Aquí presentamos un protocolo que está diseñado para analizar la Unión de todo el genoma del oligodendrocyte del factor de transcripción 2 (Olig2) en células de cerebro agudo purificada oligodendrocyte precursoras (OPC) por la realización de inmunoprecipitación de cromatina baja-celular (ChIP) , preparación de biblioteca, alto rendimiento secuenciación y análisis Bioinformático de los datos.
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Artículo de método
Identificar sitios de transcripción Factor Olig2 Unión genómica en agudo purificada PDGFRα + células por inmunoprecipitación de cromatina celular bajo análisis de la secuencia
En este artículo
Resumen
Resumen
En células de mamífero, transcripción genética está regulado de una forma específica de tipo celular por las interacciones de los factores transcripcionales con DNA genómico. Factores de transcripción específicos del linaje se consideran que desempeñan un papel esencial en la diferenciación durante el desarrollo y especificación de la célula. ChIP, juntada con la secuencia de la DNA de alto rendimiento (ChIP-seq) es ampliamente utilizado para analizar los sitios de unión de todo el genoma de los factores de transcripción (o su complejo asociado) para extracción de ADN genómico. Sin embargo, un gran número de células se requiere para una reacción estándar de ChIP, que dificulta el estudio del número limitado de células primarias aisladas o poblaciones celulares raros. Para entender el mecanismo de regulación de transcripción específicos del linaje de oligodendrocyte factor Olig2 en el ratón agudo purificado OPC, un método detallado usando ChIP-seq para identificar los sitios de unión de todo el genoma de Olig2 (o Olig2 complejo) se muestra. En primer lugar, el protocolo explica cómo purificar el alfa del receptor de factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGFRα) OPC positiva de cerebro de ratón. A continuación, Olig2 anticuerpo mediada por ChIP y se llevan a cabo la construcción de la biblioteca. La última parte describe el software de Bioinformática y procedimientos utilizados para el análisis de Olig2 ChIP-seq. En Resumen, este papel divulga un método para analizar los enlaces de todo el genoma del factor transcripcional Olig2 en cerebro agudo purificada OPC.
Introducción
Es importante para el estudio de la proteína (o complejo de la proteína) enlaces de ADN y las marcas epigenéticas para construir redes de regulación transcripcionales implicados en varios procesos biológicos. En particular, la fijación de factores de transcripción al ADN genómico puede jugar un papel importante en la regulación de los genes, la diferenciación celular y el desarrollo de tejido. Una poderosa herramienta para el estudio de la regulación transcripcional y mecanismos epigenéticos es inmunoprecipitación de cromatina (ChIP). Debido a los rápidos avances en la tecnología de secuenciación de última generación, juntada con la secuencia de la DNA de alto rendimi....
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Protocolo
Todos los protocolos experimentales y uso animal se realizó de acuerdo con la guía para el cuidado y uso de animales de laboratorio y aprobados por el Comité institucional de bioseguridad y el Comité de Bienestar Animal en el Universidad de Texas Health Science Center en Houston.
1. purificación de PDGFRα positivo Oligodendrocyte linaje células de cerebro de ratón (modificado de immunopanning anteriormente descrito protocolos5,6,7)
- Preparación de una placa de immunopanning para selección de PDGFRα positivo de la célula y 2 placas....
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Resultados
Fue realizada bajo celular ChIP-seq y bioinformáticas de análisis se realizaron para investigar las posibles interacciones del factor transcripcional Olig2 con ADN genómico purificado agudo cerebro OPC. La figura 1 muestra un flujo de trabajo general de la experimental y los procedimientos de análisis de datos. En este protocolo, cerebros de ratones postnatales se disocian en una suspensión unicelular. Después de la disociación del tejido, immunopanning reali.......
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Discusión
Redes de regulación genética mamíferos son muy complejas. ChIP-seq es un potente método para investigar las interacciones de la proteína del genoma-ADN. Este protocolo incluye cómo se realiza Olig2 ChIP-seq con una cantidad baja de OPC purificada de cerebro de ratón (tan bajo como 20 mil células por reacción). El primer paso clave de este protocolo es la purificación de OPC de cerebro de ratón por immunopanning con el anticuerpo PDGFRα. Para la selección positiva de OPC con placas PDGFRα revestido, atan a menudo débil OP.......
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Divulgaciones
Los autores declaran que no tienen intereses financieros que compiten.
Agradecimientos
JQW, XD, RCDD y YY fueron apoyados por becas de los institutos nacionales de salud R01 NS088353; NIH grant 1R21AR071583-01; el Staman Ogilvie fondo-Memorial Hermann Foundation; la iniciativa de cerebro UTHealth y CTSA UL1 TR000371; y una beca de la Universidad de Texas sistema Neurociencia y Neurotecnología Research Institute (Grant #362469).
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Reactivo/ Equipo | |||
| Banderiaea simplicifolia lectina 1 | Vector Laboratories | # L-1100 | |
| Rata anticuerpo anti-PDGFRa | BD Bioscience | # 558774 | |
| Kit de disociación de tejido neural (P) | MACS Miltenyi Biotec | # 130-092-628 | |
| Tecnologías | Accutase STEMCELL# 07920 | ||
| TRIzol | Thermo Fisher | # 15596026 | |
| Anti-NG2 Sulfato de Condroitina Anticuerpo Proteoglicano | Millipore | # AB5320 | |
| Dispositivo de sonicación Bioruptor Pico | Diagenode | # B01060001 | |
| True MicroChIP | kit Diagenode | # C01010130 | |
| Fenol:Cloroformo:Alcohol isoamílico (25:24:1, v/v) | Thermo Fisher | # 15593031 | |
| NucleoSpin Gel y kit de limpieza de PCR | MACHEREY-NAGEL # | 740609 | |
| Quant-iT PicoGreen dsDNA Kit | Thermo Fisher | # P11496 | |
| DNA SMART ChIP-Seq | kit Clontech Laboratories | # 634865 | |
| Agencourt AMPure XP | Beckman Voulter | # A63880 | |
| GlycoBlue | Thermo Fisher | # AM9516 | |
| pico-verde | Thermo Fisher | # P11496 | |
| D-PBS | Thermo Fisher | # 14190-144 | |
| SYBR Mezcla maestra verde | Bio-Rad Laboratories | # 1725124 | |
| DMEM/F12 | Fisher Scientific | # 11-320-033 | |
| Penicilina-Estreptomicina (P/S) | Fisher Scientific | # 15140122 | |
| Suplemento N-2 | Fisher Scientific | # 17502048 | |
| B-27 Suplemento | Fisher Scientific | # 17504044 | |
| insulina | Sigma | # I6634 | Prepare una solución de insulina de 0,5 mg/ml disolviendo 5 mg de insulina en 10 ml de agua y 50 μ l de 1 N HCl. |
| Albúmina sérica bovina, apta para cultivo celular (BSA) | Sigma | # A4161 | Prepare una solución de BSA al 4% disolviendo 4 g de BSA en 100 ml de D-PBS y ajuste el pH a 7,4 |
| Proteína básica del factor de crecimiento de fibroblastos, recombinante humano (bFGF) | EMD Millipore | # GF003 | |
| PDGF-AA | VWR | # 102061-188 | |
| poli-D-lisina | VWR | # IC15017510 | Prepare 1 mg/ml de solución de poli-D-lisina disolviendo 10 mg de poli-D-lisina en 10 ml de agua y diluya 100 veces cuando lo use. |
| Placas de Petri Desechables Falcon, Estériles, Corning, 100x15mm | VWR | # 25373-100 | |
| Placas de Petri Desechables Falcon, Estériles, Corning, 150x15mm | VWR | # 25373-187 | |
| HBSS, 10X, sin Calcio, sin Magnesio, sin Fenol | Red Fisher Scientific | # 14185-052 | |
| Trypan Blue | Stemcell Technologies | # 07050 | |
| Cóctel de inhibidores de proteasa | Sigma | # 11697498001 | |
| Software | |||
| FastQC | [10] http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/ | Obtención de métricas de control de calidad de lecturas sin procesar y recortadas | |
| Trimmomatic 0.33 | [11] http://www.usadellab.org/cms/?page=trimmomatic | Recorte y filtrado de lecturas | |
| sin procesarGENCODE mm10 | ftp://ftp.sanger.ac.uk/pub/gencode/Gencode_mouse/release_M15/GRCm38.primary_assembly.genome.fa.gz | Genoma de referencia del ratón | |
| Bowtie2 2.2.4 | [12] http://bowtie-bio.sourceforge.net/bowtie2/index.shtml | Alineación de lecturas a un genoma de referencia | |
| SAMTools 1.5 | [13] http://samtools.sourceforge.net/ | Convertir un archivo SAM a formato BAM | |
| HOMER 4.9.1 | [14] http://homer.ucsd.edu/homer/ | Creación de un directorio de etiquetas y anotación de regiones genómicas enriquecidas con símbolos genéticos | |
| R 3.2.2 | [15] https://www.R-project.org/ | Programación de scripts y ejecución de funciones | |
| SPP 1.13 | [16] https://github.com/hms-dbmi/spp | Creación de un gráfico de correlación cruzada de hebras | |
| MACS2 2.2.4 | [17] https://github.com/taoliu/MACS | Encontrar regiones de enriquecimiento de ChIP sobre el control | |
| BEDTools 2.25 | [18] http://bedtools.readthedocs.io/en/latest/ | Aritmética del genoma | |
| bedGraphToBigWig | http://hgdownload.cse.ucsc.edu/admin/exe/ | Convertir el archivo bedGraph en | |
| un navegador IGV bigwig 2.3.58 | [19] http://software.broadinstitute.org/software/igv/ | Visualización y navegación de picos significativos de ChIP-seq Microsoft | |
| Excel | Programa Spreasheet | ||
| Lista negra de ENCODE | https://sites.google.com/site/anshulkundaje/projects/blacklists | Picos de filtrado | |
| mm10.chrom.sizes | http://hgdownload.cse.ucsc.edu/goldenPath/mm10/bigZips/mm10.chrom.sizes. | Conversión del archivo bedGraph en la | |
| base de datos de motivos de ENCODE | [25] http://compbio.mit.edu/encode-motifs/ | Se requiere una base de datos completa de motivos para el enriquecimiento de motivos | |
| MEME-ChIP | [20] http://meme-suite.org/index.html | Análisis de enriquecimiento de motivos y descubrimiento | |
| de motivosNombres de cebadores utilizados para qPCR | cebadores fuertes utilizadas para qPCR | ||
| Mbp-F: | CTATAAATCGGCTCACAAGG | ||
| Mbp-R: | AGGCGGTTATTAAGAAGC | ||
| Iba1-F: | ACTGCCAGCCTAAGACAACC | ||
| Iba1-R: | GCTTTTCCTCCCTGCAAATCC | ||
| Mog-F: | GGCTTCTTGGAGGAAGGGAC | ||
| Mog-R: | TGAATTGTCCTGCATAGCTGC | ||
| GAPDH-F | ATGACATCAAGAAGGTGGTG | ||
| GAPDH-R | CATACCAGGAAATGAGCTTG | ||
| Tuj1-F | TTTTCGTCTCTAGCCGCGTG | ||
| Tuj1-R | GATGACCTCCCAGAACTTGGC | ||
| PDGFRα-F | AGAGTTACACGTTTGAGCTGTC | ||
| PDGFRα-R | GTCCCTCCACGGTACTCCT |
Referencias
- Wu, J. Q., et al. Tcf7 is an important regulator of the switch of self-renewal and differentiation in a multipotential hematopoietic cell line. PLoS Genet. 8 (3), e1002565(2012).
- Zuchero, J. B., Barres, B. A. Intrinsi....
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Reimpresiones y permisos
