occurrence in birds. J Comp Neurol. 511 (3), 396-414 (2008).
  23. Wang, J., et al. Regulation of polarized extension and planar cell polarity in the cochlea by the vertebrate PCP pathway. Nat Genet. 37 (9), 980-985 (2005).
  24. Chacon-Heszele, M. F., Ren, D., Reynolds, A. B., Chi, F., Chen, P. Regulation of cochlear convergent extension by the vertebrate planar cell polarity pathway is dependent on p120-catenin. Dev Camb Engl. 139 (5), 968-978 (2012).
  25. Yamamoto, N., Okano, T., Ma, X., Adelstein, R. S., Kelley, M. W. Myosin II regulates extension, growth and patterning in the mammalian cochlear duct. Dev Camb Engl. 136 (12), 1977-1986 (2009).
  26. Tada, M., Heisenberg, C. -P. Convergent extension: using collective cell migration and cell intercalation to shape embryos. Dev Camb Engl. 139 (21), 3897-3904 (2012).

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Reimpresiones y permisos

Etiquetas

Cultivo organot pico tridimensionalrganos vestibulares murinosrganos auditivos murinosgel de col geno tipo unoentrega viral de genesajuste de la rigidez tisulardesarrollo del o do internopreservaci n de las c lulas ciliadasan lisis de las c lulas de soporteim genes de microscop a confocal
Culturas Organotypic tridimensionales de órganos sensoriales vestibulares y auditivas
Contáctenos
Recomendar a la biblioteca

Privacidad

Condiciones de uso

Políticas

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Todos los derechos reservados.