Cultivos primarios de raíz dorsal (GRD) de los ganglios se utilizan con frecuencia para estudiar las funciones fisiológicas o eventos relacionados con patología en las neuronas sensoriales. Aquí, se demuestra el uso de culturas DRG lumbares para detectar la liberación de neurotransmisores después de receptor del neuropéptido FF tipo 2 estimulación con un agonista selectivo.
Se requiere una suscripción a JoVE para ver este contenido. Inicie sesión o comience su prueba gratuita.
Artículo de método
Aislamiento de los ganglios de raíz dorsal y en cultivo primario para el estudio de liberación de neurotransmisor
En este artículo
Resumen
Resumen
Ganglios de raíz dorsal (GRD) contienen cuerpos celulares de neuronas sensoriales. Este tipo de neurona es pseudo-unipolar, con dos axones que inervan los tejidos periféricos, tales como piel, músculo y órganos viscerales, así como el cuerno dorsal espinal del sistema nervioso central. Las neuronas sensoriales transmiten sensación somática, como tacto, dolor, sensaciones térmicas y propioceptivas. Por lo tanto, cultivos primarios DRG son ampliamente utilizados para estudiar los mecanismos celulares del nociception, funciones fisiológicas de las neuronas sensoriales y desarrollo neuronal. Las neuronas cultivadas pueden aplicarse en estudios de electrofisiología, transduction de la señal, liberación de neurotransmisor o proyección de imagen de calcio. Con cultivos primarios de DRG, los científicos pueden cultura disociada las neuronas DRG para monitorear los cambios bioquímicos en solo o varias celdas, superando muchas de las limitaciones asociadas con experimentos en vivo . En comparación con comercialmente disponibles líneas celulares de hibridoma DRG o inmortalizadas las líneas de células neuronales de DRG, la composición y propiedades de las células primarias son mucho más similares a las neuronas sensoriales en el tejido. Sin embargo, debido al limitado número de DRG primaria las células cultivadas que pueden ser aislados de un solo animal, es difícil realizar pantallas de alto rendimiento de drogas dirigidas a estudios. En el actual artículo, se describen los procedimientos para la colección de DRG y la cultura. Además, demostramos que el tratamiento de células cultivadas de DRG con un agonista del receptor del neuropéptido FF tipo 2 (NPFFR2) para inducir la liberación de neurotransmisores péptido (péptido relacionado con el gen de la calcitonina (CRGP) y sustancia P (SP)).
Introducción
Los cuerpos celulares de las neuronas sensoriales están contenidos dentro de DRG. Estas neuronas son pseudo-unipolares e inervan los tejidos periféricos y el sistema nervioso central. Las terminaciones nerviosas periféricas de las neuronas sensoriales se encuentran en el músculo, piel, órganos viscerales y óseas, entre otros tejidos. Transmiten las señales de sensación periférica nervio conclusiones en el cuerno dorsal espinal y las señales se transmiten luego al cerebro a través de diferentes vías ascendentes de la sensibilidad somática1,2. Sensación somática permite al cuerpo a sentir (es decir<....
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Protocolo
Todos los métodos descritos que utilizan animales de experimentación fueron aprobados por el institucional cuidado Animal y el Comité uso (IACUC) de Chang Gung University (CGU 13-014).
1. recoger DRG Lumbar de las ratas experimentales
- Utilizar 2 a 3 ratas de Sprague-Dawley (SD) semana para colección de DRG lumbar.
Nota: Las neuronas DRG obtenidas de ratas durante 4 semanas de edad no crecen bien bajo las condiciones de cultivo descritas. - Esterilizar todos los instrumentos quirúrgicos en una autoclave.
- Anestesiar la rata con una mezcla 1:1 de tiletamina y zolazepam (20 mg/kg, inyección intraperitoneal (IP)) y....
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Resultados
Rata lumbar DRG neuronas cultivadas en un plato 24-well, fueron cultivadas en medio de cultivo con Ara-C adicional para inhibir la proliferación de células gliales y NGF para apoyar el crecimiento neuronal. La morfología de la vida se observaron células DRG. Como se muestra en la figura 3, el cuerpo celular de una neurona sola fue atado en el fondo de un plato en 1 día y seleccionado para la observación. Crecimiento del Axon fue monitoreado desde el día 1-3. .......
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Discusión
En el presente artículo, nos muestran la colección, disociación de la enzima y la cultura de lumbar de la rata DRG. Con el apoyo de neurotróficos de NGF, los axones de las neuronas DRG extendido dentro de 3 días después de la siembra de células. Los axones extendidos fueron claramente observables después de que las células se tiñeron para proteína CGRP, que es sintetizada en el soma celular y transportada a lo largo de las fibras de axones. Los procesos de células satélite también extendidos, permitiendo que estas célula.......
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Agradecemos a Dr. M. Calkins para la edición de inglés. Este trabajo fue apoyado por el Chang Gung Memorial Hospital (CMRPD1F0482), Chang Gung University, centro de investigación de envejecimiento saludable (EMRPD1G0171) y Ministerio de ciencia y tecnología (105-2320-B-182-012-MY2).
....Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Mezcla de tiletamina y zolazepam (Zoletil) | Virbac | Zoletil 50 | anestésico |
| Suero fetal bovino | Industrias Biológicas | 04-001-1 | Medio de cultivo |
| Piruvato de sodio | Sigma | S8636 | Medio de |
| cultivo Penicilina/estreptomicina | Industrias Biológicas | 03-033-1 | Medio de cultivo |
| DMEM-F12 | Invitrogen | 12400024 | Medio de cultivo |
| Poly-l-lisina | Sigma | P9011 | Plato de recubrimiento |
| Colagenasa IA | Sigma | 9001-12-1 | Digestión enzimática |
| Solución salina equilibrada de Hank | Invitrogen | 14170-112 | Medio de cultivo |
| Tripsina EDTA | Biological Industries | 03-051-5 | Digestión enzimática |
| Pasteur pipeta | Hilgenberg | 3150102 | Trituración celular |
| Citarabina (Ara-C) | Sigma | C6645 | Medio de cultivo |
| NGF | Millipore | NC011 | Medio de cultivo |
| NPFFR2 siRNA | Dharmacon | L-099691-02-0005 | Transfección |
| SiRNA no dirigido | Dharmacon | L-001810-10-05 | Transfección |
| NeuroPORTER Reactivo | Genlantis | T400150 | Reactivo de transfección |
| dNPA | Genemed Synthesis | N/A | NPFFR2 agonista |
| CGRP ELISA | Cayman | 589001 | EIA |
| SP ELISA | Cayman | 583751 | EIA |
| Anticuerpo CGRP | Calbiochem | PC205L | IHC |
| DAPI | Roche | 10236276001 | IHC |
Referencias
- Bear, M. F., Connors, B. W., Paradiso, M. A. Neuroscience: exploring the brain. , 3 edn, Lippincott Williams & Wilkins. (2007).
- Hunt, S. P., Mantyh, P. W. The molecular dynamics of pain control. Nat Rev Neurosci. 2 (2), 83-91 (2001).
- Kandel, E. R., Schwartz, J. H., Jessell, T. M.
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Reimpresiones y permisos
