Culturas organotypic tridimensional del utrículo murino y cóclea en ópticamente claro colágeno geles preservar tejido natural morfología, permiten estimulación mecánica mediante ajuste de la rigidez de la matriz y permitan de genes mediada por virus.
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Artículo de método
Culturas Organotypic tridimensionales de órganos sensoriales vestibulares y auditivas
En este artículo
Resumen
Resumen
Los órganos sensoriales del oído interno son desafiantes para estudiar en los mamíferos debido a su inaccesibilidad a la manipulación experimental y observación óptica. Por otra parte, aunque las técnicas de cultivo existentes permiten perturbaciones bioquímicas, estos métodos no proporcionan un medio para estudiar los efectos de fuerza mecánica y rigidez del tejido durante el desarrollo de los órganos sensoriales del oído interno. Aquí se describe un método de cultura organotypic tridimensional del utrículo murino intacto y cóclea que supera estas limitaciones. La técnica para el ajuste de una rigidez de la matriz tridimensional que se describe aquí permite la manipulación de la fuerza elástica contra crecimiento del tejido. Por lo tanto, este método puede utilizarse para estudiar el papel de las fuerzas mecánicas durante el desarrollo del oído interno. Además, las culturas permiten entrega de genes mediada por virus, que puede ser utilizada para experimentos de ganancia y pérdida de función. Este método de cultivo conserva innata de las células ciliadas y las células y sirve como una alternativa potencialmente superior a la tradicional cultura bidimensional de órganos sensoriales vestibulares y auditivos.
Introducción
El estudio de la mayoría de los aspectos del desarrollo del órgano de los mamíferos ha sido facilitado por sistemas in vitro . Ahora se utilizan dos métodos principales para el cultivo de órganos sensoriales vestibulares: flotante1 y adherente2 preparados. Ambos métodos permiten la investigación de la célula de pelo vulnerabilidades3 regeneración1,4 y in vitro. Además, el papel del desarrollo de la muesca5,67,de Wnt
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Protocolo
Todos los métodos aquí descritos han sido aprobados por el cuidado Animal y comités de uso de la Universidad de Rockefeller y de la Universidad de California del sur.
1. (opcional) preparación del colágeno I solución de tendones Mouse-tail
Nota: Colágeno las soluciones están disponibles comercialmente. Siga las instrucciones del fabricante para la preparación del gel.
- Eutanasia a ratones del adulto joven (3-5 semanas) de 5-10 de cualquier cepa de tipo salvaje con dióxido de carbono según el protocolo aprobado por el Comité de uso y cuidado institucional del Animal relevantes
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Resultados
Órganos sensoriales vestibulares y auditivos de oídos embrionarios, cultivadas en 40 Pa colágeno geles mímico rigidez bajo condiciones embrionarias11, retener relativamente normales estructuras tridimensionales (figura 1) y mantener las células de pelo y apoyo a las células (figura 2 y figura 3). Aunque apoyo la densidad celular disminuye en más del 30% (prueba tde St.......
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Discusión
Las señales moleculares que medie crecimiento y la diferenciación en el oído interno durante el desarrollo se han estudiaron extensivamente5,6,7,8,9,10. Sin embargo, la evidencia obtenida desde el sistema utricular modelo sugiere que señales mecánicas, detectados a través de uniones celulares y la activación de la señalizació.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Agradecemos a Dr. A. Jacobo, Dr. J. Salvi y Petelski A. por sus contribuciones a la investigación original en que se basa este protocolo. También agradecemos a Llamas J. y W. Makmura asistencia técnica y agricultura animal. Reconocemos la beca de formación de NIDCD T32 DC009975, NIDCD conceder R01DC015530, Fondo de desarrollo terapéutico de Robertson y la Fundación de la familia Caruso para la financiación. Finalmente, reconocemos el apoyo del Instituto médico de Howard Hughes, que es un investigador Dr. Hudspeth.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| #10 Cuchillas quirúrgicas | Miltex | 4-110 | |
| #5 Pinzas | Dumont | 11252-20 | |
| Placa de Petri de 100 mm | Sigma | P5856-500EA | |
| 250 uL puntas de pipeta de orificio grande | USA Scientific | 1011-8406 | |
| Placa de Petri con fondo de vidrio de 30 mm | Matsunami Glass USA Corporation | D35-14-1.5-U | |
| 4 pocillos placa | Thermo Fisher Scientific | 176740 | |
| 4-Hidroxitamoxifeno | Sigma | H7904 | |
| 60 mm Placa de Petri | Thermo Fisher Scientific | 123TS1 | |
| Ácido acético | Sigma | 537020 | |
| Ad-GFP | Vector Biolabs | 1060 | |
| Anti-GFP, fracción IgY de pollo | Invitrogen | A10262 | |
| Anti-Myo7A | Proteus Biosciences | 25-6790 | |
| Anticuerpo anti-Sox2 (Y-17) | Santa Cruz | sc-17320 | |
| Ensayo de ácido bicinconínico | Thermo Fisher Scientific | 23225 | |
| Click-iT EdU Alexa Fluor 647 Kit de imágenes | Thermo Fisher Scientific | C10340 | |
| Colagenasa I | Gibco | 17100017 | |
| D-glucosa | Sigma | G8270 | |
| DMEM/F12 | Gibco | 11320033 | |
| Factor de crecimiento epidérmico | Sigma | E9644 | |
| Suero fetal bovino (FBS) | Thermo Fisher Scientific | 16140063 | |
| Factor de crecimiento de fibroblastos | Sigma | F5392 | |
| Tirador de micropipetas Flaming/Brown | Sutter Instrument | P-97 | |
| Glutamina | Sigma | G8540 | |
| HBSS | Gibco | 14025092 | |
| Hemocitómetro | Daigger | EF16034F | |
| HEPES | Sigma | H4034 | |
| Insulina | Sigma | I3536 | |
| Tijeras de iridictomía | Zepf Instrumentos Médicos | 08-1201-10 | |
| Microinyector | Narishige | IM-6 | |
| Nicotinamida | Sigma N0636 | ||
| PBS (10X), pH 7.4 | Gibco | 70011044 | |
| PBS (1X), pH 7.4 | Gibco | 10010023 | |
| Rojo de Fenol Indicador de pH | Sigma | P4633 | |
| Etanol puro, 200 pruebas Decon Labs | 2716 | ||
| RFP anticuerpo | ChromoTek | 5F8 | |
| Bicarbonato de sodio | Sigma | S5761 | |
| Hidróxido de sodio | Sigma | S8045 | |
| Selenito de sodio | Sigma | S5261 | |
| Vórtice de sobremesa | VWR | 97043-562 | |
| Transferrin | Sigma | T8158 | |
| Azul tripano | Sigma | T6146 |
Referencias
- Oesterle, E. C., Tsue, T. T., Reh, T. A., Rubel, E. W. Hair-cell regeneration in organ cultures of the postnatal chicken inner ear. Hear Res. 70 (1), 85-108 (1993).
- Meyers, J. R., Corwin, J. T. Shape change controls supporting cell proli....
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