Artículo de método

Evaluación de la inclusión del exón inducido por empalme conmutación oligonucleótidos antisentidos en fibroblastos del paciente de SMA

DOI:

10.3791/57530

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11 de mayo de 2018

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1Department of Medical Genetics, University of Alberta Faculty of Medicine and Dentistry, 2Muscular Dystrophy Canada Research Chair, Department of Medical Genetics, University of Alberta Faculty of Medicine and Dentistry

En este artículo

Resumen

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Diferentes oligonucleótidos antisentidos (AONs) han demostrado para inducir la inclusión del exón (modulación de empalme) y rescatar la expresión de SMN para atrofia muscular espinal (SMA). Aquí, describimos un protocolo para AON lipotransfection inducir la inclusión del exón del gen SMN2 y los métodos de evaluación para determinar la eficacia de fibroblastos pacientes SMA.

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Atrofia muscular espinal (SMA), una enfermedad neurológica letal causada por la pérdida de SMN1, presenta un caso único en el campo de oligonucleótidos antisentido (AON)-mediada por la terapia. Mientras que las mutaciones de SMN1 son responsables de la enfermedad, AONs dirigidos a sitios de silenciador (ISS) empalme intronic de SMN2, incluyendo nusinersen aprobado por la FDA, han demostrado restablecer la expresión de SMN y mejorar los síntomas. Actualmente, muchos estudios en terapia AON para SMA se centran en investigar nuevos químicos AON contra de SMN2 que pueden ser más eficaces y menos tóxicos que nusinersen. Aquí, describimos un protocolo para la evaluación en vitro de la inclusión del exón mediante lipotransfection de AONs seguida de reacción en cadena de polimerasa de transcripción inversa (RT-PCR) reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa (qPCR) y Western blot. Este método se puede emplear varios tipos de químicos AON. Usando este método, demostramos que AONs compuesta de los ácidos nucleicos bajo llave alternados (LNAs) y nucleótidos de ADN (ADN LNA mixmers) conducen a la eficiente inserción del exón de SMN2 y restauración de proteína SMN en una concentración muy baja y por lo tanto, el LNA / Oligonucleótidos antisentido basados en mixmer de ADN pueden ser una estrategia terapéutica atractiva para el tratamiento de empalmes defectos causados por enfermedades genéticas. El método de evaluación en vitro descrito aquí es rápido, fácil y suficientemente sensibles para la prueba de varias nuevas AONs.

Introducción

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Atrofia muscular espinal (SMA) es un desorden neuromuscular fatal heredado en un patrón recesivo de un autosoma. Se caracteriza por la degradación de las neuronas motoras y progresiva tronco y extremidad músculo parálisis1,2. La mayoría de ocurrencias de SMA son debido a una mutación homocigótica en el gen de supervivencia de motor neuron 1 (SMN1)3. El gen de la supervivencia de la neurona de motor 2 (SMN2) es una copia inversa de SMN1y tiene una secuencia casi idéntica difieren por sólo cinco bases4,5. Una transición de C a T en SMN2 situada en el exón 7 hace que el gen casi no funcional porque la mutación conduce al esencial exón 7 excluidos en casi el 90% de las transcripciones de SMN2 (figura 1a). MRNAs de SMN2 falta exón 7 no puede compensar la función de SMN1 porque su producto de la proteína es inestable y se degrada rápidamente.

Terapia antisentida recientemente emergido como una estrategia muy prometedora para el tratamiento de SMA6. La reciente aprobación del nusinersen por la U.S. Food y Drug Administration (FDA) hizo el primer fármaco disponible para el tratamiento de SMA7. Nusinersen es un oligonucleótido antisentido (AON) de 18-mer con una modificación de 2 '-O-methoxyethyl (MOE) y una columna vertebral fosfotioato. La droga apunta silencioso intronic splicing N1 (ISS-N1) localizado en el intrón 7 del gen SMN2 . Enlace de nusinersen al ISS-N1 promueve la recuperación de la expresión de proteína SMN integral funcional del gen SMN2 endógeno mediante la inducción de exón 7 inclusión (figura 1a)8,9,10 . Actualmente, muchos estudios con terapia AON para SMA se centran en investigar nuevos químicos AON que pueden ser más eficaz y menos tóxica que la nusinersen. Se ha demostrado que AONs con otros químicos inducen también eficaz inclusión del exón en el exón 7 de SMN2 tanto in vitro e in vivo11,12,13.

Ácidos nucleic bloqueados (LNAs) son análogos de RNA químicamente modificados que contiene un puente de metileno entre el 4′ -carbono 2′ -oxígeno dentro de la estructura (figura 1b) de furanose14,15. En comparación con DNAs o RNAs, LNAs tienen una mayor afinidad por la Unión a secuencias de ARN complementarias y tienen la ventaja de ser altamente resistente a nucleasas endógenas. La química LNA se ha aplicado para el uso como sondas en situ hibridación de la fluorescencia (pescado) y en qPCR16,17. También, se utiliza para regular la expresión génica in vitro e in vivo. GapmeR AONs son una combinación de las moléculas de ADN monocatenario flanqueado por varios LNAs en los extremos 5′ y 3′. Golpean hacia abajo de la expresión génica mediante la Unión complementarias a mRNAs específicos, causando que se degrada por la Rnasa H activado18. Mixmers LNA ADN son AONs que se componen de nucleótidos de ADN integrados entre LNAs. En esta orientación puede enlazar miRNA para inhibir su función (LNA-antimiR)19. Algunos antimiRs de LNA han alcanzado desarrollo clínico. Por ejemplo, miravirsen (AntimiR-122) es un LNA antimiR que inhibe miR-122 para tratar la infección por hepatitis C y varios ensayos clínicos de fase II son actualmente19,20. Recientemente, se ha demostrado que mixmers LNA ADN puede modular también RNA splicing21. Puede enlazar una secuencia específica del mRNA e inducir el exón que salta en dystrophin mRNA y el exón inclusión en SMN2 mRNA en vitro13,22.

En este artículo, describiremos una metodología para la inducción de la inclusión del exón utilizando AONs y la evaluación de la eficacia en los niveles de RNA y proteínas. Para ejemplificar este método, se utilizó el mixmers LNA ADN a ISS-N1 en el intrón 7 de SMN2. AONs transfectadas en las células de pacientes SMA por lipotransfection inducida por la inclusión del exón 7 en el final SMN2 transcripción y regulación al alza de la producción de proteína SMN. Una de las ventajas de usar mixmers LNA ADN para inducir la inclusión del exón es que la concentración efectiva para la transfección es significativamente menor que otros químicos13. Este método puede ser utilizado para muchos otros AONs excepto phosphorodiamidate morfolino oligómeros (PMOs), que, debido a su carga neutral, necesitan entrar en las células mediante endocitosis inducida por el reactivo de transfección Co Endo-Porter.

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Protocolo

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1. cultivo celular

  1. Fibroblastos de pacientes SMA de cultura en el medio de crecimiento (Dulbecco modificado Eagle mediana 1:1-12 (jamón) con 10% suero bovino fetal (FBS) y 0.5% de penicilina/estreptomicina) en un incubador de CO2 a 37 ° C.
  2. Determinar la concentración de células usando un contador de células automatizado y diluir las células 1 x 105 células/mL en el medio de cultivo, semilla en la placa correspondiente. Usar placas de 12 pocillos (1 mL por pozo) por RT-PCR o qPCR.
  3. Incubar las placas durante 24 h en un incubador de CO2 a 37 ° C.

2. transfección de mixmer LNA/ADN

  1. Asegurar la confluencia celular de alrededor de 65-80% de eficiencia de transfección óptima.
  2. Descongelar 10 μM ADN LNA mixmers lentamente en hielo.
  3. En un tubo de 1,5 mL, prepare una solución de x mixmer 20 añadiendo el mixmers a los medios de comunicación privados de suero para que llegue al volumen final 50 μL.
  4. Mezcle la solución de mixmer con 50 μL de suero privados los medios de comunicación que contiene el reactivo de transfección de 3% (relación 1:1).
  5. Incubar durante 10 minutos a temperatura ambiente.
  6. Agregar 900 μL suero privado el medio con 5% FBS a cada tubo.
  7. Aspire los viejos medios de comunicación de la placa y reemplazar con 1 mL de solución de mixmer LNA ADN que contiene el reactivo de transfección.
  8. Incube las células durante 24-48 h a 37 ° C en un incubador de CO2 .

3. extracción de RNA

  1. Quite el medio y añadir 1 mL de reactivo de guanidinio tiocianato-fenol-cloroformo a las células. Lave la parte inferior de la bien varias veces con Guanidinio tiocianato-fenol-cloroformo y recoger en tubos de 1,5 mL.
  2. Vórtice de alta velocidad de 30 s y tienda a-80 ° C durante 1 h o durante la noche.
  3. Descongelar las muestras a temperatura ambiente y agitar bien.
  4. Añadir cloroformo μl 200, agitar vigorosamente durante 15 s e incubar a temperatura ambiente durante 3 minutos.
  5. Centrifugar a 12.000 x g durante 15 min a 4 ° C.
  6. Recoger la fase acuosa clara superior en un tubo nuevo. Asegúrese de evitar recoger cualquiera de la interfase blanca que se forma entre las fases superiores e inferiores.
  7. Añadir 500 μl isopropanol y 1 μl de 8 μg/μl glucógeno (grado de RNA). Vortex por 10 s e incubar a temperatura ambiente durante 10 minutos o a-20 ° C durante la noche.
  8. Centrifugar a 12.000 x g durante 10 min a 4 ° C y retirar todo el sobrenadante. Una pelotilla blanca se forma en la parte inferior del tubo.
  9. Añadir etanol al de 75% frío 1 mL y centrifugar a 7.500 x g durante 5 min a 4 ° C.
  10. Eliminar el etanol y secar el precipitado a temperatura ambiente hasta que no quede etanol en el tubo.
  11. Disolver los pellets en agua libre de 30 μl de DNasa/Rnasa e incubar 10 min a 60 ° C.
  12. Medir la concentración de RNA utilizando un espectrofotómetro (a 260 nm) y ajustar la concentración de RNA a 50 ng/μl.

4. un paso RT-PCR para medir la tasa de inclusión del exón de SMN2

  1. Mezcla 12.5 μl de 2 x buffer de reacción RT-PCR, mezclar 1,0 μL de enzima de RT-PCR de un solo paso, 0.5 μl de cada cebador (SMN2 adelante: 5'-CTGCCTCCATTTCCTTCTG-3', inversa de SMN2 : 5'-TGGTGTCATTTAGTGCTGCTC-3', GAPDH hacia adelante: 5'-TCCCTGAGCTGAACGGGAAG-3', inversa GAPDH : 5'-GGAGGAGTTTGGTCGCTGT-3', 2 μl de RNA total (50 ng/μL), y 8,5 μl de Rnasa DNasa-libre de agua destilada.
  2. Después de cDNA se sintetiza a 50 ° C durante 15 minutos, comience la reacción de PCR. Amplificar el exón SMN2 6-8 con 30 ciclos PCR (94 ° C durante 15 s, 60 ° C durante 30 s, 68 ° C por 25 s). Amplificar la GAPDH con 20 ciclos PCR (94 ° C durante 15 s, 60 ° C durante 30 s, 68 ° C por 20 s).
  3. Añadir 5 μL 6 x carga del tinte en el producto PCR y cargar 5 μl de la mezcla en un gel de agarosa al 2% y correr durante 40 min a 100 V.
  4. Imagen del gel y analizarlo utilizando el software ImageJ.
  5. Medir la intensidad de bandas Δ7 y bandas de larga duración. Calcular la tasa de inclusión del exón 7 por el valor de la intensidad de (larga duración) / (cuerpo entero + Δ7 SMN2).

5. cuantitativo PCR (qPCR) para medir la tasa de inclusión del exón de SMN2

  1. Para síntesis de cDNA, Oligo dT de 1 μl de la mezcla, 1 μl 10 mM dNTPs y 11 μl total RNA (50 ng/μL). Incubar a 65 ° C durante 5 minutos.
  2. Coloque las muestras en hielo y añadir 4 μL 5 x buffer, 1 μl de 0,1 M TDT, inhibidor de Rnasa de 1 μl y 1 μl de la transcriptasa inversa a cada muestra.
  3. Incubar a 50 ° C durante 60 min y calentar hasta 80 ° C durante 10 minutos detener la reacción. El cDNA puede ser almacenado a-20 ° C.
  4. Diluir los cDNAs con agua libre de ARNasa (dilución 1:5). Mezclar 10 μl 2 x mezcla de enzima de qPCR de SYBR Green, 0,8 μl 10 μm la cartilla (largometraje SMN2 adelante: 5-GCTATCATACTGGCTATTATATGGGTTTT-3 ', largometraje SMN2 inversa: 5-CTCTATGCCAGCATTTCTCCTTAAT-3 ', Δ7 SMN2 adelante: 5′ - TCTGGACCACCAATAATTCCCC-3′, Δ7 SMN2 reverso: ATGCCAGCATTTCCATATAATAGCC-5′-3′, GAPDH adelante: 5-GCAAATTCCATGGCACCGT-3 ', GAPDH inversa: 5-AGGGATCTCGCTCCTGGAA-3 '), 3 μl diluir cDNA y 5.4 μL de agua libre de ARNasa.
  5. Iniciar la reacción de la qPCR. Las condiciones de uso: 95 ° C por 30 s, después de un ciclo de 40 repetir a 95 ° C para 5 s y 60 ° C durante 20 s.
  6. Calcular la expresión relativa de larga duración SMN2 a GAPDH o Δ7 SMN2y normalizar a las células no tratadas con el algoritmo de ΔΔCt.

6. Western blotting

  1. Retire el medio de transfección de las células y lavar con tampón fosfato salino (PBS) una vez.
  2. Añadir 100 μl de tampón de lisis con un inhibidor de proteasa.
  3. Separar las células de la parte inferior de cada pocillo con un raspador estéril de células y recoger en tubos de 1,5 mL. Incubar las muestras en hielo durante 30 minutos.
  4. Atraviesan la célula lisado aguja 21 G 10 veces para aplastar a las células.
  5. Centrifugue a 20.800 x g durante 15 min a 4 ° C y recoger el sobrenadante en tubos de 1,5 mL de nuevo. La muestra puede almacenarse en un congelador de-80 ° C.
  6. Determinar la concentración de proteína usando un Kit de análisis de proteína BCA y ajustar la concentración a 1,0 μg/μl.
  7. Mix 5 μl las muestras y 5 μl de 2 x de tampón de sodio dodecil sulfato (SDS) (SDS 10%; 14% solución de Tris-HCl de 0,5 M, pH 6.7; solución stock de 1% de 0,5 M EDTA-2Na, pH 8.0; 20% glicerol, colorante de azul de bromofenol 0.004%, 5% β-mercaptoetanol) y de calor a 70 º C durante 10 minutos.
  8. Cargar las muestras en un 4-12% geles de proteína Bis-Tris y corren 150 V durante 1 hora.
  9. Empapar un papel de filtro grueso en cada memoria intermedia: (Tampón concentrado ánodo: 0.3 M Tris-HCl 20% metanol; buffer ánodo: 0.03 M Tris-HCl 20% metanol; buffer de cátodo: 25 mM Tris, 20% metanol, ácido 6-amino-n-hexanoico de 40 mM, 0.01% SDS).
  10. Remoje una membrana (PVDF) de difluoruro de polivinilideno en metanol durante 20 s, entonces la transferencia en el búfer de ánodo.
  11. Equilibrar el gel después de SDS-PAGE con el tampón de cátodo para 5-10 min en agitación.
  12. Coloque los papeles de filtro, membranas PVDF y el gel en una máquina Blot semiseco, como sigue: concentrado ánodo buffer papel/ánodo tampón proteína/membrana de papel/PVDF gel/cátodo buffer papel (figura 2).
  13. Cubierta de la pila y empezar a la transferencia en 20 V durante 30 minutos.
  14. Después de la transferencia, enjuagar la membrana PVDF con SAFT (PBS con 0,05% Tween 20) una vez.
  15. Bloquear la membrana a temperatura ambiente durante 30 min en 5% leche descremada en polvo disuelto en SAFT o a 4 ° C para pasar la noche.
  16. Diluir un anticuerpo de ratón purificado anti-SMN y un anticuerpo anti-Cofilin conejo 1: 10,000 en 5% leche descremada en polvo en SAFT. Incubar la membrana en él durante 1 h a temperatura ambiente o a 4 ° C durante la noche.
  17. Lavar 3 veces con SAFT para 10 minutos.
  18. Diluir anticuerpos secundarios (anti-ratón conjugado con HRP cabra y anti-conejo IgG (H + L)) a 1: 10,000 en 5% de leche descremada en polvo en SAFT. Incubar durante 1 h a temperatura ambiente en la oscuridad.
  19. Lavar la membrana 3 veces con SAFT durante 10 minutos.
  20. Detectar la señal de banda mediante el Western Blot kit de detección de la quimioluminescencia.

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Resultados

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Utilizando fibroblastos pacientes SMA, habían concentrado en la región de silenciador de ISS-N1 en el intron 7 del gen SMN2 con ocho diferentes antisentido ADN LNA mixmers que fueron transfectadas en concentración 5 nM (figura 3). Cada uno de los mixmers contenía un esqueleto de phosphorothioated modificado que les permitieron resistir la degradación nucleasas. Para evaluar la eficacia de la mixmers, la tasa de SMN2 exón 7 inclusión se cuant...

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Discusión

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El método de evaluación en vitro descrito aquí es rápido, fácil y suficientemente sensibles para la prueba de varios AONs. Este protocolo es ampliamente aplicable a saltar del exón y la inclusión de otros genes y varios tipos de células. Además, la mayoría químicos AON (excepto PMOs) pueden transfected con este método. AONs pueden regular el splicing del pre-mRNA de genes endógenos y artificialmente introducidos y pueden ser co transfected con los vectores plásmidos portadores de genes específicos.

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Divulgaciones

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Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

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Los autores agradecen a Nicole McRorie para ayuda con los experimentos. Este trabajo fue financiado por la Universidad de Alberta Facultad de medicina y odontología Slipchuk SMA investigación Fundación beca de investigación, los institutos canadienses de investigación de salud (CIHR), los amigos de Garrett Cumming investigación fondos, HM Toupin neurológica Fondos de investigación de la ciencia, la Distrofia Muscular de Canadá, la Fundación de Canadá para la innovación, Alberta empresa y educación superior y las mujeres y de niños Instituto de investigación de salud (WCHRI).

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
SMA FibroblastosCoriell Repositorio de células genéticas humanas NIGMSGM03813
Medio Eagle Modificado de Dulbecco (DMEM)Thermo Fisher11320033
Suero Fetal BovinoSigma-AldrichF1051
Penicilina-Estreptomicina (10.000 U/mL)Thermo Fisher15140122
Tripsina-EDTA (0,05%), rojofenolThermo Fisher25300062
Medios privados de sueroThermo Fisher31985070
Reactivo de transfecciónThermo Fisher15338100
tiocianato-fenol-cloroformo de guanidinio (TRIzol)Thermo Fisher15596-018
Secuencia de cebadores5' a 3'SMN2
hacia adelante: CTGCCTCCATTTCCTTCTG
SMN2 inverso: TGGTGTCATTTAGTGCTCTC
GAPDH adelante: TCCCTGAGCTGAACGGGAAG
GAPDH reverso: GGAGGAGTTTGGTCGCTGT
qPCR Primers
de longitud completa SMN2 adelante:GCTATCATACTGGCTATTATATGGGTTTT
de longitud completa SMN2 reverso: CTCTATGCCAGCATTTCTCCTTAAT
GAPDH adelante: GCAAATTCCATGGCACCGT
GAPDH reverso:AGGGATCTCGCTCCTGGAA
CloroformoSigma-AldrichP3803
Glicógeno, grado de ARNThermo FisherR0551
ImageJ Software
Inhibidor de cóctel de proteasa 
mM Ácido 6-aminocaproico + 20%
Tampón0,03 m Tris base + 20%
de ánodo concentrado0,3 M base Tris + 20% metanol
Beta Mercaptoetanol MilliporeES-007-E
Membrana PVDF GE10600021
Tampón de carga/muestra para Western blotNuPage InvitrogenNP007
Kit de RT-PCR de un solo paso Qiagen 210210
dNTPsClontech3040
RT-PCR Tampón catódico Roche 11836153001 0,025 M Tris base + 40  de ánodo de metanol tampón de metanol

Referencias

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