Name: Profundo dérmico inyección como un modelo de infección de la piel Candida albicans para el análisis histológico (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-13T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 45 s
Description: Aprende a realizar inyección dérmica profunda con Candida albicans para analizar la respuesta inmune en piel. Este método preserva la arquitectura tisular y permite localizar células inmunes durante infecciones fúngicas.

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FG es apoyado por la Associazione Italiana per la Ricerca sul Cancro (IG 2016Id.18842), la Fundación Cariplo (Grant 2014-0655) y Fondazione Regionale per la Ricerca Biomedica (FRRB). IZ es apoyado por NIH grant 1R01AI121066-01A1, 1R01DK115217, HDDC P30 DK034854 grant, Harvard Medical School Milton Found, CCFA Senior Research Awards (412708), Eleanor y Miles Shore 50 aniversario programa de becas y la Fundación Cariplo ( 2014-0859).

Todos los procedimientos fueron aprobados bajo el cuidado institucional del Animal y el Comité uso (IACUC) y operados bajo la supervisión del Departamento de recursos de animales a los niños del Hospital (arco) en el Hospital infantil de Boston o fueron aprobadas por el italiano Ministerio de salud y el Comité institucional cuidado Animal en la Universidad de Milano-Bicocca.
1. preparación de C. albicans
<ol><li>Cultivo de C. albicans, cepa CAF3 113, en tubos que contengan medio Rico (levadura extracto peptona dextrosa (YEPD), extracto de levadura 1% (w/v), 2% (w/v) de Bacto peptona, glucosa de 2% (w/v)) suplementado con uridina (50 mg/L) a 25 ° C. En estas condiciones, C. albicans crece como una levadura. Nota: Otras cepas de C. albicans pueden utilizarse, tales como la clínica aislar C. albicans tensión SC531413. Puesto que hemos demostrado recientemente que el proceso ulceroso es inducido por la activación del sistema inmune innato14, teóricamente cada cepa de C. albicans que mantiene sus componentes de pared celular y estructura, así como capacidad para originar proyecciones hifal, podría ser utilizado.</li>
	<li>Vigilar la cultura contando la concentración celular utilizando un analizador de contador de células.</li>
	<li>La cultura de la cosecha cuando alcanza una concentración de aproximadamente 8 x 106 células/mL. Como alternativa, utilice un espectrofotómetro para medir el OD600. Nota: Generalmente, un valor de OD600 = 1 corresponde a una concentración de la levadura de 3 x 107 células/mL, pero se recomienda la titulación.</li>
	<li>Resuspender el cultivo en medio YEPD-uridina, con HEPES (50 mM, pH 7,5) como agente tampón e incubar el cultivo a 37 ° C para inducir la formación de hifas. Comprobar formación hyphal bajo un microscopio a 100 aumentos. Formación hifal es visible 5 h después de cultivo a 37 ° C; sin embargo, usar las células 16 h después de la incubación a 37 ° C cuando el porcentaje hyphal alcanza casi el 95% de la cultura total.</li>
	<li>Para enriquecer más lejos la preparación en la concentración hifal, alícuotas de la centrifugadora de la cultura a 3.300 x g por 5 min deseche el sobrenadante y resuspender el precipitado en PBS estéril a una concentración de 1 x 108 hifas/mL.</li>
</ol>2. la inyección cutánea profunda
<ol><li>antes de 24 h el procedimiento de infección anestesiar los ratones con una inyección intraperitoneal de ketamina (80-100 mg/kg) y xilacina (10 mg/kg) y luego afeitarse el flanco de los ratones con una maquinilla eléctrica. Nota: Después de cualquier procedimiento con anestesia, coloque los ratones bajo una lámpara de calefacción hasta que han recuperado eficazmente.</li>
	<li>Resto de los ratones durante 24 h evitar cualquier inflamación debido al proceso de afeitado.</li>
	<li>24 h después del procedimiento de afeitado, anestesiar los ratones con una inyección intraperitoneal de ketamina (80-100 mg/kg) y xilacina (10 mg/kg).</li>
	<li>Comprobar el reflejo de la pata para asegurarse de que los ratones son profundamente anestesiados. Evaluar el reflejo de la pata firmemente pellizcando la pata. Si se logra la anestesia, el animal no siente dolor y no se mueve.</li>
	<li>Inyectar la hifas de C. albicans en la dermis profunda utilizando una jeringa de insulina de 0,3 mL con aguja 30 x 8 mm en un volumen final de 50 μL, inyección, correspondientes a 5 x 106 hifas/inyección.<ol>
<li>Tire de la piel del flanco afeitado tensa con dos dedos para inyectar el volumen directamente en la dermis profunda. Inserte la aguja con un ángulo de 10-15° con el bisel de la aguja hacia arriba.</li>
		<li>Con esta perspectiva, se inyectará el patógeno con una profundidad de aproximadamente 300-500 μm. Para asegurar que la inyección se realiza bien, compruebe que el volumen inyectado forma una protuberancia que es absorbido unos minutos después de la inyección. Nota: La protuberancia formada después de la inyección de aproximadamente 1 cm2. En esta zona que se suprimirá en el momento designado para análisis molecular o histológico.</li>
		<li>Para los puntos de tiempo de menos de 24 h (se recomienda) marcar el área de la infección con un rotulador, ya que la protuberancia formada con la inyección persiste durante unos minutos, después de lo cual se absorbe. Para los puntos de tiempo de 24 h o más, este paso no es necesario, porque una úlcera o un quiste será claramente visible.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. muestra y preparación para la tinción histológica
<ol><li>Eutanasia a los ratones según los procedimientos institucionales.</li>
	<li>Con unas pinzas quirúrgicas, tire de la piel en la frontera del sitio inyectado, previamente marcado con el rotulador. Con unas tijeras quirúrgicas, suprimir el sitio infectado cortando la piel siguiendo la línea marcada. Nota: Tenga cuidado de separar la piel del peritoneo con tijeras de punta redonda.</li>
	<li>Sumerja la piel en un molde de base desechable llenado de temperatura corte óptimo (OCT) compuesto, con la parte interna de la piel hacia arriba. Congelar la muestra en nitrógeno líquido hasta que el compuesto se convierte en blanco. No permita que el nitrógeno líquido cubre la muestra antes de completamente congelado, esto dañaría la muestra. Nota: PRECAUCIÓN! En el paso 3.3, use una careta para protección de nitrógeno líquido.</li>
	<li>Si las muestras no se utilizan inmediatamente para la preparación de los portaobjetos, rápidamente almacénelas a-80 ° C. Nota: Las muestras pueden almacenarse a-80 ° C indefinidamente.</li>
</ol>4. elaboración de diapositivas
<ol><li>Cortar la muestra en la mitad para preparar los cortes para histología desde el centro de la muestra.</li>
	<li>Corte 5-μm rodajas gruesas con un criostato. Nota: Para las muestras de piel, la temperatura de criostato no debe ser superior a-25 ° C. Una temperatura más alta podría causar una fusión parcial de lo H-OCT y por lo tanto, las muestras no se mantendría en la posición correcta durante el procedimiento de corte.</li>
	<li>Uso cargado positivamente portaobjetos para recoger las rodajas.</li>
	<li>Si no se utilizan las láminas recogidas poco después de la preparación, almacenarlos a-20 ° C. En este punto, rebanadas pueden almacenarse a-20 ° C indefinidamente.</li>
</ol>5. hematoxilina & eosina
<ol><li>Mancha las diapositivas por inmersión en hematoxilina de Gill para 4 minutos lavar los portaobjetos en agua corriente durante 5 minutos.</li>
	<li>Mancha con que las diapositivas por inmersión en solución de eosina Y para 1 minuto lavan los portaobjetos en el chorro del grifo durante 5 minutos enjuague los portaobjetos agua destilada antes de continuar con el protocolo.</li>
	<li>Deshidratar por inmersión en serie aumentar concentraciones de soluciones de etanol (50%, 70%, 80%, 95%, 100%). Sumerja los portaobjetos por 15 s en cada solución de etanol.</li>
	<li>Claro las diapositivas por al menos 2 min por inmersión en un agente de claro histológico.</li>
	<li>Montar las diapositivas utilizando el medio de montaje y cubreobjetos.</li>
	<li>Adquisición de imágenes de las diapositivas con un escáner de diapositivas de microscopio en un aumento de X 40.</li>
</ol>6. ácido-Schiff periódico (PAS) tinción
<ol><li>Fije las correderas con ≥99.5% acetona a temperatura ambiente durante 1 minuto lavar los portaobjetos en agua corriente durante 1 minuto.</li>
	<li>Mancha las diapositivas por inmersión en solución de ácido peryódico (1 g/dL) para 5 minutos Lave los portaobjetos en 3 cambios de agua destilada.</li>
	<li>Mancha las diapositivas por inmersión en reactivo de Schiff de 15 min lavado de los portaobjetos en agua corriente durante 5 minutos.</li>
	<li>Las diapositivas de la mancha por inmersión en hematoxilina de Gill para 5 minutos Lave los portaobjetos en agua corriente durante 30 s.</li>
	<li>Deshidratar el portaobjetos por inmersión en 3 cambios de etanol 100%. Sumerja los portaobjetos durante 15 s cada vez.</li>
	<li>Claro las diapositivas por al menos 2 min por inmersión en un agente de claro histológico.</li>
	<li>Montar las diapositivas utilizando el medio de montaje y cubreobjetos.</li>
	<li>Adquisición de imágenes de las diapositivas con un escáner de diapositivas de microscopio.</li>
</ol>7. colección y preparación para la extracción de ARN de la muestra
<ol><li>Eutanasia a los ratones según los procedimientos institucionales. Extraer las muestras de piel como en el paso 3.2.</li>
	<li>Sumergir las muestras en un tubo de snap-cap 2 mL con 1 mL de reactivo para extracción del tiocianato-fenol-cloroformo de guanidinio ácido. Nota: El protocolo puede ser una pausa aquí y las muestras pueden conservarse a-80 ° C.</li>
	<li>Cortar la muestra en trozos de aproximadamente 0,2 cm2 con unas pinzas quirúrgicas. Nota: PRECAUCIÓN! La mayoría de los reactivos para aislamiento de RNA son tóxicas y mutagénicas. Medidas 7.3 y 7.4 debe realizarse bajo una campana de humos.</li>
	<li>Romper la muestra con un molino de grano a una velocidad de 20 oscilaciones/s durante 20 min como alternativa, puede usarse un potter mecánico.</li>
	<li>Compruebe la efectiva homogeneización de las muestras buscando la presencia de piezas intactas de la piel. Repita este paso si las muestras no son completamente homogeneizadas.</li>
	<li>Centrifugar las muestras a 16.000 x g durante 1 min Mantenga los sobrenadantes para la extracción de RNA y descartar el precipitado. Este paso se realiza para eliminar el pelo y la suciedad que podría bloquear las columnas de extracción.</li>
	<li>Continuar con la extracción de RNA usando RNA purificación columnas14.</li>
	<li>Use un espectrofotómetro para evaluar concentración y purificación de RNA. Si los extractos de RNA no se usan inmediatamente para preparación de ADNc, almacenar las muestras a-80 ° C.</li>
</ol>

<ol><li>Belkaid, Y., Segre, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dialogue+between+skin+microbiota+and+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Dialogue between skin microbiota and immunity.</a> Science. 346 (6212), 954-959 (2014).</li>
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<li>Havlickova, B., Czaika, V. A., Friedrich, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epidemiological+trends+in+skin+mycoses+worldwide%5BTitle%5D)+AND+%22Mycoses%22%5BJournal%5D)">Epidemiological trends in skin mycoses worldwide.</a> Mycoses. 51, 2-15 (2008).</li>
<li>Wisplinghoff, H., Bischoff, T., Tallent, S. M., Seifert, H., Wenzel, R. P., Edmond, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nosocomial+Bloodstream+Infections+in+US+Hospitals%3A+Analysis+of+24%2C179+Cases+from+a+Prospective+Nationwide+Surveillance+Study%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">Nosocomial Bloodstream Infections in US Hospitals: Analysis of 24,179 Cases from a Prospective Nationwide Surveillance Study.</a> Clin Infect Dis. 39 (3), 309-317 (2004).</li>
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<li>Odds, F. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathogenesis+of+Candida+infections%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Acad+Dermatol%22%5BJournal%5D)">Pathogenesis of Candida infections.</a> J Am Acad Dermatol. 31 (3), S2-S5 (1994).</li>
<li>MacCallum, D. M., Odds, F. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temporal+events+in+the+intravenous+challenge+model+for+experimental+Candida+albicans+infections+in+female+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Mycoses%22%5BJournal%5D)">Temporal events in the intravenous challenge model for experimental Candida albicans infections in female mice.</a> Mycoses. 48 (3), 151-161 (2005).</li>
<li>Dai, T., Kharkwal, G. B., Tanaka, M., Huang, Y. -Y., Bil de Arce, V. J., Hamblin, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+models+of+external+traumatic+wound+infections%5BTitle%5D)+AND+%22Virulence%22%5BJournal%5D)">Animal models of external traumatic wound infections.</a> Virulence. 2 (4), 296-315 (2018).</li>
<li>Gaspari, A. A., Burns, R., Nasir, A., Ramirez, D., Barth, R. K., Haidaris, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD86+%28B7-2%29%2C+but+not+CD80+%28B7-1%29%2C+expression+in+the+epidermis+of+transgenic+mice+enhances+the+immunogenicity+of+primary+cutaneous+Candida+albicans+infections%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">CD86 (B7-2), but not CD80 (B7-1), expression in the epidermis of transgenic mice enhances the immunogenicity of primary cutaneous Candida albicans infections.</a> Infect Immun. 66 (9), 4440-4449 (1998).</li>
<li>Koh, A. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Murine+models+of+Candida+gastrointestinal+colonization+and+dissemination%5BTitle%5D)+AND+%22Eukaryot+Cell%22%5BJournal%5D)">Murine models of Candida gastrointestinal colonization and dissemination.</a> Eukaryot Cell. 12 (11), 1416-1422 (2013).</li>
<li>Mear, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Candida+albicans+Airway+Exposure+Primes+the+Lung+Innate+Immune+Response+against+Pseudomonas+aeruginosa+Infection+through+Innate+Lymphoid+Cell+Recruitment+and+Interleukin-22-Associated+Mucosal+Response%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">Candida albicans Airway Exposure Primes the Lung Innate Immune Response against Pseudomonas aeruginosa Infection through Innate Lymphoid Cell Recruitment and Interleukin-22-Associated Mucosal Response.</a> Infect Immun. 82 (1), 306-315 (2014).</li>
<li>Leoni, G., Neumann, P. -A., Sumagin, R., Denning, T. L., Nusrat, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wound+repair%3A+role+of+immune-epithelial+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Mucosal+Immunol%22%5BJournal%5D)">Wound repair: role of immune-epithelial interactions.</a> Mucosal Immunol. 8 (5), 959-968 (2015).</li>
<li>Fonzi, W. A., Irwin, M. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isogenic+strain+construction+and+gene+mapping+in+Candida+albicans%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Isogenic strain construction and gene mapping in Candida albicans.</a> Genetics. 134 (3), 717-728 (1993).</li>
<li>Santus, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skin+infections+are+eliminated+by+cooperation+of+the+fibrinolytic+and+innate+immune+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Immunol%22%5BJournal%5D)">Skin infections are eliminated by cooperation of the fibrinolytic and innate immune systems.</a> Sci Immunol. 2 (15), (2017).</li>
<li>Florescu, D. F., Brostrom, S. E., Dumitru, I., Kalil, A. C. <a target="_blank" href="https://journals.lww.com/infectdis/Abstract/2010/07000/Candida_albicans_Skin_Abscess_in_a_Heart.6.aspx">Candida albicans Skin Abscess in a Heart Transplant Recipient.</a> Infect Dis Clin Pract. 18 (4), 243-246 (2010).</li>
<li>Pradeu, T., Cooper, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+danger+theory%3A+20+years+later%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">The danger theory: 20 years later.</a> Front Immunol. 3, 287(2012).</li>
<li>Cheng, A. G., DeDent, A. C., Schneewind, O., Missiakas, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+play+in+four+acts%3A+Staphylococcus+aureus+abscess+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Microbiol%22%5BJournal%5D)">A play in four acts: Staphylococcus aureus abscess formation.</a> Trends Microbiol. 19 (5), 225-232 (2011).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Aquí describimos un método de infección por C. albicans para estudiar el proceso inflamatorio que se inicia en la entrada de hongos en la dermis profunda.
Aunque la formación de abscesos de la piel es un acontecimiento relativamente raro sobre C. albicans infección15, inyección del hongo directamente en la dermis profunda permite no sólo el estudio de la formación del absceso basados en hongos, sino también el análisis de inmune específica células que ...

El cuerpo humano se cubre con un número extremadamente alto de microorganismos. La superficie de la piel es el hábitat de casi 1 millón de bacterias por centímetro cuadrado1. Este número, sin embargo, no refleja la completa variedad de microorganismos que coloniza la piel. Además de las bacterias, el cuerpo humano es colonizado por muchas especies de hongos, incluyendo C. albicans, que es capaz de sobrevivir tanto en la mucosa y la piel nivel2.
En los últimos años, el porcentaje de personas diagnosticadas con infecciones micóticas ha aumentado enormemente. Esto es principalmente debido al mayor número de personas inmunocomprometidas, es decir, pacientes seropositivos y pacientes que han pasado por quimioterapia o fármacos inmunosupresores después del trasplante3. En un estudio de vigilancia realizado en los Estados Unidos, Wisplinghoff et al demostró que 9,5% de las infecciones de torrente sanguíneo nosocomial fueron causadas por Candida especies4. Debido a la mayor ocurrencia de infecciones por hongos y sobre todo por el elevado porcentaje de especies de Candida durante las infecciones del torrente sanguíneo , entender cómo este patógeno escapa del control del sistema inmunitario es extremadamente importante.
C. albicans es un hongo dimorfo que crece en diferentes formas morfológicas tales como levadura, pseudomicelio, pseudohyphae e hifas dependiendo de las condiciones ambientales5. En su forma hifal, C. albicans muestra su mayor capacidad de invasión y tiene la capacidad de penetrar el epitelio6.
Infecciones por C. albicans se han estudiado utilizando varias aproximaciones experimentales. El modelo más común de infección es la inyección intravenosa de C. albicans levadura7. Sin embargo, este modelo no toma en cuenta todos los procesos que suceden antes de que el hongo se las arregla para difundir al torrente sanguíneo. Otro modelo aprovecha la habilidad de C. albicans para invadir el epitelio. Este método, también conocido como el papel de la arena modelo8, fue desarrollado por Gaspari et en 19989y consiste en utilizar papel de lija para desgastar la piel, eliminando la capa córnea antes de aplicar la C. albicans. Este procedimiento permite que el hongo al penetrar en el epitelio, lo que permite el análisis de la capacidad invasiva de este patógeno. Por último, otros modelos de infecciones gastrointestinales10 y vías respiratorias11 se han utilizado en diferentes estudios.
La formación de una herida (como en el modelo de papel de lija) provoca la activación de varias vías, incluyendo el reclutamiento de células inmunes y activación, con el fin de promover la curación del proceso12. Esto puede alterar o enmascarar la respuesta inmune provocada específicamente contra el patógeno, lo que conduce a la confusión de resultados.
Aquí describimos un método de infección de la piel que evita la formación de la herida inicial y la inducción de un entorno inflamatorio basal. Para mantener la estructura epitelial intacta, inyectamos directamente C. albicans en su forma hifal en la dermis profunda. A pesar de que una sola inyección puede provocar inflamación leve, la cantidad de inflamación está limitada y restringida en comparación con la formación de una herida abierta como en el modelo de papel de lija. El método que se describe aquí permite el estudio de la respuesta inmunológica a la infección por hongos y la propagación evitando el ambiente inflamatorio excesivo y preexistente causado por daños mecánicos.

<table><tbody><tr><td><fuerte>Reactivos</fuerte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Euroclone</td><td>ECB4053L</td><td>cálido en 37 &deg; C baño antes de usar</td></tr><tr>Laboratorios de <td>histolínea</td> de<td>compuestos H-OCT</td><td>R0030</td><td></td></tr><tr><td>Laboratorios de histolínea</td><td>de hematoxilina de Gill</td><td>09-178-2</td><td></td></tr><tr><td>Solución de eosina Y,</td><td>laboratorios de histolínea</td> alcohólica <td>09-209-05</td><td></td></tr><tr><td>Absoluto de etanol</td><td>scharlau</td><td>ET00232500</td><td></td></tr><tr><td>Laboratorios</td><td></td> <td>de histolínea Citro-HISTOCLEARR0050</td><td></td></tr><tr><td>Eukitt, medio de montaje</td><td>bio-optica Acetona</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>sigma-aldrich</td><td>179124</td><td></td></tr><tr><td>sistema de tinción PAS</td><td>sigma-aldrich</td><td>395B-1KT</td><td></td></tr><tr><td>Bacto Peptona</td><td>BD</td><td>211677</td><td></td></tr><tr><td>Bacto Extracto de levadura</td><td>BD</td><td>212750</td><td></td></tr><tr><td>D(+)-Glucosa anhidra para biología molecular</td><td>Applichem PanReac</td><td>50-99-7</td><td></td></tr><tr><td>Uridine</td><td>Merck Millipore</td><td>8451</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Applichem PanReac</td><td>A1070,0500</td><td></td></tr><tr><td>Safe-Lock tubos 2 mL</td><td>eppendorf</td><td>30121597</td><td></td></tr><tr><td>TRIzol Reactivo</td><td>Life Technologies</td><td>15596018</td><td>Tóxicos, corrosivos y mutágenos. Use todas las precauciones necesarias</td></tr><tr><td>Rneasy Mini Kit</td><td>QIAGEN</td><td>74104</td><td></td></tr><tr><td>nitrógeno</td><td></td><td></td> líquido <td>Use protección para los ojos</td></tr><tr><td>Instrument</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Coulter Counter-Pulter</td> Centrífuga <td>Beckman Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>5415 R</td><td>eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MC 3000 Microtomo Cryostat</td><td>histo-line laboratories</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TissueLiser</td><td>QIAGEN</td><td></td><td></td></tr><<tr><td>strong>Materials</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0,3 ml Jeringa de insulina con aguja de 30G x 8mm&nbsp;</td><td>BD</td><td>324826</td><td></td></tr><tr><td>Pinzas</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>quirúrgicas Tijeras quirúrgicas</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Molde base desechable</td> laboratorios <td>histo-line</td><td>2781</td><td></td></tr><tr><td>Portaobjetos de biomicroscopio cargados positivamente</td><td>bio-optica</td><td>09-2000</td><td></td></tr><tr><td>Cubreobjetos 24 x 50 mm</td><td>termo científico</td><td>11911998</td><td></td></tr></tbody></table>

profundo dérmico inyección como un modelo de infección de la piel candida albicans para el análisis histológico

Deep Dermal Injection As a Model of Candida albicans Skin Infection for Histological Analyses

La piel es un órgano extremadamente extendido del cuerpo y, debido a esta gran superficie, está continuamente expuesto a microorganismos. Daño de la piel puede fácilmente conducir a infecciones en la dermis que, a su vez, resulta en la diseminación de patógenos en el torrente sanguíneo. Entender cómo el sistema inmunológico combate infecciones en la etapa muy temprana y cómo el host puede eliminar los patógenos es un paso importante para establecer la base para futuras intervenciones terapéuticas. Aquí describimos un modelo de infección por Candida albicans que puede visualizar los procesos que ocurren durante una infección, incluso cuando el patógeno ha superado la barrera epitelial, así como la respuesta inmune provocada por el C. albicans invasión. Se utilizó este modelo de infección realizar análisis histológicos que muestran las células inmunes que infiltran la piel, así como la presencia y localización del patógeno. Las muestras recogieron después de la infección puede ser procesada para la extracción de RNA.

A través de la inyección del patógeno directamente en la dermis profunda, la morfología estructural del tejido sigue siendo intacto (figura 1A).
El mantenimiento de la integridad estructural de la piel permite la detección de las células inmunes y su localización en el sitio de la infección. El aumento mayor que se muestra en la figura 1B muestra que el absceso se compo...

Aquí se describe un protocolo que permite el análisis histológico y molecular de muestras de piel después de la inyección intradérmica de Candida albicans . Este protocolo mantiene la integridad estructural de la piel y permite la localización de las células inmunes residentes de tejido o recién contratadas así como la distribución de patógenos.

Profundo dérmico inyección como un modelo de infección de la piel Candida albicans para el análisis histológico

The skin is an extremely extended organ of the body and, due to this large surface, it is continuously exposed to microorganisms. Skin damage can easily ...

El objetivo general de este procedimiento es observar la activación del sistema inmunitario durante las infecciones de la piel mediante la inyección de Candida albicans para preservar la arquitectura de la piel y la localización de células inmunitarias y no inmunitarias específicas. Este método puede ayudar a responder a preguntas clave en el campo inmunológico como la naturaleza y la localización de las células inmunitarias reclutadas durante las infecciones cutáneas y los principales mediadores implicados. La principal ventaja de esta técnica es el mantenimiento de la arquitectura estructural de la piel tras la inyección de hongos que permite entender la localización de cada tipo de célula inmunitaria.Giulia Stamerra, estudiante de doctorado del laboratorio de la profesora Marina Vai, demostrará parte del procedimiento. Para comenzar, inocular la cepa CAF3-1 de C.Albicans en tubos que contengan medio rico suplementado con 50 miligramos por litro de uridina y cultivo a 25 grados centígrados. Bajo estas condiciones, C.albicans crece como levadura.Monitoree el cultivo mediante el uso de un analizador de contador de células o un espectrofotómetro para medir la concentración celular. Cuando el cultivo alcance ocho veces 10 a la sexta célula por mililitro, recoja la muestra. Utilice el medio YEPD-uridina con Hepes como agente amortiguador para volver a suspender las células e incubarlas a 37 grados centígrados para inducir la formación de hifas.Después de cinco horas en cultivo, cuando las hifas deberían ser visibles, bajo un microscopio con un aumento de 100X, verifique la formación de hifas. Cultive las células durante un total de 16 horas, momento en el que el 95% del cultivo habrá formado hifas. Para enriquecer aún más la concentración de hifas, centrifugar las alícuotas del cultivo a 3.300 veces g durante cinco minutos.Deseche el sobrenadante y utilice PBS estéril para volver a suspender el pellet a una concentración de una vez 10 a la octava hifas por mililitro. Después de anestesiar a un ratón afeitado de acuerdo con el protocolo de texto, verifique el reflejo de la pata para asegurarse de que el animal esté profundamente sedado. Para inyectar hifas de C. albicans en la dermis profunda, use dos dedos para tensar la piel del flanco afeitado, luego inserte una aguja de ocho milímetros de calibre 30 unida a una jeringa de insulina de 0,3 mililitros en un ángulo de 10 a 15 grados, con el bisel de la aguja hacia arriba, e inyecte un volumen final de 50 microlitros correspondiente a cinco por 10 a la sexta hifa.Si el ángulo de la inyección es superior a 15 grados, el patógeno se inyectará demasiado profundamente en la dermis, con el riesgo de dañar el peritoneo y, sobre todo, perder la posibilidad de estudiar las infecciones específicamente a nivel de la piel. En este ángulo, el patógeno se inyectará a una profundidad de aproximadamente 300 a 500 micras. Para asegurarse de que la inyección se realiza correctamente, verifique que el volumen inyectado forme una protuberancia que se absorba después de unos minutos.Para puntos de tiempo de menos de 24 horas, use un rotulador para marcar el área de infección, ya que el bulto formado con la inyección persiste durante unos minutos. Para puntos de tiempo de 24 horas o más, este paso no es necesario, ya que una úlcera o un quiste serán claramente visibles. Después de la eutanasia de los ratones siguiendo las pautas institucionales, con pinzas quirúrgicas se tira de la piel en el borde del sitio inyectado previamente marcado con el rotulador, luego, con tijeras quirúrgicas, se extirpa el sitio infectado cortando la piel siguiendo la línea marcada.Sumerja la piel con el lado interno hacia arriba en un molde de base desechable lleno de compuesto O.C.T. Congele la muestra en nitrógeno líquido hasta que el compuesto se vuelva blanco. No permita que el nitrógeno líquido cubra la muestra antes de que se congele por completo, ya que esto dañará la muestra.Para preparar los portaobjetos, comenzando desde el centro de la muestra, corte la muestra por la mitad para preparar las rodajas para la histología, luego, con un criostato, corte rodajas de cinco micras de grosor. Use portaobjetos de microscopio cargados positivamente para recoger las rebanadas. Para llevar a cabo la tinción de H&E, sumerja los portaobjetos en hematoxilina de Gill durante cuatro minutos, luego lave los portaobjetos con agua corriente del grifo durante cinco minutos.Sumerja los portaobjetos en una solución de eosina-Y durante un minuto, lave los portaobjetos con agua corriente del grifo durante cinco minutos y luego use agua destilada para enjuagar los portaobjetos. A continuación, deshidrate las muestras sumergiéndolas en una serie de etanol durante 15 segundos cada una. Para limpiar los portaobjetos, transfiéralos a un agente de aclarado histológico durante al menos dos minutos, luego use medio de montaje y cubreobjetos para montar las muestras.Utilice un escáner de portaobjetos con microscopio con un aumento de 40X para obtener imágenes de los portaobjetos. Realice la tinción con solución ácida menstrual o PAS usando acetona a temperatura ambiente para fijar los portaobjetos durante un minuto, luego use agua corriente del grifo para lavar los portaobjetos durante un minuto. Sumerja los portaobjetos en PAS durante cinco minutos, luego use tres cambios de agua destilada para lavar las muestras.A continuación, sumerja los portaobjetos en el reactivo de Schiff durante 15 minutos, luego use agua corriente del grifo para lavar los portaobjetos durante cinco minutos. Sumerja la muestra en hematoxilina de Gill durante cinco minutos para teñirlas, luego lave los portaobjetos con agua corriente del grifo durante 30 segundos. Deshidratar las muestras por inmersión en tres cambios de etanol al 100% durante 15 segundos cada uno, luego sumergir los portaobjetos en un agente de limpieza histológico.Con el medio de montaje y los cubreobjetos, monte las muestras aclaradas y, a continuación, utilice un escáner de portaobjetos de microscopio para obtener imágenes de las muestras. Después de sacrificar a los ratones y extraer muestras de piel como se demostró anteriormente en este video, sumerja las muestras en un tubo de tapa a presión de dos mililitros con un mililitro de reactivo para la extracción de cloroformo de fenol de tiocianato de guanidinio ácido. Use pinzas quirúrgicas para cortar el tejido en pedazos de 0,2 centímetros cuadrados.Con un molino de cuentas, triture las muestras a 20 oscilaciones por segundo durante 20 minutos. Si todavía quedan trozos de piel intactos, repita el aplastado hasta que la muestra esté completamente homogeneizada. Centrifugar las muestras a 16.000 veces g durante un minuto.Guarde los sobrenadantes para la extracción de ARN y deseche el pellet. Este paso se realiza para eliminar el pelo y los residuos que podrían interferir con el proceso de extracción. Después de extraer el ARN con una columna de purificación, use un espectrofotómetro para medir la concentración y la pureza del ARN.El mantenimiento de la integridad estructural de la piel permite la detección de células inmunitarias y su localización en el lugar de la infección. Este gran aumento revela que el absceso está compuesto principalmente por PMC que contienen la propagación del patógeno por su confinamiento al sitio de la infección. Las áreas circundantes del absceso también se enriquecen en PMC.En esta figura, la tinción de PAS, que le da al hongo un color púrpura-magenta, muestra claramente que el patógeno está confinado dentro del absceso formado por el reclutamiento de granulocitos. C. albicans es claramente visible a mayor aumento y parece estar rodeado de células necróticas e inmunitarias. Al comienzo del proceso de infección, el reclutamiento de células inmunitarias conduce a la formación del absceso.De 48 a 72 horas después de la infección, se visualizó la ruptura de las estructuras de la piel y la formación de una cicatriz debido a la fase de curación tras la expulsión del patógeno. Como se muestra aquí, los ratones de tipo salvaje muestran un proceso ulcerativo que aumenta con el tiempo. Con tratamientos específicos o deficiencias genéticas, la formación de la úlcera puede reducirse y/o eliminarse.En algunos casos, en lugar de una úlcera, se formará un quiste como se ve aquí. Después de este procedimiento de infección, se pueden realizar otros métodos, como las extracciones de proteínas, para responder a preguntas adicionales, como la activación de vías intracelulares específicas. Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo realizar la inyección de C. Albicans en la piel para estudiar la participación del sistema inmunológico durante la infección microbiana sin alterar la arquitectura del epitelio.No olvide que trabajar con reactivos para extracciones de ARN puede ser extremadamente peligroso y siempre se deben tomar precauciones como el uso de una campana extractora mientras se realiza este procedimiento.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Immunology and Infection

Inmunología e Infección

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