Diferentes oligonucleótidos antisentidos (AONs) han demostrado para inducir la inclusión del exón (modulación de empalme) y rescatar la expresión de SMN para atrofia muscular espinal (SMA). Aquí, describimos un protocolo para AON lipotransfection inducir la inclusión del exón del gen SMN2 y los métodos de evaluación para determinar la eficacia de fibroblastos pacientes SMA.
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Artículo de método
Evaluación de la inclusión del exón inducido por empalme conmutación oligonucleótidos antisentidos en fibroblastos del paciente de SMA
En este artículo
Resumen
Resumen
Atrofia muscular espinal (SMA), una enfermedad neurológica letal causada por la pérdida de SMN1, presenta un caso único en el campo de oligonucleótidos antisentido (AON)-mediada por la terapia. Mientras que las mutaciones de SMN1 son responsables de la enfermedad, AONs dirigidos a sitios de silenciador (ISS) empalme intronic de SMN2, incluyendo nusinersen aprobado por la FDA, han demostrado restablecer la expresión de SMN y mejorar los síntomas. Actualmente, muchos estudios en terapia AON para SMA se centran en investigar nuevos químicos AON contra de SMN2 que pueden ser más eficaces y menos tóxicos que nusinersen. Aquí, describimos un protocolo para la evaluación en vitro de la inclusión del exón mediante lipotransfection de AONs seguida de reacción en cadena de polimerasa de transcripción inversa (RT-PCR) reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa (qPCR) y Western blot. Este método se puede emplear varios tipos de químicos AON. Usando este método, demostramos que AONs compuesta de los ácidos nucleicos bajo llave alternados (LNAs) y nucleótidos de ADN (ADN LNA mixmers) conducen a la eficiente inserción del exón de SMN2 y restauración de proteína SMN en una concentración muy baja y por lo tanto, el LNA / Oligonucleótidos antisentido basados en mixmer de ADN pueden ser una estrategia terapéutica atractiva para el tratamiento de empalmes defectos causados por enfermedades genéticas. El método de evaluación en vitro descrito aquí es rápido, fácil y suficientemente sensibles para la prueba de varias nuevas AONs.
Introducción
Atrofia muscular espinal (SMA) es un desorden neuromuscular fatal heredado en un patrón recesivo de un autosoma. Se caracteriza por la degradación de las neuronas motoras y progresiva tronco y extremidad músculo parálisis1,2. La mayoría de ocurrencias de SMA son debido a una mutación homocigótica en el gen de supervivencia de motor neuron 1 (SMN1)3. El gen de la supervivencia de la neurona de motor 2 (SMN2) es una copia inversa de SMN1y tiene una secuencia casi idéntica difieren por sólo cinco bases4,
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Protocolo
1. cultivo celular
- Fibroblastos de pacientes SMA de cultura en el medio de crecimiento (Dulbecco modificado Eagle mediana 1:1-12 (jamón) con 10% suero bovino fetal (FBS) y 0.5% de penicilina/estreptomicina) en un incubador de CO2 a 37 ° C.
- Determinar la concentración de células usando un contador de células automatizado y diluir las células 1 x 105 células/mL en el medio de cultivo, semilla en la placa correspondiente. Usar placas de 12 pocillos (1 mL por pozo) por RT-PCR o qPCR.
- Incubar las placas durante 24 h en un incubador de CO2 a 37 ° C.
2. transfección de mixmer LNA/A....
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Resultados
Utilizando fibroblastos pacientes SMA, habían concentrado en la región de silenciador de ISS-N1 en el intron 7 del gen SMN2 con ocho diferentes antisentido ADN LNA mixmers que fueron transfectadas en concentración 5 nM (figura 3). Cada uno de los mixmers contenía un esqueleto de phosphorothioated modificado que les permitieron resistir la degradación nucleasas. Para evaluar la eficacia de la mixmers, la tasa de SMN2 exón 7 inclusión se cuant.......
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Discusión
El método de evaluación en vitro descrito aquí es rápido, fácil y suficientemente sensibles para la prueba de varios AONs. Este protocolo es ampliamente aplicable a saltar del exón y la inclusión de otros genes y varios tipos de células. Además, la mayoría químicos AON (excepto PMOs) pueden transfected con este método. AONs pueden regular el splicing del pre-mRNA de genes endógenos y artificialmente introducidos y pueden ser co transfected con los vectores plásmidos portadores de genes específicos.
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Los autores agradecen a Nicole McRorie para ayuda con los experimentos. Este trabajo fue financiado por la Universidad de Alberta Facultad de medicina y odontología Slipchuk SMA investigación Fundación beca de investigación, los institutos canadienses de investigación de salud (CIHR), los amigos de Garrett Cumming investigación fondos, HM Toupin neurológica Fondos de investigación de la ciencia, la Distrofia Muscular de Canadá, la Fundación de Canadá para la innovación, Alberta empresa y educación superior y las mujeres y de niños Instituto de investigación de salud (WCHRI).
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| SMA Fibroblastos | Coriell Repositorio de células genéticas humanas NIGMS | GM03813 | |
| Medio Eagle Modificado de Dulbecco (DMEM) | Thermo Fisher | 11320033 | |
| Suero Fetal Bovino | Sigma-Aldrich | F1051 | |
| Penicilina-Estreptomicina (10.000 U/mL) | Thermo Fisher | 15140122 | |
| Tripsina-EDTA (0,05%), rojo | fenolThermo Fisher | 25300062 | |
| Medios privados de suero | Thermo Fisher | 31985070 | |
| Reactivo de transfección | Thermo Fisher | 15338100 | |
| tiocianato-fenol-cloroformo de guanidinio (TRIzol) | Thermo Fisher | 15596-018 | |
| Secuencia de cebadores | 5' a 3'SMN2 | ||
| hacia adelante: | CTGCCTCCATTTCCTTCTG | ||
| SMN2 inverso: | TGGTGTCATTTAGTGCTCTC | ||
| GAPDH adelante: | TCCCTGAGCTGAACGGGAAG | ||
| GAPDH reverso: | GGAGGAGTTTGGTCGCTGT | ||
| qPCR Primers | |||
| de longitud completa SMN2 adelante: | GCTATCATACTGGCTATTATATGGGTTTT | ||
| de longitud completa SMN2 reverso: | CTCTATGCCAGCATTTCTCCTTAAT | ||
| GAPDH adelante: | GCAAATTCCATGGCACCGT | ||
| GAPDH reverso: | AGGGATCTCGCTCCTGGAA | ||
| Cloroformo | Sigma-Aldrich | P3803 | |
| Glicógeno, grado de ARN | Thermo Fisher | R0551 | |
| ImageJ Software | |||
| Inhibidor de cóctel de proteasa | |||
| mM Ácido 6-aminocaproico + 20% | |||
| Tampón | 0,03 m Tris base + 20% | ||
| de ánodo concentrado | 0,3 M base Tris + 20% metanol | ||
| Beta Mercaptoetanol | Millipore | ES-007-E | |
| Membrana PVDF | GE | 10600021 | |
| Tampón de carga/muestra para Western blot | NuPage Invitrogen | NP007 | |
| Kit de RT-PCR de un solo paso | Qiagen | 210210 | |
| dNTPs | Clontech | 3040 |
Referencias
- Iascone, D. M., Henderson, C. E., Lee, J. C. Spinal muscular atrophy: from tissue specificity to therapeutic strategies. F1000Prime Rep. 7, 4(2015).
- Touznik, A., Lee, J. J., Yokota, T. New developments in exon skipping and splice modulati....
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Reimpresiones y permisos
