Homogénea tiempo resuelto Förster Resonancia energía basada en la transferencia de ensayo para la detección de la secreción de insulina

Resumen

Aquí, presentamos homogénea tiempo resuelve FRET (HTRF) como un método eficiente para la detección rápida de la insulina secretada desde las células.

Resumen

La detección de la secreción de insulina es crítica para desdoblamiento mecanismos de secreción regulada, así como en estudios de metabolismo. Aunque numerosos ensayos de insulina han existido por décadas, el advenimiento reciente de la tecnología de transferencia de energía de resonancia Förster (HTRF) tiempo-resuelta homogénea ha simplificado significativamente estas mediciones. Esto es un ensayo óptico rápido, rentable, reproducible y robusto reliant con anticuerpos conjugados a brillante fluoróforos con emisiones de larga duración que facilita la transferencia de tiempo resuelto Förster Resonancia energía. Por otra parte, la detección de insulina HTRF es favorable para el desarrollo de ensayos de cribado de alto rendimiento. Aquí utilizamos HTRF para detectar la secreción de insulina en las células de la INS-1E, una línea de células derivadas de insulinoma de rata. Esto nos permite estimar los niveles basales de insulina y sus cambios en respuesta a la estimulación de la glucosa. Además, utilizamos este sistema de detección de insulina para confirmar el papel de la dopamina como un regulador negativo de la secreción de insulina estimulada por glucosa (GSIS). De manera similar, otras de la dopamina D₂-como agonistas del receptor, quinpirole y bromocriptina, reducen GSIS en forma concentración dependiente. Nuestros resultados destacan la utilidad del formato de análisis de insulina HTRF en determinar el papel de numerosos fármacos en GSIS y sus perfiles farmacológicos.

Introducción

La regulación del metabolismo energético es perfeccionada por una hormona anabólica insulina. Insulina es sintetizada y liberada por las células beta pancreáticas en respuesta a niveles crecientes de glucosa extracelular. La insulina liberada provoca la captación de glucosa por los tejidos sensibles a insulina^1,2. Fisiológicamente, esto está relacionado con la elevación de la concentración de glucosa después de una comida, seguida por la secreción de insulina para regular la absorción de glucosa. Disturbios en la homeostasis de la glucosa conducen a trastornos metabólicos que culminan en resistencia a la insul....

Protocolo

1. INS-1E células: mantenimiento y chapado

1. Mantener las células de la INS-1E en un incubador de₂ ˚C/5% CO 37 humidificado y cultivadas con Medio RPMI 1640 suplementado con 5% (v/v) inactivado con calor suero fetal bovino, 2 mM L-glutamina, 10 mM HEPES, piruvato de sodio 1 m m, 100 U/mL de penicilina/estreptomicina solución, 50 μm β-mercaptoetanol. Células en Medio RPMI 1640 completo de 10 mL (por placa), de la cultura hasta llegar a 80-90% de confluencia, cuando pueden se tripsinizaron y pasados o utilizados para el análisis de la secreción de insulina.
2. Día 1: Los medios de comunicación de aspirar y lavar las células un....

Resultados

Validamos nuestro análisis HTRF de insulina generando una curva estándar de insulina con insulina humana purificada estándares de concentraciones predefinidas (figura 2). Generación de la curva estándar nos permitida extrapolar las lecturas de fluorescencia radiométrica y así determinar los niveles de insulina secretada en respuesta a los tratamientos de drogas (figura 2). Variación intraplaca para ajuste de curvas fue mínima (

Discusión

El ensayo de insulina HTRF aquí descrito ofrece un sistema rápido y eficiente para medir la secreción de insulina desde un sistema basado en células cultivada. Entre sus ventajas más importantes, este ensayo ofrece una señal de bajo fondo debido a la alta relación de señal a ruido. Además, hemos confirmado que la señal HTRF es estable por largos períodos de tiempo (> 24 h)⁷. Sin embargo, puesto que los anticuerpos monoclonales de insulina vinculante llegar rápidamente a la saturación de la Unión d.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Placa blanca de media área de 96 pocillos	Greiner Bio-One	82050-042
Placa blanca de bajo volumen y fondo redondo de 384 pocillos	Corning	15100157
Insulina High Range Kit	Cisbio Bioassays	62IN1PEH	Kit de ensayo de insulina basado en HTRF de 10.000 pruebas
Lector de placas PHERAstar FSX	BMG Labtech	FSX	Lector de placas adaptado para lecturas de ensayos basadas en HTRF
Selladores de placas	Fisher Scientific	DY992	Para sellar la placa mientras se incuban los anticuerpos
Hemocitómetro	Hausser Scientific	3100
RPMI Medium 1640 (1x)	Gibco	11875-093	[+] L-glutamina
Tripsina 0.05%	Corning	25-052-CI	0,53 mM EDTA, (-) bicarbonato de sodio
DPBS (solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco)	Corning	21-031-CV	Sin calcio y magnesio
Suero fetal bovino	Corning	35-010-CV
HEPES	Gibco	156-30-080
Piruvato de sodio	Gibco
Solución de penicilina/estreptomicina 100x	Corning	30-002 CT
2-mercaptoetanol	Sigma	M1348
Tinción azul de tripán (0,4%)	Gibco	15250-061
Clorhidrato de dopamina	Sigma	8502
Mesilato de bromocriptina	Tocris	427
(-)-Clorhidrato de quinpirol	Tocris	1061
Albúmina sérica bovina	Calbiochem	12659
Poli-L-Lisina	Sigma	P4832
Glucosa	Sigma	G7021
DMSO (dimetilsulfóxido)	Sigma	276855

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