Electroquímico detección de deuterio cinético isótopo efecto en extracelular transporte de electrones en la Shewanella oneidensis MR-1

Resumen

Aquí presentamos un protocolo de los experimentos electroquímicos celulares para estudiar la contribución del transporte de protones a la velocidad de transporte de electrones extracelular a través de los citocromos de la membrana externa de Shewanella oneidensis MR-1.

Resumen

Directa detección electroquímica de c-tipo complejos citocromo incrustados en la membrana externa bacteriana (membrana externa c-tipo complejos citocromo; OM c- Cyts) recientemente ha surgido como un método de análisis de celulares nuevos para caracterizar el transporte de electrones bacteriano de la cadena respiratoria al exterior de la célula, conocido como el transporte de electrones extracelular (EET). Mientras que la vía y cinética del flujo del electrón durante la reacción de EET se han investigado, un método electroquímico de la célula entera para examinar el impacto del transporte de cationes asociado con EET todavía no se ha establecido. En el presente estudio, se describe un ejemplo de una técnica bioquímica para examinar el efecto de cinética isótopos de deuterio (KIE) sobre EET mediante OM c- Cyts usando un microbio modelo, Shewanella oneidensis MR-1. El KIE en el proceso EET puede obtenerse si la OTA a través de OM c- Cyts actúa como el paso tarifa-limitador en la actual producción microbiana. Para ello, antes de la adición de D₂O, la solución sobrenadante fue reemplazada con medio fresco que contiene una cantidad suficiente de la donante del electrón para apoyar la tasa de reacciones metabólicas por aguas arriba y para eliminar las células planctónicas de un uniforme monocapa biofilm en el electrodo de trabajo. Métodos alternativos para confirmar la limitación de velocidad se paso en actual producción microbiana como EET mediante OM c- Cyts también se describen. Nuestra técnica de un análisis electroquímico de células completas para investigar la cinética del transporte de protones se puede aplicar a otras cepas microbianas electroactivos.

Introducción

Recientemente han surgido técnicas electroquímicas para caracterizar directamente una proteína redox en una célula bacteriana intacta desde el descubrimiento del metal reduciendo las cepas microbianas, como Geobacter sulfurreducens PCA, S. oneidensis MR-1 que tienen complejos de citocromo tipo c de membrana externa (OM c-Cyts) expuestos a la célula exterior^1,2,3,4,5. El OM c- Cyts mediar transporte de electrones de la cadena respiratoria a sustratos sólidos situados extracelularme....

Protocolo

1. formación de una monocapa de Biofilm de S. oneidensis MR-1 en un electrodo ITO (figura 1)

Nota: Para evitar la contaminación del reactor electroquímico con otros microbios, todos los medios, instrumentos y componentes del reactor electroquímico deben esterilizarse previamente. Cuando utilizando células de S. oneidensis MR-1 y la construcción de los reactores electroquímicos, todos los procedimientos deben realizarse en una mesa de trabajo limpia.

1. Cultivo de células de S. oneidensis MR-1
   Nota: Un monocapa biofilm de S. oneidensis MR-1 se constituyó en un ITO el....

Resultados

Después de 25 h de potencial aplicación en +0.4 V (contra ella), se formó una biopelícula de monocapa en el electrodo de trabajo de vidrio de ITO, que previamente fue confirmado por una microscopía electrónica o la microscopia confocal⁴. El curso del tiempo representativo de la producción actual de la S. oneidensis MR-1 durante la formación de una biopelícula de monocapa se muestra en la figura 2. Aunque la corriente altera en.......

Discusión

Nuestro análisis electroquímico de células completas tiene varias ventajas técnicas en comparación con electroquímica de proteína. Mientras que la purificación de proteínas requiere varios pasos lentos procedimientos, nuestro método de celulares toma un día de formación del biofilm auto-organizada después de cultivo celular. Para lograr una interacción estable entre OM c- Cyts y el electrodo, necesitamos sólo la esterilización y limpieza de la superficie del electrodo; no requiere modificación de electrodo para .......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Cilindro de vidrio	N/A	N/A	Hecho a medida, utilizado como reactor electroquímico
Cubierta y base de PTFE	N/A	N/A	Hecho a medida, utilizado como cubierta y base del reactor electroquímico
Caucho butílico	N/A	N/A Hecho a	medida, insertado entre cada componente del reactor electroquímico
Septa	GL Science	3007-16101	Utilizado como puerto de inyección del reactor electroquímico
Electrodo de óxido dopado con indio y estaño (ITO)	GEOMATEC	No.0001	Utilizado como electrodo de trabajo, 5Ω/sq
Ag/AgCl Electrodo saturado de KCAl	HOKUTO DENKO	HX-R5	Utilizado como electrodo de referencia, Φ Alambre de platino de 0,30 mm
	La Corporación Nilaco	PT-351325	Utilizado como contraelectrodo
Caldo Luria-Bertani (LB), Miller	Becton, Dichkinson and Company	244620	Medio para el precultivo de S. oneidensis MR-1
Bacto agar	Becton, Dichkinson and Company	214010
Antraquinona-1-sulfonato (α-AQS)	TCI	A1428
Mononucleótido de flavina (FMN)	Wako	184-00831
NaHCO3	Wako	191-01305	Utilizado para medio definido (DM)
CaCl2 · 2H2O	Wako	031-00435	Utilizado para DM
NH4Cl	Wako	011-03015	Utilizado para DM
MgCl2 · 6H2O	Wako	135-00165	Utilizado para DM
NaCl	Wako	191-01665	Utilizado para DM
2-[4-(2-hidroxietil)-1-piperazinil] ácido etanosulfónico (HEPES)	DOJINDO	346-08235	Utilizado para DM
Solución de lactato de sodio	Wako	195-02305
Extracto de levadura Bacto	Becton, Dichkinson and Company	212750
Óxido de deuterio (D, 99,9%)	Cambridge Isotope Laboratories, Inc.	DLM-4-PK	Aditivo para experimentos de efecto cinético de isótopos
Incubadora	TOKYO RIKAKIKAI CO., LTD.	LTI-601SD	Utilizado para precultivo
Agitador	TAITEC	NR-3	Utilizado para precultivo
Máquina de autoclave	TOMY SEIKO CO. LTD.	LSX-500	Se utiliza para la esterilización del reactor electroquímico y el medio
Banco limpio	SANYO	MCV-91BNF	Se utiliza para prevenir la contaminación del reactor electroquímico y el medio con otros microbios
Separador de centrífuga	Eppendorf	5430R	Velocidad de rotación de hasta 6000 veces; g se requiere
generador de gas nitrógeno	Puequ CO. LTD.	PNTN-2	El cilindro de gas nitrógeno también se puede utilizar en lugar del generador de gas
espectrómetro UV-vis	SHIMADZU	UV-1800	Se utiliza para la optimización de la densidad celular
Potenciostat	BioLogic	VMP3	Se utiliza para la formación de biopelículas y experimentos de efecto cinético de isótopos
Circulador de agua térmica	AS ONE	TR-1A	Se utiliza para el mantenimiento de la temperatura del reactor electroquímico
Jaula de Faraday	HOKUTO DENKO	HS-201S	Utilizada para experimentos electroquímicos