Se requiere una suscripción a JoVE para ver este contenido. Inicie sesión o comience su prueba gratuita.

Artículo de método

Identificar sitios de transcripción Factor Olig2 Unión genómica en agudo purificada PDGFRα + células por inmunoprecipitación de cromatina celular bajo análisis de la secuencia

8.4K visualizaciones

⸱

DOI:

10.3791/57547

⸱

16 de abril de 2018

 ,  ,  , 
1The Vivian L. Smith Department of Neurosurgery, Center for Stem Cell and Regenerative Medicine, University of Texas Health Science Center

En este artículo

Resumen

Aquí presentamos un protocolo que está diseñado para analizar la Unión de todo el genoma del oligodendrocyte del factor de transcripción 2 (Olig2) en células de cerebro agudo purificada oligodendrocyte precursoras (OPC) por la realización de inmunoprecipitación de cromatina baja-celular (ChIP) , preparación de biblioteca, alto rendimiento secuenciación y análisis Bioinformático de los datos.

Resumen

En células de mamífero, transcripción genética está regulado de una forma específica de tipo celular por las interacciones de los factores transcripcionales con DNA genómico. Factores de transcripción específicos del linaje se consideran que desempeñan un papel esencial en la diferenciación durante el desarrollo y especificación de la célula. ChIP, juntada con la secuencia de la DNA de alto rendimiento (ChIP-seq) es ampliamente utilizado para analizar los sitios de unión de todo el genoma de los factores de transcripción (o su complejo asociado) para extracción de ADN genómico. Sin embargo, un gran número de células se requiere para una reacción estándar de ChIP, que dificulta el estudio del número limitado de células primarias aisladas o poblaciones celulares raros. Para entender el mecanismo de regulación de transcripción específicos del linaje de oligodendrocyte factor Olig2 en el ratón agudo purificado OPC, un método detallado usando ChIP-seq para identificar los sitios de unión de todo el genoma de Olig2 (o Olig2 complejo) se muestra. En primer lugar, el protocolo explica cómo purificar el alfa del receptor de factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGFRα) OPC positiva de cerebro de ratón. A continuación, Olig2 anticuerpo mediada por ChIP y se llevan a cabo la construcción de la biblioteca. La última parte describe el software de Bioinformática y procedimientos utilizados para el análisis de Olig2 ChIP-seq. En Resumen, este papel divulga un método para analizar los enlaces de todo el genoma del factor transcripcional Olig2 en cerebro agudo purificada OPC.

Introducción

Es importante para el estudio de la proteína (o complejo de la proteína) enlaces de ADN y las marcas epigenéticas para construir redes de regulación transcripcionales implicados en varios procesos biológicos. En particular, la fijación de factores de transcripción al ADN genómico puede jugar un papel importante en la regulación de los genes, la diferenciación celular y el desarrollo de tejido. Una poderosa herramienta para el estudio de la regulación transcripcional y mecanismos epigenéticos es inmunoprecipitación de cromatina (ChIP). Debido a los rápidos avances en la tecnología de secuenciación de última generación, juntada con la secuencia de la DNA de alto rendimiento (ChIP-seq) la viruta se utiliza para el análisis de enlaces de proteínas de ADN y marcas epigenéticas1. Sin embargo, un protocolo estándar de ChIP-seq requiere unos 20 millones de células por reacción, lo que dificulta la aplicación de esta técnica cuando el número de células, como células primarias aisladas y poblaciones celulares raros.

Oligodendrocyte células de linaje como oligodendrocitos células de precursor del oligodendrocyte (OPC) se encuentran ampliamente distribuidas por todo el cerebro y son esenciales para el desarrollo y función del cerebro. Como un tipo de células precursoras, OPCs son capaces de auto renovación y diferenciación. OPC no sólo sirve como progenitores de oligodendrocitos sino también juega un papel importante en la propagación de la señalización neuronal mediante la comunicación con otros tipos de células de cerebro2. Estudios previos han sugerido que el desarrollo de oligodendrocyte está regulada por factores de transcripción específicos del linaje como Olig2 y Sox103,4. Estos factores de transcripción fueron encontrados para enlazar las regiones promotor o potenciador de algunos genes cruciales para influenciar su expresión durante la diferenciación y especificación de oligodendrocyte. Sin embargo, es difícil identificar el atascamiento de la DNA de proteína o complejo de la proteína de interés en OPC primario agudo purificada con un número muy limitado de las células.

Este protocolo describe cómo investigar sistemáticamente la immunoprecipitated de ADN genómico por Olig2 en OPCs de ratón purificado a escala del genoma utilizando la técnica de ChIP-seq. OPC de cerebro de ratón fueron purificado por immunopanning agudo y utilizado en un experimento de ChIP sin proliferación in vitro. Un número limitado de OPC puede obtenerse por immunopanning y es insuficiente para los experimentos estándar de ChIP-seq. En este documento, un protocolo de baja celular ChIP-seq con tan bajo como 20 mil células por reacción de ChIP para factores de transcripción se describe. En Resumen, reticuladas células fueron lisadas y sonicadas por un dispositivo de sonicación para esquilar la cromatina. La cromatina esquilada se incubó con anticuerpos Olig2 como proteína granos A cubierto para precipitar el ADN genómico del anticuerpo enlazado de Olig2. Después de la elución de perlas de proteína A cubierto y cross-linking inversa, se purificó ADN genómico precipitado por anticuerpos Olig2 por extracción con fenol-cloroformo. El producto resultante fue cuantificado y sometido a T-tailing, primer recocido cambio de plantilla y extensión, además de adaptadores y amplificación, selección de tamaño de la biblioteca y depuración los pasos para la construcción de la biblioteca de ChIP-seq.

Después de la secuencia, se analizó la calidad de la materia prima Lee de la muestra preparada con anticuerpo de factor de transcripción Olig2 y la muestra de control. Baja calidad de pares de bases y que contienen adaptador leen fragmentos fueron recortados. Lee a continuación, recortado fueron alineado con el genoma de referencia de ratón. Las regiones genómicas que se enriquecieron significativamente para Lee ChIP, en comparación con la muestra de control, se detectaron como picos. Picos significativos, que representan potenciales sitios de unión de factores de transcripción, se filtra y visualizados en un navegador de genoma.

En particular, el método descrito en el presente Protocolo puede ser ampliamente utilizado para ChIP-seq de otros factores de transcripción con cualquier tipo de celular de un número limitado.

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Protocolo

Todos los protocolos experimentales y uso animal se realizó de acuerdo con la guía para el cuidado y uso de animales de laboratorio y aprobados por el Comité institucional de bioseguridad y el Comité de Bienestar Animal en el Universidad de Texas Health Science Center en Houston.

1. purificación de PDGFRα positivo Oligodendrocyte linaje células de cerebro de ratón (modificado de immunopanning anteriormente descrito protocolos5,6,7)

  1. Preparación de una placa de immunopanning para selección de PDGFRα positivo de la célula y 2 placas para agotamiento de las células endoteliales y microglia.
    Nota: Tenga en cuenta que platos de Petri pero no los platos de cultivo celular funcionan para immunopanning experimento; Si va a utilizar para el cultivo de las células purificadas, immunopanning pasos deben llevarse a cabo en el gabinete de seguridad de la biotecnología
    1. Cubrir un 10 cm placa de Petri con 30 μL cabra anti-rata IgG en 10 mL de pH 9.5, 50 mM Tris-HCl durante la noche a 4 ° C. Agitar la placa para asegurarse de que las superficies de las placas son uniformemente y completamente cubiertas por la solución de recubrimiento.
    2. Preparar solución de anticuerpo PDGFRα diluyendo 40 μl de anticuerpo anti-PDGFRα de rata con 12 mL de tampón fosfato salino de Dulbecco (DPBS) que contiene 0.2% de BSA.
    3. Después de 3 lavados de IgG cubierta la placa con 10 mL de 1 x DPBS, incubar la placa revestida de IgG con solución de anticuerpo PDGFRα a temperatura ambiente durante 4 horas.
    4. Lave la placa de recubiertos de anticuerpos anti-PDGFRα rata 3 veces con 10 mL 1 x DPBS. Suavemente Agregar solución DPBS a lo largo de la pared lateral de la placa y no molestan las superficies revestidas.
    5. Capa 2 nuevas placas de Petri de 15 cm para el agotamiento de las células endoteliales y microglia con 20 mL de DPBS que contiene 2,3 μg/mL de lectina Banderiaea simplicifolia 1 (BSL-1) por 2 h.
    6. Lavado de que BSL-1 cubierta placas 3 veces con 20 mL 1 x DPBS. Suavemente Agregar solución DPBS a lo largo de la pared lateral de las placas y no molestes a las superficies recubiertas.
  2. Células de linaje de purificación de PDGFRα positivo oligodendrocyte se modifica a partir de métodos previamente publicados6 , 7 , 8.
    1. Disecar los tejidos corticales de 2 postnatal día 7 (P7) ratón cerebros según previamente protocolos publicados5,6.
    2. Disociar los tejidos para generar una suspensión unicelular con la disociación del tejido neural Kit (P) según instrucciones del fabricante detallado.
    3. Brevemente, cortar los tejidos corticales disecados en trozos con un bisturí y sujetas a digestión enzimática a 37 ° C. Después de la digestión, disociar manualmente las piezas con el fuego pulido vidrio que Pipetas Pasteur en una suspensión unicelular.
    4. Centrifugar la suspensión unicelular a 300 x g durante 10 min a temperatura ambiente y suspender el sedimento celulares usando 15 mL de buffer immunopanning (immunopanning buffer es DPBS con 0,02% de BSA y 5 μg/mL insulina).
    5. Incubar la suspensión unicelular de 2 cerebros de ratón secuencialmente en 2 placas BSL-1 cubierto durante 15 min a temperatura ambiente con agitación suave de la placa cada 5 min para asegurar un mejor agotamiento de microglia y las células endoteliales.
    6. Agitar suavemente la placa para recoger las células no adherente en la suspensión de células e incubar en la placa revestida de anticuerpo de rata-PDGFRα por 45 min a temperatura ambiente.
    7. Después de la incubación de la suspensión de células en la placa revestida de anticuerpo de rata-PDGFRα, suavemente agitar la placa para recoger la suspensión de células y lavar la placa 8 veces con DPBS para deshacerse de las células no adherentes. Suavemente Agregar solución de lavado a lo largo de la pared lateral de la placa y agitar la placa varias veces para deshacerse de las células no adherentes.
    8. Separar las células de la rata-PDGFRα recubiertas de anticuerpos a la placa con 4 mL de tratamiento de solución de separación celular durante 10 min a 37 ° C. Agitar la placa para desalojar las células adherentes.
    9. Recoger el OPC purificada por centrifugación a 300 x g a temperatura ambiente, suspender el precipitado de células con medio de cultivo 2 mL OPC celular y contar las células mediante el uso de azul tripán y un hemocitómetro (500 mL medio de cultivo celular es medio DMEM/F12 que contiene 5 mL solución de penicilina-estreptomicina (P/S), 5 mL N2, 10 mL B27, 5 μg/mL insulina, 0.1% de BSA, 20 bFGF ng/mL y 10 ng/mL PDGFRα).
  3. Validación de la pureza de OPC después de immunopanning.
    1. Para evaluar el enriquecimiento de OPC después de immunopanning, utilice algunas de la OPC purificado para la extracción de RNA con una extracción del tiocianato basada guanidínicos según instrucciones del fabricante.
    2. Realizar qRT-PCR mediante mezcla principal colorante verde fluorescente para comprobar para el enriquecimiento de la expresión de PDGFRα en OPC purificada en comparación con las células del cerebro disociado según los materiales previamente publicados4.
    3. Además, la semilla algunas OPC purificada en el Poly-D-lisina recubierta 24 placas bien por immunostaining con los anticuerpos de anti-NG2 condroitín sulfato proteoglicanos (NG2) como se ha publicado materiales9.

2. bajo-celular ChIP preparación y construcción de biblioteca de ChIP para secuenciación de alto rendimiento

  1. Preparación de ChIP de celular de baja Olig2 con un sistema de sonicación comercialmente disponibles y un número de celda comercialmente disponible bajo ChIP kit (véase tabla de materiales) siguiendo los procedimientos estándar detallados de las instrucciones del fabricante.
    1. Después de separar de la rata anti-PDGFRα placa recubiertos de anticuerpos y celular con azul de tripán y un hemocitómetro ponen 20.000 OPC purificada en medio de cultivo de célula 1 mL OPC para cada reacción de ChIP.
    2. Añadir 27 μl de formaldehído 36.5% para fijar la suspensión celular por 10 min a temperatura ambiente.
      PRECAUCIÓN: Tenga en cuenta que el formaldehído debe ser utilizado en la campana de humos químicos por razones de seguridad.
    3. Deje de ADN-proteína Cross-linking con glicina de 2,5 M de 50 μL por 5 min a temperatura ambiente.
      Nota: Todas las medidas deben realizarse en hielo o en cámara fría de 4 ° C desde este punto.
    4. Lavar el pellet celular reticulado con 1 mL de helado Hanks equilibrada sal solución (HBSS) con inhibidor de la proteasa cóctel y conseguir células peleteadas por una centrífuga previamente enfriada a 300 x g a 4 ° C.
    5. Lyse el precipitado de células en 25 μl completa tampón de lisis durante 5 minutos en hielo.
      Nota: Agitar el tubo para suspender las células en tampón de lisis.
    6. Suplemento el lisado con helada HBSS que contienen cizalla e inhibidor de la proteasa cóctel la cromatina de lisado de células previamente refrigerado por sistema de sonicación con 5 ciclos de 30 s ON y OFF 30 programa 75 μl de la célula. Siempre someter a ultrasonidos 6 tubos juntos y asegúrese de que los tubos de equilibrio contienen 100 μl de agua.
    7. Después de esquilar, centrifugar a 14.000 x g durante 10 min 4 ° C y recoger el sobrenadante en un tubo nuevo después de la centrifugación.
    8. Diluir 100 μl de la cromatina esquilada con un volumen igual de helada Buffer ChIP completo con el inhibidor de proteasa.
    9. Guardar 20 μl de la cromatina diluida esquilada como ejemplo de control de entrada.
      Nota: Ejemplo de control de entrada es también requerida como la comparación a Olig2 immunoprecipitated muestra para identificar Olig2 anticuerpo immunoprecipitated ADN.
    10. Añadir 1 μl de anticuerpo de conejo anti-olig2 a 180 μl de la diluida esquilada cromatina e incubar el tubo de reacción en un disco giratorio a 40 rpm por 16 h a 4 ° C.
      Nota: Realice este paso en una habitación fría.
    11. Para cada reacción de ChIP, lavar 11 μl proteína magnética recubierta A granos con 55 μl tampón de lavado de los granos y ponga el talón pellets en 11 μl de tampón de lavado del grano después de 2 lavados.
      Nota: Realice este paso en una habitación fría.
    12. Para cada reacción de ChIP, añadir 10 μl de pre-lavado perlas de proteína A cubierto al tubo de reacción del ChIP. Realizar este paso en una habitación fría.
    13. Incubar el tubo de reacción de ChIP a 4 ° C para otro 2 h en un disco giratorio.
    14. Poner el tubo de reacción del ChIP sobre la rejilla magnética para 1 minuto.
      Nota: Realice este paso en una habitación fría.
    15. Quite el sobrenadante y no desalojar la pelotilla del grano.
    16. Lavar el sedimento de grano con 100 μl de cada uno de los 4 tampones de lavado respectivamente para 4 minutos en una rueda giratoria a 4 ° C.
    17. Después de lavados, añadir 200 μL de tampón de elución a la pelotilla del grano e incubar el tubo de reacción de ChIP a 65 ° C durante 4 horas revertir la reticulación de proteínas ADN.
    18. Además, añadir 180 μl de tampón de elución a la muestra de control de entrada de 20 μl e incubar a 65 ° C durante 4 h a reticulación proteína ADN así.
    19. Añadir la mezcla de 25:24:1 (v/v) de 200 μL de fenol, cloroformo, alcohol isoamílico a cada tubo de reacción del ChIP.
    20. Vortex vigorosamente por 1 minuto y centrifugar a 13.000 x g durante 15 min a temperatura ambiente. Transferir la fase superior a un tubo nuevo.
    21. Agregar solución de acetato de sodio de 3 M 40 de μl, 1000 μl de etanol al 100% y 2 μl de glucógeno precipitante ligado covalentemente a un tinte azul a cada tubo de reacción de la viruta durante la noche a-20 ° C.
    22. Centrifugar a 13.000 x g por 20 min a 4 ° C.
    23. Eliminar el sobrenadante, lavar con etanol 70% frío a 500 μl y centrifugar a 13.000 x g por 20 min a 4 ° C.
    24. Eliminar el sobrenadante, mantener el aire de pellet seco durante 10 minutos y disolver el precipitado con 50 μl de agua.
  2. Construcción de biblioteca para secuenciación de alto rendimiento de la viruta
    1. Limpiar y concentrar el ChIP de ADN con un kit de limpieza según las instrucciones del fabricante.
    2. Cuantificar la muestra de ChIP por un pico verde según las instrucciones del fabricante.
    3. Utilice un kit de ChIP-seq para T-tailing, replicación y relaves, cambio de plantilla y extensión, además de adaptadores y amplificación, selección de tamaño de la biblioteca y purificación según las instrucciones del fabricante.
      1. Después de la desnaturalización de dsDNA, dephosphorylate el extremo 3' de ssDNA por fosfatasa alcalina camarones y añadir una cola de poli (T) a la ssDNA por la transferasa terminal del deoxynucleotidyl.
      2. Recueza la cartilla de ADN poli (dA) a la plantilla de ssDNA para la replicación del ADN y cambiar de plantilla.
      3. Después de cambiar de plantilla, ampliar la biblioteca de ChIP-seq por PCR con los iniciadores de avance y retroceso para la indexación.
      4. Seleccione la PCR amplifica biblioteca ChIP-seq con fragmentos que van desde 250 hasta 500 bp por perlas paramagnéticas por opción 2 para selección de tamaño doble.
      5. Examinar la calidad de la biblioteca de ChIP-seq seleccionada utilizando un aparato de electroforesis capilar chip microfluídico.

3. Análisis de los datos

  1. Preparar la estructura de directorios.
    1. Cree un directorio para realizar el análisis de datos del ChIP-seq. Dentro del directorio recién creado, crear seis subdirectorios con los nombres siguientes: raw.files, fastqc.output, bowtie.output, homer.output, macs2.output, motif.analysis e informes.
  2. Preparar datos y realizar análisis de control de calidad de datos de la secuencia cruda.
    1. El directorio "raw.files" y descargar los archivos de datos del ChIP-seq.
    2. Verificar los nombres de archivo. Si la secuencia era fin emparejados, habrá 4 archivos (dos para el tratamiento) y dos para la entrada con nombres similares de base: PDGFRα_Olig2.read1.fastq, PDGFRα_Olig2.read2.fastq, PDGFRα_input.read1.fastq y PDGFRα_input.read2.fastq. Si los nombres de archivo son diferentes, cambie el nombre usando el comando "mv".
    3. Mueva el directorio "fastqc.output".
    4. Obtener métricas de control de calidad de la raw Lee utilizando un fastq archivo control de calidad software10. Utilice el comando S1A figura a ejecutar el proceso de control de calidad por separado para cada fichero fastq. El software mostrará varias métricas de control de calidad en un archivo html.
    5. Abra el archivo html de control de calidad y verificar el número de lecturas, leer longitud, por la calidad de la secuencia de bases, por puntuaciones de calidad de secuencia, contenido de GC de secuencia, niveles de duplicación secuencia, adaptador contenido y contenido de kmer.
  3. Recortar final Lee de baja calidad y contenido de adaptador.
    1. Observar la "por la calidad de la secuencia de bases" y "Contenido de adaptador" parcelas. Determinar la longitud de corte de la cabeza y la cola de cada lectura. Una longitud adecuada para el ajuste es donde la calidad base cae por debajo de 30 y hay pruebas de contenido de adaptador.
    2. Mueva el directorio "raw.files".
    3. Descargar e instalar un software para cortar Lee11. Utilice el comando Figura S1B para cortar el tratamiento y la entrada por separado. Parámetro 'Cultivo' indica la longitud restante leer recorte las bases del final y 'HEADCROP' especifica el número de bases que eliminarse desde el inicio de la lectura.
    4. El comando de recorte también incluye el mínimo leer longitud ser aceptado después de filtrar en el parámetro 'MINLEN'. Si las lecturas son por lo menos 50 bp, bp uso 35 como el umbral de longitud leer.
    5. Mueva el directorio "fastqc.output".
    6. Realizar el análisis de control de calidad de fichero fastq después de recortar la Lee. Verificar que se han resueltos los problemas de control de calidad. Utilice el comando Figura S1C para obtener las métricas de control de calidad.
  4. Alinee el solo extremo o extremo apareado Lee ChIP-seq para el genoma de referencia de ratón.
    1. Hacia el directorio "bowtie.output" para la asignación.
    2. Descargar el genoma de referencia GENCODE mm10 ratón. Cambie el nombre el genoma de referencia mm10 ratón "mm10.fa".
    3. Descargar leer mapper12 e instalar en el sistema.
    4. Crear un archivo de índice del genoma de referencia descargado utilizando el comando Figura S2A. Automáticamente se crean seis archivos: mm10.1.bt2, mm10.2.bt2, mm10.3.bt2, mm10.4.bt2, mm10.rev.1.bt2 y mm10.rev.2.bt2.
    5. Utilice el comando Figura S2B para ejecutar la alineación y ajustar el parámetro "-p" al número de núcleos de procesamiento según la configuración del sistema. Si ejecuta el modo extremo apareado, los parámetros de "-1" y "-2" indican los nombres de los archivos recortados fastq.
      Nota: El mapeo se realiza por separado para las muestras de tratamiento y la entrada y se crean los archivos de salida registro de métricas para cada muestra.
    6. Descargar un software para manipular archivos en el formato de SAM13 e instalar en el sistema. Convertir el archivo SAM alineado en un archivo BAM mediante el comando Figura S2C.
  5. Obtener métricas de control de calidad de lecturas asignadas antes de pico para ambas muestras de tratamiento y el control extremo apareado.
    1. Una de las métricas de control de calidad más importantes para la dirección es la profundidad de la secuencia. Abra los archivos "log.bowtie.PDGFRα_Olig2.txt" y "log.bowtie.PDGFRα_input.txt" en el directorio bowtie.output y verifique que el número de pares de leer únicamente asignados en cada muestra es mayor que 10 millones.
    2. Mueva el directorio "homer.output".
    3. Descargar un software para el descubrimiento de adorno y de análisis de secuenciación de próxima generación14 e instalar en el sistema.
    4. Crear un directorio llamado "tagDir".
    5. Para verificar el clonality de etiqueta, utilice el comando representado en Figura S3A. El comando "makeTagDirectory" generará cuatro files:tagAutocorrelation.txt de salida de control de calidad, tagCountDistribution.txt, tagInfo.txt y tagLengthDistribution.txt.
    6. Mueva el directorio "tagDir".
    7. Copie el archivo "tagCountDistribution.txt" en el directorio de "informes".
    8. Mueva el directorio de "informes".
    9. Abra el archivo tagCountDistribution.txt usando un programa de hoja de cálculo y crear una barra de parcela del número de etiquetas por posición genómica. Guarde el archivo histograma con el nombre "tag.clonality.xlsx".
    10. Instalar R programación lengua15 en el sistema.
    11. En el terminal, tipo 'R' y pulse ENTER para acceder al entorno de programación de R.
    12. Descargar un paquete de R para el procesamiento de datos del ChIP-seq16 e instalarlo mediante el comando representado en Figura S3B.
    13. Utilizar el script de R en S3C figura para representar la correlación cruzada de filamento.
  6. Detección de picos mediante un asignador de pico.
    1. Mueva el directorio "macs2.output". Descargar e instalar un pico mapper17 en su sistema.
    2. Utilice la función "callpeak" con el tratamiento y control de archivos BAM generados en el paso 3.4.6.
      Nota: Incluyen otros parámetros "-f" para el formato de archivo de entrada, "-g" para el tamaño del genoma, "-nombre" para indicar el nombre de la base de todos los archivos de salida, y "-B" para guardar el cacharro de fragmento en formato bedgraph. Figura S4Aincluye el pico completo comando. Utilice BEDPE para las muestras finales emparejados.
    3. Verificar que el asignador de pico generado seis archivos: PDGFRα_Olig2_vs_PDGFRα_input_peaks.xls, PDGFRα_Olig2_vs_PDGFRα_input_peaks.narrowPeak, PDGFRα_Olig2_vs_PDGFRα_input_summits.bed, PDGFRα_Olig2_vs_PDGFRα_input_model.r, PDGFRα_Olig2_vs_ PDGFRα_input_control_lambda.bdg y PDGFRα_Olig2_vs_PDGFRα_input_treat_pileup.bdg.
    4. Abrir el archivo PDGFRα_Olig2_vs_PDGFRα_input_peaks.xls para ver los picos llamados, la ubicación, longitud, posición Cumbre, cacharro y las métricas de enriquecimiento máximo:-log10(pvalue), doblez de enriquecimiento y - log10(q-value).
  7. Filtro y anotar llamados picos.
    1. Con el archivo abierto en el paso anterior, filtra los picos resultantes según el enriquecimiento de la doblez, el valor p y el valor de q. Para decidir los umbrales de filtrado adecuados, hacer un diagrama de histograma para determinar la densidad de cada métrica. Filtrar valores umbral seleccionado para obtener picos significativos.
    2. Descargar la lista negra de mm10 (regiones son conocidas por tener señal artificialmente alta) y filtrar el ChIP-seq picos que están dentro de alguna de esas regiones del artefacto.
    3. Crear un archivo de cama con los picos filtrados que contiene las siguientes columnas: cromosoma, Inicio, fin, peakID, mock y filamento. Llenar la columna falsa con un punto "." ya que no se utiliza. En la columna de hebra, establece todos los valores en "+". Guarde el archivo de la cama como "filtered.peakData2.bed".
    4. Copie el archivo "filtered.peakData2.bed" en el directorio de "informes".
    5. Mueva el directorio de "informes".
    6. Para anotar picos filtrados a una región del gen específico, utilice la función "annotatePeaks" con el archivo de cama creada en el paso anterior. El comando utilizado se muestra en la Figura S5A.
    7. Abra el archivo "filtered.annotatedPeaks.txt" utilizando un software estadístico.
    8. Filtro de picos resultantes en una región intergénica a una distancia mayor a 5 kb de un TSS anotado. Utilice la columna de "Distancia al SAT" en el archivo de la distancia para el filtrado. Guarde los picos filtrados en un archivo de excel llamado "5kbup.geneBody.peakData.txt".
    9. Tienda el resultado filtrado picos en un archivo bedGraph con columnas: cromosoma, comienzo, fin y - log10(q-value). Nombre del archivo "5kbup.geneBody.peakData.bedGraph".
  8. Generar archivos de bigwig de visualización del navegador.
    1. Descargar e instalar un software para genoma aritmética18.
    2. Una herramienta para convertir bedgraph a pez gordo de descargar e instalar en el sistema. Descargue el archivo 'mm10.chrom.sizes'.
    3. Utilice el comando Figura S6A para generar un archivo de bigwig.
    4. Descargar e instalar un navegador genoma del19 en el sistema.
    5. Abrir el navegador de genoma y cargar el archivo "5kbup.geneBody.peakData.bigwig" para visualizar los picos significativos filtrados y su ubicación con respecto a los genes conocidos.
  9. Búsqueda de motivos.
    1. Mueva el directorio "motif.analysis".
    2. Descargar un de novo motivo de exploración y programa de enriquecimiento de adorno y lo instala en su sistema20.
    3. Descargar una base de datos integral motivo que incluye motivos de Olig2.
    4. Obtener las secuencias genómicas de 500 regiones de bp, centradas en las cumbres de pico significativo. Almacenar las secuencias como peak.sequences.txt. Utilice el comando en la Figura S7 para buscar motivos de Olig2 dentro de cada una de las regiones de pico 500 bp.
    5. Los motivos resultantes usando un E-valor adecuado del filtro (por defecto = 0.05).

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Resultados

Fue realizada bajo celular ChIP-seq y bioinformáticas de análisis se realizaron para investigar las posibles interacciones del factor transcripcional Olig2 con ADN genómico purificado agudo cerebro OPC. La figura 1 muestra un flujo de trabajo general de la experimental y los procedimientos de análisis de datos. En este protocolo, cerebros de ratones postnatales se disocian en una suspensión unicelular. Después de la disociación del tejido, immunopanning reali...

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Discusión

Redes de regulación genética mamíferos son muy complejas. ChIP-seq es un potente método para investigar las interacciones de la proteína del genoma-ADN. Este protocolo incluye cómo se realiza Olig2 ChIP-seq con una cantidad baja de OPC purificada de cerebro de ratón (tan bajo como 20 mil células por reacción). El primer paso clave de este protocolo es la purificación de OPC de cerebro de ratón por immunopanning con el anticuerpo PDGFRα. Para la selección positiva de OPC con placas PDGFRα revestido, atan a menudo débil OP...

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Divulgaciones

Los autores declaran que no tienen intereses financieros que compiten.

Agradecimientos

JQW, XD, RCDD y YY fueron apoyados por becas de los institutos nacionales de salud R01 NS088353; NIH grant 1R21AR071583-01; el Staman Ogilvie fondo-Memorial Hermann Foundation; la iniciativa de cerebro UTHealth y CTSA UL1 TR000371; y una beca de la Universidad de Texas sistema Neurociencia y Neurotecnología Research Institute (Grant #362469).

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Reactivo/ Equipo
Banderiaea simplicifolia lectina 1Vector Laboratories# L-1100
Rata anticuerpo anti-PDGFRaBD Bioscience# 558774
Kit de disociación de tejido neural (P)MACS Miltenyi Biotec# 130-092-628
TecnologíasAccutase STEMCELL# 07920
TRIzolThermo Fisher# 15596026
Anti-NG2 Sulfato de Condroitina Anticuerpo ProteoglicanoMillipore# AB5320
Dispositivo de sonicación Bioruptor PicoDiagenode# B01060001
True MicroChIPkit Diagenode# C01010130
Fenol:Cloroformo:Alcohol isoamílico (25:24:1, v/v)Thermo Fisher# 15593031
NucleoSpin Gel y kit de limpieza de PCRMACHEREY-NAGEL #740609
Quant-iT PicoGreen dsDNA KitThermo Fisher# P11496
DNA SMART ChIP-Seqkit Clontech Laboratories# 634865
Agencourt AMPure XPBeckman Voulter# A63880
GlycoBlueThermo Fisher# AM9516
pico-verdeThermo Fisher# P11496
D-PBSThermo Fisher# 14190-144
SYBR Mezcla maestra verdeBio-Rad Laboratories# 1725124
DMEM/F12Fisher Scientific# 11-320-033
Penicilina-Estreptomicina (P/S)Fisher Scientific# 15140122
Suplemento N-2Fisher Scientific# 17502048
B-27 SuplementoFisher Scientific# 17504044
insulinaSigma# I6634Prepare una solución de insulina de 0,5 mg/ml disolviendo 5 mg de insulina en 10 ml de agua y 50 μ l de 1 N HCl.
Albúmina sérica bovina, apta para cultivo celular (BSA)Sigma# A4161Prepare una solución de BSA al 4% disolviendo 4 g de BSA en 100 ml de D-PBS y ajuste el pH a 7,4
Proteína básica del factor de crecimiento de fibroblastos, recombinante humano (bFGF)EMD Millipore# GF003
PDGF-AAVWR# 102061-188
poli-D-lisinaVWR# IC15017510Prepare 1 mg/ml de solución de poli-D-lisina disolviendo 10 mg de poli-D-lisina en 10 ml de agua y diluya 100 veces cuando lo use.
Placas de Petri Desechables Falcon, Estériles, Corning, 100x15mmVWR# 25373-100
Placas de Petri Desechables Falcon, Estériles, Corning, 150x15mmVWR# 25373-187
HBSS, 10X, sin Calcio, sin Magnesio, sin FenolRed Fisher Scientific# 14185-052
Trypan BlueStemcell Technologies# 07050
Cóctel de inhibidores de proteasaSigma# 11697498001
Software
FastQC[10] http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/Obtención de métricas de control de calidad de lecturas sin procesar y recortadas
Trimmomatic 0.33[11] http://www.usadellab.org/cms/?page=trimmomaticRecorte y filtrado de lecturas
sin procesarGENCODE mm10ftp://ftp.sanger.ac.uk/pub/gencode/Gencode_mouse/release_M15/GRCm38.primary_assembly.genome.fa.gzGenoma de referencia del ratón
Bowtie2 2.2.4[12] http://bowtie-bio.sourceforge.net/bowtie2/index.shtmlAlineación de lecturas a un genoma de referencia
SAMTools 1.5[13] http://samtools.sourceforge.net/Convertir un archivo SAM a formato BAM
HOMER 4.9.1[14] http://homer.ucsd.edu/homer/Creación de un directorio de etiquetas y anotación de regiones genómicas enriquecidas con símbolos genéticos
R 3.2.2[15] https://www.R-project.org/Programación de scripts y ejecución de funciones
SPP 1.13[16] https://github.com/hms-dbmi/sppCreación de un gráfico de correlación cruzada de hebras
MACS2 2.2.4[17] https://github.com/taoliu/MACSEncontrar regiones de enriquecimiento de ChIP sobre el control
BEDTools 2.25[18] http://bedtools.readthedocs.io/en/latest/Aritmética del genoma
bedGraphToBigWighttp://hgdownload.cse.ucsc.edu/admin/exe/Convertir el archivo bedGraph en
un navegador IGV bigwig 2.3.58[19] http://software.broadinstitute.org/software/igv/Visualización y navegación de picos significativos de ChIP-seq Microsoft
ExcelPrograma Spreasheet
Lista negra de ENCODEhttps://sites.google.com/site/anshulkundaje/projects/blacklistsPicos de filtrado
mm10.chrom.sizeshttp://hgdownload.cse.ucsc.edu/goldenPath/mm10/bigZips/mm10.chrom.sizes.Conversión del archivo bedGraph en la
base de datos de motivos de ENCODE[25] http://compbio.mit.edu/encode-motifs/Se requiere una base de datos completa de motivos para el enriquecimiento de motivos
MEME-ChIP[20] http://meme-suite.org/index.htmlAnálisis de enriquecimiento de motivos y descubrimiento
de motivosNombres de cebadores utilizados para qPCR cebadores fuertes utilizadas para qPCR
Mbp-F:CTATAAATCGGCTCACAAGG
Mbp-R:AGGCGGTTATTAAGAAGC
Iba1-F:ACTGCCAGCCTAAGACAACC
Iba1-R:GCTTTTCCTCCCTGCAAATCC
Mog-F:GGCTTCTTGGAGGAAGGGAC
Mog-R:TGAATTGTCCTGCATAGCTGC
GAPDH-FATGACATCAAGAAGGTGGTG
GAPDH-RCATACCAGGAAATGAGCTTG
Tuj1-FTTTTCGTCTCTAGCCGCGTG
Tuj1-RGATGACCTCCCAGAACTTGGC
PDGFRα-FAGAGTTACACGTTTGAGCTGTC
PDGFRα-RGTCCCTCCACGGTACTCCT

Referencias

  1. Wu, J. Q., et al. Tcf7 is an important regulator of the switch of self-renewal and differentiation in a multipotential hematopoietic cell line. PLoS Genet. 8 (3), e1002565(2012).
  2. Zuchero, J. B., Barres, B. A. Intrinsic and extrinsic control of oligodendrocyte development. Curr Opin Neurobiol. 23 (6), 914-920 (2013).
  3. Liu, Z., et al. Induction of oligodendrocyte differentiation by Olig2 and Sox10: evidence for reciprocal interactions and dosage-dependent mechanisms. Dev Biol. 302 (2), 683-693 (2007).
  4. Dong, X., et al. Comprehensive Identification of Long Non-coding RNAs in Purified Cell Types from the Brain Reveals Functional LncRNA in OPC Fate Determination. PLoS Genet. 11 (12), e1005669(2015).
  5. Hilgenberg, L. G., Smith, M. A. Preparation of dissociated mouse cortical neuron cultures. J Vis Exp. (10), e562(2007).
  6. Emery, B., Dugas, J. C. Purification of oligodendrocyte lineage cells from mouse cortices by immunopanning. Cold Spring Harb Protoc. 2013 (9), 854-868 (2013).
  7. Cahoy, J. D., et al. A transcriptome database for astrocytes, neurons, and oligodendrocytes: a new resource for understanding brain development and function. J Neurosci. 28 (1), 264-278 (2008).
  8. Zhang, Y., et al. An RNA-sequencing transcriptome and splicing database of glia, neurons, and vascular cells of the cerebral cortex. J Neurosci. 34 (36), 11929-11947 (2014).
  9. Cheng, X., et al. Bone morphogenetic protein signaling and olig1/2 interact to regulate the differentiation and maturation of adult oligodendrocyte precursor cells. Stem Cells. 25 (12), 3204-3214 (2007).
  10. Andrews, S. FastQC: A quality control tool for high throughput sequencing data. , Available from: http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/ (2018).
  11. Bolger, A. M., Lohse, M., Usadel, B. Trimmomatic: a flexible trimmer for Illumina sequence data. Bioinformatics. 30 (15), 2114-2120 (2014).
  12. Langmead, B., Salzberg, S. L. Fast gapped-read alignment with Bowtie 2. Nat Methods. 9 (4), 357-359 (2012).
  13. Li, H., et al. The Sequence Alignment/Map format and SAMtools. Bioinformatics. 25 (16), 2078-2079 (2009).
  14. Heinz, S., et al. Simple combinations of lineage-determining transcription factors prime cis-regulatory elements required for macrophage and B cell identities. Mol Cell. 38 (4), 576-589 (2010).
  15. Team, R. C. A language and environment for statistical computing. R Foundation for Statistical Computing. , (2015).
  16. Kharchenko, P. V., Tolstorukov, M. Y., Park, P. J. Design and analysis of ChIP-seq experiments for DNA-binding proteins. Nat Biotechnol. 26 (12), 1351-1359 (2008).
  17. Zhang, Y., et al. Model-based analysis of ChIP-Seq (MACS). Genome Biol. 9 (9), R137(2008).
  18. Quinlan, A. R., Hall, I. M. BEDTools: a flexible suite of utilities for comparing genomic features. Bioinformatics. 26 (6), 841-842 (2010).
  19. Robinson, J. T., et al. Integrative genomics viewer. Nat Biotechnol. 29 (1), 24-26 (2011).
  20. Bailey, T. L., et al. MEME SUITE: tools for motif discovery and searching. Nucleic Acids Res. 37 (Web Server issue), W202-W208 (2009).
  21. Sims, D., Sudbery, I., Ilott, N. E., Heger, A., Ponting, C. P. Sequencing depth and coverage: key considerations in genomic analyses. Nat Rev Genet. 15 (2), 121-132 (2014).
  22. Landt, S. G., et al. ChIP-seq guidelines and practices of the ENCODE and modENCODE consortia. Genome Res. 22 (9), 1813-1831 (2012).
  23. Consortium, E. P. An integrated encyclopedia of DNA elements in the human genome. Nature. 489 (7414), 57-74 (2012).
  24. Mazzoni, E. O., et al. Embryonic stem cell-based mapping of developmental transcriptional programs. Nat Methods. 8 (12), 1056-1058 (2011).
  25. Kheradpour, P., Kellis, M. Systematic discovery and characterization of regulatory motifs in ENCODE TF binding experiments. Nucleic Acids Res. 42 (5), 2976-2987 (2014).
  26. Dugas, J. C., Tai, Y. C., Speed, T. P., Ngai, J., Barres, B. A. Functional genomic analysis of oligodendrocyte differentiation. J Neurosci. 26 (43), 10967-10983 (2006).
  27. Gilfillan, G. D., et al. Limitations and possibilities of low cell number ChIP-seq. BMC Genomics. 13, 645(2012).
  28. Raskatov, J. A., et al. Modulation of NF-kappaB-dependent gene transcription using programmable DNA minor groove binders. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (4), 1023-1028 (2012).
  29. Cheneby, J., Gheorghe, M., Artufel, M., Mathelier, A., Ballester, B. ReMap 2018: an updated atlas of regulatory regions from an integrative analysis of DNA-binding ChIP-seq experiments. Nucleic Acids Res. , (2017).
  30. Yevshin, I., Sharipov, R., Valeev, T., Kel, A., Kolpakov, F. GTRD: a database of transcription factor binding sites identified by ChIP-seq experiments. Nucleic Acids Res. 45 (D1), D61-D67 (2017).
  31. Kulakovskiy, I. V., et al. HOCOMOCO: a comprehensive collection of human transcription factor binding sites models. Nucleic Acids Res. 41 (Database issue), D195-D202 (2013).
  32. Jain, D., Baldi, S., Zabel, A., Straub, T., Becker, P. B. Active promoters give rise to false positive 'Phantom Peaks' in ChIP-seq experiments. Nucleic Acids Res. 43 (14), 6959-6968 (2015).
  33. Gerstein, M. B., et al. Architecture of the human regulatory network derived from ENCODE data. Nature. 489 (7414), 91-100 (2012).

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Reimpresiones y permisos

Etiquetas

ChIP-seq de Olig2células PDGFR-alfa positivascélulas precursoras de oligodendrocitosprocedimiento de inmunoselecciónfragmentación de la cromatinaanálisis bioinformáticositios de unión a escala genómicaanálisis de factores de transcripciónpurificación de células primarias
Identificar sitios de transcripción Factor Olig2 Unión genómica en agudo purificada PDGFRα + células por inmunoprecipitación de cromatina celular bajo análisis de la secuencia
Contáctenos
Recomendar a la biblioteca

Privacidad

Términos de uso

Políticas

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Todos los derechos reservados.