Profundo dérmico inyección como un modelo de infección de la piel Candida albicans para el análisis histológico

Resumen

Aquí se describe un protocolo que permite el análisis histológico y molecular de muestras de piel después de la inyección intradérmica de Candida albicans . Este protocolo mantiene la integridad estructural de la piel y permite la localización de las células inmunes residentes de tejido o recién contratadas así como la distribución de patógenos.

Resumen

La piel es un órgano extremadamente extendido del cuerpo y, debido a esta gran superficie, está continuamente expuesto a microorganismos. Daño de la piel puede fácilmente conducir a infecciones en la dermis que, a su vez, resulta en la diseminación de patógenos en el torrente sanguíneo. Entender cómo el sistema inmunológico combate infecciones en la etapa muy temprana y cómo el host puede eliminar los patógenos es un paso importante para establecer la base para futuras intervenciones terapéuticas. Aquí describimos un modelo de infección por Candida albicans que puede visualizar los procesos que ocurren durante una infección, incluso cuando el patógeno ha superado la barrera epitelial, así como la respuesta inmune provocada por el C. albicans invasión. Se utilizó este modelo de infección realizar análisis histológicos que muestran las células inmunes que infiltran la piel, así como la presencia y localización del patógeno. Las muestras recogieron después de la infección puede ser procesada para la extracción de RNA.

Introducción

El cuerpo humano se cubre con un número extremadamente alto de microorganismos. La superficie de la piel es el hábitat de casi 1 millón de bacterias por centímetro cuadrado¹. Este número, sin embargo, no refleja la completa variedad de microorganismos que coloniza la piel. Además de las bacterias, el cuerpo humano es colonizado por muchas especies de hongos, incluyendo C. albicans, que es capaz de sobrevivir tanto en la mucosa y la piel nivel².

En los últimos años, el porcentaje de personas diagnosticadas con infecciones micóticas ha aumentado enormemente. Esto es principalmente debido al mayor número de personas inmunocomprometidas, es decir, pacientes seropositivos y pacientes que han pasado por quimioterapia o fármacos inmunosupresores después del trasplante³. En un estudio de vigilancia realizado en los Estados Unidos, Wisplinghoff et al demostró que 9,5% de las infecciones de torrente sanguíneo nosocomial fueron causadas por Candida especies⁴. Debido a la mayor ocurrencia de infecciones por hongos y sobre todo por el elevado porcentaje de especies de Candida durante las infecciones del torrente sanguíneo , entender cómo este patógeno escapa del control del sistema inmunitario es extremadamente importante.

C. albicans es un hongo dimorfo que crece en diferentes formas morfológicas tales como levadura, pseudomicelio, pseudohyphae e hifas dependiendo de las condiciones ambientales⁵. En su forma hifal, C. albicans muestra su mayor capacidad de invasión y tiene la capacidad de penetrar el epitelio⁶.

Infecciones por C. albicans se han estudiado utilizando varias aproximaciones experimentales. El modelo más común de infección es la inyección intravenosa de C. albicans levadura⁷. Sin embargo, este modelo no toma en cuenta todos los procesos que suceden antes de que el hongo se las arregla para difundir al torrente sanguíneo. Otro modelo aprovecha la habilidad de C. albicans para invadir el epitelio. Este método, también conocido como el papel de la arena modelo⁸, fue desarrollado por Gaspari et en 1998⁹y consiste en utilizar papel de lija para desgastar la piel, eliminando la capa córnea antes de aplicar la C. albicans. Este procedimiento permite que el hongo al penetrar en el epitelio, lo que permite el análisis de la capacidad invasiva de este patógeno. Por último, otros modelos de infecciones gastrointestinales¹⁰ y vías respiratorias¹¹ se han utilizado en diferentes estudios.

La formación de una herida (como en el modelo de papel de lija) provoca la activación de varias vías, incluyendo el reclutamiento de células inmunes y activación, con el fin de promover la curación del proceso¹². Esto puede alterar o enmascarar la respuesta inmune provocada específicamente contra el patógeno, lo que conduce a la confusión de resultados.

Aquí describimos un método de infección de la piel que evita la formación de la herida inicial y la inducción de un entorno inflamatorio basal. Para mantener la estructura epitelial intacta, inyectamos directamente C. albicans en su forma hifal en la dermis profunda. A pesar de que una sola inyección puede provocar inflamación leve, la cantidad de inflamación está limitada y restringida en comparación con la formación de una herida abierta como en el modelo de papel de lija. El método que se describe aquí permite el estudio de la respuesta inmunológica a la infección por hongos y la propagación evitando el ambiente inflamatorio excesivo y preexistente causado por daños mecánicos.

Protocolo

Todos los procedimientos fueron aprobados bajo el cuidado institucional del Animal y el Comité uso (IACUC) y operados bajo la supervisión del Departamento de recursos de animales a los niños del Hospital (arco) en el Hospital infantil de Boston o fueron aprobadas por el italiano Ministerio de salud y el Comité institucional cuidado Animal en la Universidad de Milano-Bicocca.

1. preparación de C. albicans

1. Cultivo de C. albicans, cepa CAF3 1¹³, en tubos que contengan medio Rico (levadura extracto peptona dextrosa (YEPD), extracto de levadura 1% (w/v), 2% (w/v) de Bacto peptona, glucosa de 2% (w/v)) suplementado con uridina (50 mg/L) a 25 ° C. En estas condiciones, C. albicans crece como una levadura.
   Nota: Otras cepas de C. albicans pueden utilizarse, tales como la clínica aislar C. albicans tensión SC5314¹³. Puesto que hemos demostrado recientemente que el proceso ulceroso es inducido por la activación del sistema inmune innato¹⁴, teóricamente cada cepa de C. albicans que mantiene sus componentes de pared celular y estructura, así como capacidad para originar proyecciones hifal, podría ser utilizado.
2. Vigilar la cultura contando la concentración celular utilizando un analizador de contador de células.
3. La cultura de la cosecha cuando alcanza una concentración de aproximadamente 8 x 10⁶ células/mL. Como alternativa, utilice un espectrofotómetro para medir el OD₆₀₀.
   Nota: Generalmente, un valor de OD₆₀₀ = 1 corresponde a una concentración de la levadura de 3 x 10⁷ células/mL, pero se recomienda la titulación.
4. Resuspender el cultivo en medio YEPD-uridina, con HEPES (50 mM, pH 7,5) como agente tampón e incubar el cultivo a 37 ° C para inducir la formación de hifas. Comprobar formación hyphal bajo un microscopio a 100 aumentos. Formación hifal es visible 5 h después de cultivo a 37 ° C; sin embargo, usar las células 16 h después de la incubación a 37 ° C cuando el porcentaje hyphal alcanza casi el 95% de la cultura total.
5. Para enriquecer más lejos la preparación en la concentración hifal, alícuotas de la centrifugadora de la cultura a 3.300 x g por 5 min deseche el sobrenadante y resuspender el precipitado en PBS estéril a una concentración de 1 x 10⁸ hifas/mL.

2. la inyección cutánea profunda

1. antes de 24 h el procedimiento de infección anestesiar los ratones con una inyección intraperitoneal de ketamina (80-100 mg/kg) y xilacina (10 mg/kg) y luego afeitarse el flanco de los ratones con una maquinilla eléctrica.
   Nota: Después de cualquier procedimiento con anestesia, coloque los ratones bajo una lámpara de calefacción hasta que han recuperado eficazmente.
2. Resto de los ratones durante 24 h evitar cualquier inflamación debido al proceso de afeitado.
3. 24 h después del procedimiento de afeitado, anestesiar los ratones con una inyección intraperitoneal de ketamina (80-100 mg/kg) y xilacina (10 mg/kg).
4. Comprobar el reflejo de la pata para asegurarse de que los ratones son profundamente anestesiados. Evaluar el reflejo de la pata firmemente pellizcando la pata. Si se logra la anestesia, el animal no siente dolor y no se mueve.
5. Inyectar la hifas de C. albicans en la dermis profunda utilizando una jeringa de insulina de 0,3 mL con aguja 30 x 8 mm en un volumen final de 50 μL, inyección, correspondientes a 5 x 10⁶ hifas/inyección.
   1. Tire de la piel del flanco afeitado tensa con dos dedos para inyectar el volumen directamente en la dermis profunda. Inserte la aguja con un ángulo de 10-15° con el bisel de la aguja hacia arriba.
   2. Con esta perspectiva, se inyectará el patógeno con una profundidad de aproximadamente 300-500 μm. Para asegurar que la inyección se realiza bien, compruebe que el volumen inyectado forma una protuberancia que es absorbido unos minutos después de la inyección.
      Nota: La protuberancia formada después de la inyección de aproximadamente 1 cm². En esta zona que se suprimirá en el momento designado para análisis molecular o histológico.
   3. Para los puntos de tiempo de menos de 24 h (se recomienda) marcar el área de la infección con un rotulador, ya que la protuberancia formada con la inyección persiste durante unos minutos, después de lo cual se absorbe. Para los puntos de tiempo de 24 h o más, este paso no es necesario, porque una úlcera o un quiste será claramente visible.

3. muestra y preparación para la tinción histológica

1. Eutanasia a los ratones según los procedimientos institucionales.
2. Con unas pinzas quirúrgicas, tire de la piel en la frontera del sitio inyectado, previamente marcado con el rotulador. Con unas tijeras quirúrgicas, suprimir el sitio infectado cortando la piel siguiendo la línea marcada.
   Nota: Tenga cuidado de separar la piel del peritoneo con tijeras de punta redonda.
3. Sumerja la piel en un molde de base desechable llenado de temperatura corte óptimo (OCT) compuesto, con la parte interna de la piel hacia arriba. Congelar la muestra en nitrógeno líquido hasta que el compuesto se convierte en blanco. No permita que el nitrógeno líquido cubre la muestra antes de completamente congelado, esto dañaría la muestra.
   Nota: PRECAUCIÓN! En el paso 3.3, use una careta para protección de nitrógeno líquido.
4. Si las muestras no se utilizan inmediatamente para la preparación de los portaobjetos, rápidamente almacénelas a-80 ° C.
   Nota: Las muestras pueden almacenarse a-80 ° C indefinidamente.

4. elaboración de diapositivas

1. Cortar la muestra en la mitad para preparar los cortes para histología desde el centro de la muestra.
2. Corte 5-μm rodajas gruesas con un criostato.
   Nota: Para las muestras de piel, la temperatura de criostato no debe ser superior a-25 ° C. Una temperatura más alta podría causar una fusión parcial de lo H-OCT y por lo tanto, las muestras no se mantendría en la posición correcta durante el procedimiento de corte.
3. Uso cargado positivamente portaobjetos para recoger las rodajas.
4. Si no se utilizan las láminas recogidas poco después de la preparación, almacenarlos a-20 ° C. En este punto, rebanadas pueden almacenarse a-20 ° C indefinidamente.

5. hematoxilina & eosina

1. Mancha las diapositivas por inmersión en hematoxilina de Gill para 4 minutos lavar los portaobjetos en agua corriente durante 5 minutos.
2. Mancha con que las diapositivas por inmersión en solución de eosina Y para 1 minuto lavan los portaobjetos en el chorro del grifo durante 5 minutos enjuague los portaobjetos agua destilada antes de continuar con el protocolo.
3. Deshidratar por inmersión en serie aumentar concentraciones de soluciones de etanol (50%, 70%, 80%, 95%, 100%). Sumerja los portaobjetos por 15 s en cada solución de etanol.
4. Claro las diapositivas por al menos 2 min por inmersión en un agente de claro histológico.
5. Montar las diapositivas utilizando el medio de montaje y cubreobjetos.
6. Adquisición de imágenes de las diapositivas con un escáner de diapositivas de microscopio en un aumento de X 40.

6. ácido-Schiff periódico (PAS) tinción

1. Fije las correderas con ≥99.5% acetona a temperatura ambiente durante 1 minuto lavar los portaobjetos en agua corriente durante 1 minuto.
2. Mancha las diapositivas por inmersión en solución de ácido peryódico (1 g/dL) para 5 minutos Lave los portaobjetos en 3 cambios de agua destilada.
3. Mancha las diapositivas por inmersión en reactivo de Schiff de 15 min lavado de los portaobjetos en agua corriente durante 5 minutos.
4. Las diapositivas de la mancha por inmersión en hematoxilina de Gill para 5 minutos Lave los portaobjetos en agua corriente durante 30 s.
5. Deshidratar el portaobjetos por inmersión en 3 cambios de etanol 100%. Sumerja los portaobjetos durante 15 s cada vez.
6. Claro las diapositivas por al menos 2 min por inmersión en un agente de claro histológico.
7. Montar las diapositivas utilizando el medio de montaje y cubreobjetos.
8. Adquisición de imágenes de las diapositivas con un escáner de diapositivas de microscopio.

7. colección y preparación para la extracción de ARN de la muestra

1. Eutanasia a los ratones según los procedimientos institucionales. Extraer las muestras de piel como en el paso 3.2.
2. Sumergir las muestras en un tubo de snap-cap 2 mL con 1 mL de reactivo para extracción del tiocianato-fenol-cloroformo de guanidinio ácido.
   Nota: El protocolo puede ser una pausa aquí y las muestras pueden conservarse a-80 ° C.
3. Cortar la muestra en trozos de aproximadamente 0,2 cm² con unas pinzas quirúrgicas.
   Nota: PRECAUCIÓN! La mayoría de los reactivos para aislamiento de RNA son tóxicas y mutagénicas. Medidas 7.3 y 7.4 debe realizarse bajo una campana de humos.
4. Romper la muestra con un molino de grano a una velocidad de 20 oscilaciones/s durante 20 min como alternativa, puede usarse un potter mecánico.
5. Compruebe la efectiva homogeneización de las muestras buscando la presencia de piezas intactas de la piel. Repita este paso si las muestras no son completamente homogeneizadas.
6. Centrifugar las muestras a 16.000 x g durante 1 min Mantenga los sobrenadantes para la extracción de RNA y descartar el precipitado. Este paso se realiza para eliminar el pelo y la suciedad que podría bloquear las columnas de extracción.
7. Continuar con la extracción de RNA usando RNA purificación columnas¹⁴.
8. Use un espectrofotómetro para evaluar concentración y purificación de RNA. Si los extractos de RNA no se usan inmediatamente para preparación de ADNc, almacenar las muestras a-80 ° C.

Resultados

A través de la inyección del patógeno directamente en la dermis profunda, la morfología estructural del tejido sigue siendo intacto (figura 1A).

El mantenimiento de la integridad estructural de la piel permite la detección de las células inmunes y su localización en el sitio de la infección. El aumento mayor que se muestra en la figura 1B muestra que el absceso se compo...

Discusión

Aquí describimos un método de infección por C. albicans para estudiar el proceso inflamatorio que se inicia en la entrada de hongos en la dermis profunda.

Aunque la formación de abscesos de la piel es un acontecimiento relativamente raro sobre C. albicans infección¹⁵, inyección del hongo directamente en la dermis profunda permite no sólo el estudio de la formación del absceso basados en hongos, sino también el análisis de inmune específica células que ...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Reactivos
PBS	Euroclone	ECB4053L	cálido en 37 ° C baño antes de usar
histolínea	compuestos H-OCT	R0030
Laboratorios de histolínea	de hematoxilina de Gill	09-178-2
Solución de eosina Y,	laboratorios de histolínea	09-209-05
Absoluto de etanol	scharlau	ET00232500
Laboratorios		de histolínea Citro-HISTOCLEARR0050
Eukitt, medio de montaje	bio-optica Acetona
	sigma-aldrich	179124
sistema de tinción PAS	sigma-aldrich	395B-1KT
Bacto Peptona	BD	211677
Bacto Extracto de levadura	BD	212750
D(+)-Glucosa anhidra para biología molecular	Applichem PanReac	50-99-7
Uridine	Merck Millipore	8451
HEPES	Applichem PanReac	A1070,0500
Safe-Lock tubos 2 mL	eppendorf	30121597
TRIzol Reactivo	Life Technologies	15596018	Tóxicos, corrosivos y mutágenos. Use todas las precauciones necesarias
Rneasy Mini Kit	QIAGEN	74104
nitrógeno			Use protección para los ojos
Instrument
Coulter Counter-Pulter	Beckman Coulter
5415 R	eppendorf
MC 3000 Microtomo Cryostat	histo-line laboratories
TissueLiser	QIAGEN
strong>Materials
0,3 ml Jeringa de insulina con aguja de 30G x 8mm	BD	324826
Pinzas
quirúrgicas Tijeras quirúrgicas
Molde base desechable	histo-line	2781
Portaobjetos de biomicroscopio cargados positivamente	bio-optica	09-2000
Cubreobjetos 24 x 50 mm	termo científico	11911998

Laboratorios de de alcohólica líquido Centrífuga < laboratorios