Describimos el aislamiento Inmunomagnética de los oligodendrocitos primario de ratón, que permite el aislamiento rápido y específico de las células para el cultivo en vitro .
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Artículo de método
Aislamiento Inmunomagnética rápida y específica de los oligodendrocitos primarios de ratón
En este artículo
Resumen
Resumen
El aislamiento eficiente y robusto y la cultura de los oligodendrocitos primarios (OLs) es una herramienta valiosa para el estudio en vitro del desarrollo de oligodendroglia, así como la biología de demyelinating enfermedades como la esclerosis múltiple y Enfermedad de Pelizaeus-Merzbacher-como (PMLD). Aquí, presentamos un simple y método de selección para el aislamiento de Inmunomagnética de etapa tres O4+ las células preoligodendrocytes de crías de ratones neonatales. Desde OL inmaduro constituyen más del 80% de la materia blanca de cerebro de roedor en el día postnatal 7 (P7) este método de aislamiento no sólo asegura alto rendimiento celular, sino también el aislamiento específico de OLs ya comprometida con el linaje oligodendroglial, disminuyendo la posibilidad de aislar células contaminantes tales como astrocitos y otras células del cerebro de ratón. Este método es una modificación de las técnicas divulgado previamente y proporciona pureza de oligodendrocyte preparación superior al 80% en aproximadamente 4 horas.
Introducción
Oligodendrocitos (OLs) son las células myelinating del sistema nervioso central (SNC)1. El aislamiento y la cultura de los oligodendrocitos primarios en un entorno fuertemente regulado es una valiosa herramienta para el estudio en vitro del desarrollo de oligodendroglia, así como la biología de enfermedades como la esclerosis múltiple2 desmielinizantes . Esto requiere de un eficiente y robusto del oligodendrocyte aislamiento y cultura método3. En este estudio, aprovechó de la expresión de un marcador superficial de la célula oligodendrocyte distintivo para aplicar una técnica de aislamien....
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Protocolo
Los ratones utilizados en este estudio fueron atendidos según las directrices del número de protocolo de SUNY Downstate Medical Center División de laboratorio Animal recursos (DLAR) 15-10492.
Nota: Oligodendrocitos primarios fueron aislados de neonatal (P5-P7-tipo C57Bl/6N) ratones. En esta etapa, OLs inmaduros constituyen más del 80% de la materia blanca roedor garantizar alto rendimiento celular. Todos los buffer y composiciones de reactivo están disponibles al final de la Tabla de materiales.
1. cubreobjetos preparación
Nota: Poly-D-lisina (PDL) / cubreobjetos laminin....
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Resultados
El propósito de este estudio fue establecer un método de aislamiento mejorado de O4+ oligodendrocitos primario de ratón que requieren la manipulación lo menos posible de las células diana. Todo el procedimiento de eutanasia de los cachorros para el revestimiento de las células en cubreobjetos toma aproximadamente 4 horas y datos presentados aquí representan tres experimentos independientes. Después de la disociación del tejido, un promedio de 4,3 ± 0,46 x 107 células.......
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Discusión
En esta comunicación, presentamos un método para el aislamiento eficaz de ratón inmaduro altamente purificada oligodendrocyte culturas. Comparado con protocolos previamente publicado39,40, este método produjo una mayor pureza con un nivel mucho más bajo de astrocitos GFAP positivas y un porcentaje muy bajo de otras células no caracterizado. Es importante señalar que estos son inmaduros OLs ya comprometidos con el linaje oligodendroglial. Así, estas células no ser.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen ninguna revelación.
Agradecimientos
Este estudio fue apoyado por subvenciones de la National Multiple Sclerosis Society (RG4591A1/2) y los institutos nacionales de salud (R03NS06740402). Los autores agradecen a Dr. Iván Hernández y los miembros de su laboratorio para proporcionar asesoramiento, equipamiento y espacio de laboratorio.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Pipetas serológicas de 10 ml | Fisher Scientific | 13-676-10J | |
| Jeringa de 10 ml Luer-Loc punta | BD, Becton Dickinson | 309604 | |
| tubos cónicos de 15 ml | Falcon | 352097 | |
| placas de cultivo de tejidos de 24 pocillos | Falcon | 353935 | |
| 40µ m filtro de células | Fisher Scientific | 22368547 | |
| tubos cónicos de 50 ml | Falcon | 352098 | |
| pipetas serológicas de 5 ml | Fisher Scientific | 13-676-10H | |
| 60 mm placas de cultivo de tejidos | Falcon | 353002 | |
| 70µ filtro de células m | Fisher Scientific | 22363548 | |
| Alexa Fluor 488 anticuerpo secundario IgG (H+L) anti-ratón de cabra | Invitrogen | A11001 | |
| Alexa Fluor 488 anti-conejo de cabra anticuerpo secundario IgM (H+L) | Invitrogen | A21042 | |
| Alexa Fluor 488 anticuerpo secundario de IgM (H+L) anti-conejo de cabra | Invitrogen | A11008 | |
| Alexa Fluor 594 cabra anti-pollo Anticuerpo secundario IgG (H+L) | Invitrogen | A11042 | |
| Perlas anti-O4- Anti-O4MicroBeads | Miltenyi Biotec | 130-094-543 | |
| Apo-Transferrina humana | Sigma | T1147 | |
| Autofil conjunto completo de filtro superior de botella, filtro de 0,22um, 250 ml | USA Scientific | 6032-1101 | |
| Autofil filtro superior de botella completo Montaje, 0.22um Filtro, 250ml | USA Scientific | 6032-1102 | |
| B27 Suplemento | Invitrogen | 17504-044 | |
| Ácido bórico | Sigma | B7660 | |
| Suero de crecimiento bovino (BGS) | GE Healthcare Ciencias de la Vida | SH30541.03 | |
| BSA | Fisher Scientific | BP-1600-100 | |
| CNTF | Peprotech | 450-50 | |
| d-Biotina | Sigma | B4639 | |
| Desoxirribonucleasa I (ADNasa I) | Worthington | LS002007 | |
| EDTA | Fisher Scientific | S311 | |
| Microscopio de epifluorescencia con cámara Olympus DP70 | Bisturíes | Bx51 | |
| Feather | Andwin Scientific | EF7281C | |
| Forskolin | Sigma | F6886 | |
| Cubreobjetos de vidrio alemán, #1 de grosor, 12 mm de diámetro redondo | NeuVitro | GG-12-oz | |
| Anticuerpo GFAP | Aves | GFAP | |
| Glucosa | Fisher Scientific | D16-1 | |
| GlutaMAX | Invitrogen | 35050-61 | |
| Insulina | Invitrogen | 12585-014 | |
| Soporte separador magnético - MACS multistand | Miltenyi Biotec | 130-042-303 | |
| Separador magnético-MiniSeparador MACS | Miltenyi Biotec | 130-042-302 | |
| Millex PES 0.22µ unidad de filtro m | Millipore | SLG033RS | |
| Medios de montaje- Prolong Gold con DAPI | Thermo Fisher | P36930 | |
| N-acetil-cisteína (NAC) | Sigma | A8199 | |
| Laminina de ratón natural | Invitrogen | 23017-015 | |
| Medio Neurobasal A | Invitrogen | 10888-022 | |
| Neurotrofina-3 (NT-3) | Peprotech | 450-03 | |
| Anticuerpo NG2 | Millipore | AB5320 | |
| Papain | Worthington | LS003126 | |
| PBS sin Ca2+ y Mg2+ | Sigma | D5652 | |
| PDGF | Peprotech | 100-13A | |
| Placas de Petri | Falcon | 351029 | |
| Poly-D-Lisina | Sigma | P6407 | |
| Primocin | Invivogen | ant-pm-2 | |
| Progesterona | Sigma | P8783 | |
| Putrescina | Sigma | P5780 | |
| Columna de selección-Columnas LS | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| Selenito de sodio | Sigma | S5261 | |
| Oligoelementos B | Corning | 25-000-CI | |
| Triyodotironina (T3) | Sigma | T6397 | |
| Triton-X | Sigma | T8787 | |
| Solución de Azul | Tripán Corning | 25-900-CI | |
| Tween 20 | Sigma | P1379 | |
| B27NBMA | 487,75 mL medio neurobasal A; 10 mL de suplemento de B27; 1 mL de Primocina; 1,25 mL de Glutamax; Filtre, esterilice y almacene a 4 & grados; C hasta su uso. | ||
| B27NBMA + 10% BGS | 27 mL B27NBMA; 3 mL de suero de crecimiento bovino | ||
| CNTF stock de solución (10 µ g/ml; 1000X) | Pedido de Peprotech (450-50). Envasar de 0,1 a 1 mg/ml según el fabricante. s (puede variar de un lote a otro) en el búfer (por ejemplo, DPBS + 0,2% BSA). Almacenar a -80 °C. Solución de trabajo (10 µ g/ml, 1000X) 1. Hacer con 0.2% BSA (Fisher scientific BP-1600-100) en solución de DPBS y filtro de esterilización. 2. Diluir la alícuota del material maestro a 10µ g/ml en estéril, refrigerado 0.2% BSA/DPBS. 3. Alícuota (20µ l/tubo) y congele a presión en nitrógeno líquido. 4. Almacene las alícuotas a -80 °C. | ||
| d-Solución madre de biotina (50 µ g/ml; 5000X) | Resuspender d-Biotina (Sigma-B4639) en H2O de doble destilación a 50 µ g/ml (por ejemplo, 2,5 mg en 50 ml de ddH2O). La resuspensión puede requerir una buena cantidad de agitación/vórtice, o un calentamiento leve brevemente a 37 ° C. Si la d-biotina aún no se solubiliza, está bien hacer una concentración menos concentrada (por ejemplo, 10 y micro; g/ml), y añadir un mayor volumen al B27NBMA (1/1000), en lugar de 1/5000). Almacenar a 4°C. | ||
| madre de DNasa I | 1. Disolver a 12.500 U Desoxirribonucleasa I/ml en HBSS enfriado sobre hielo. 2. Filtro esterilizar en hielo 3. Alícuota a 200 µ l y congelar durante la noche a -20 ° C. 4. Guarde las alícuotas a -20 a -30 °C. | ||
| Dulbecco' s Solución salina tamponada con fosfato (sin Ca2+ y Mg2+) | Disuelva la bolsa en 1 litro de agua para producir 1 litro de medio a 9,6 gramos de polvo por litro de medio. Almacene a 2-8 °C. | ||
| Solución madre de forskolina (4,2 mg/ml; 1000X) | Añadir 1 ml de DMSO estéril a 50 mg de forskolina en el frasco (Sigma-F6886) y pipetear hasta que se vuelva a suspender. Transfiera a un tubo de centrífuga de 15 ml y agregue 11 ml de DMSO estéril para obtener 4,2 mg/ml. Alícuota (p. ej. 20 y micro; l) y almacenar a -20°C. | ||
| Hank' s sales equilibradas (HBSS) (Sigma | 1. Mida 900 ml de agua (temperatura 15-20 ° C) en un cilindro y remover suavemente. 2. Agregue la potencia y revuelva hasta que se disuelva. 3. Enjuague el paquete original con una pequeña cantidad de agua para eliminar todos los rastros del polvo. 4. Agregue a la solución en el paso 2. 5. Añadir 0,35 gr de bicarbonato de sodio (7,5% p/v) por cada litro de volumen final. 6. Siga revolviendo hasta que se disuelva. 7. Ajuste el pH del tampón mientras agita a 0,1-0,3 unidades por debajo de pH= 7,4, ya que puede aumentar durante la filtración. Se recomienda el uso de HCl 1N o NaOH 1N para ajustar el pH. 8. Agregue agua adicional para llevar el volumen final a 1L. 9. Esterilizar por filtración utilizando una membrana con una porosidad de 0,22 micras. 10. Almacene a 2-8 °C. | ||
| Solución madre de insulina (4000 y micro; g/ml) | Descongele la botella y alícuota 25 µ l por tubo de microcentrífuga y almacenar a -20 ° C. | ||
| Solución | Descongele lentamente la laminina en frío (2 & grados; C a 8 grados; C) para evitar la formación de gel. Luego, alícuota en tubos de polipropileno. Tienda a 5° C a -20 grados; C en alícuotas (por ejemplo, 20 y micro; l) y no congele/descongele repetidamente. La laminina puede almacenarse a estas temperaturas hasta por seis meses. | ||
| de clasificación de células magnéticas (MCS) | Prepare la solución que contiene solución salina tamponada con fosfato (PBS), pH 7,2 y albúmina sérica bovina (BSA) al 0,5%, EDTA 0,5 mM, 5µ g/ml de insulina, 1 g/l de glucosa. Esterilizar y desgasificar por filtración el tampón pasándolo a través de un 0.22 µ m Filtro Millex. Guarde el tampón a 4 grados; C hasta el uso | ||
| de la solución madre de N-acetil-L-cisteína (NAC) (5 mg/ml; 1000X) | Disuelva la N-acetil-L-cisteína (Sigma-A8199) a 5 mg/ml en DMEM (por ejemplo, 50 mg de NAC en 10 ml B27NBMA). Filtro de esterilización y alícuota (p. ej. 20 y micro; l). Almacene a -20 ° C. | ||
| Solución madre NT3 (1 y micro; g/ml; 1000X) | Stock principal: Pedido de Peprotech (450-03). Envasar de 0,1 a 1 mg/ml según el fabricante. (puede variar de un lote a otro), en el búfer (por ejemplo, DPBS + 0,2% BSA). Almacenar a -80°C. Stock de trabajo (1µ g/ml; 1000X): 1. Hacer con 0.2% BSA en solución DPBS y esterilizar por filtro. 2. Diluir la alícuota del material maestro a 1 µ g/ml en estéril, refrigerado 0.2% BSA/DPBS. 3. Alícuota (por ejemplo, 20µ l/tubo) y congele a presión en nitrógeno líquido. 4. Almacene las alícuotas a -80 ° C. | ||
| Solución madre de PDGF (10 µ g/ml; 1000X) | Stock principal: Pedido de Peprotech (100-13A). Envasar de 0,1 a 1 mg/ml según el fabricante. s (pueden variar de un lote a otro) en búfer (por ejemplo, DPBS) + 0,2% BSA). Almacenar a -80°C. Stock de trabajo (1µ g/ml; 1000X): 1. Hacer con 0.2% BSA en solución DPBS y esterilizar por filtro. 2. Diluir la alícuota del material maestro a 1µ g/ml en estéril, refrigerado 0.2% BSA/DPBS. 3. Alícuota (por ejemplo, 20µ l/tubo) y congele a presión en nitrógeno líquido. 4. Almacene las alícuotas a -80 ° C. | ||
| Poli-D-lisina (1 mg/ml; 100X) | Resuspender poli-D-lisina, peso molecular 70-150 kD (Sigma P6407) a 0,5 mg/ml en ácido bórico 0,15M pH 8,4 (por ejemplo, 50 mg en tampón borato 50 ml). Filtro de esterilización y alícuota (p. ej. 100µ l/tubo). Almacene a -20 ° C. Antes de usar, diluya el caldo 100X (1 mg / ml) a 50 ° C; g/ml en agua estéril. | ||
| proliferación de oligodendrocitos | ver Tabla suplementaria 1 | ||
| Medios | ver Tabla suplementaria 1 | ||
| Suplemento de Sato (100X) | ver Tabla suplementaria 1 | ||
| Referencias: la lista de reactivos y recetas se adoptó de los protocolos previamente descritos por Emery et. al. 2013 (Emery, B. & Dugas, J. C. Purificación de células del linaje de oligodendrocitos de cortezas de ratón mediante inmunopanning. Primavera Fría Harb Protoc. 2013 (9), 854-868, doi:10.1101/pdb.prot073973, (2013)) y Dincman et. al. (Dincman, T. A., Beare, J. E., Ohri, S. S. & Whittemore, S. R. Aislamiento de células precursoras de oligodendrocitos corticales de ratón. J Métodos Neurosci. 209 (1), 219-226, doi:10.1016/j.jneumeth.2012.06.017, (2012)) |
Referencias
- Emery, B. Regulation of oligodendrocyte differentiation and myelination. Science. 330 (6005), 779-782 (2010).
- Yang, Z., Watanabe, M., Nishiyama, A. Optimization of oligodendrocyte progenitor cell culture method for enhanced survival. J Neurosci Methods.
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Reimpresiones y permisos
