Análisis de Micro-CT cuantitativa de Aortopathy en un modelo murino de disección y aneurisma de la aorta inducida por β-oxidasa

Summary

Este artículo describe una metodología detallada del uso de un caucho de silicón radiopaco con base de plomo para inundar la vasculatura murina para la cuantificación del diámetro aórtico en un modelo murino de aneurisma aórtico y disección.

Abstract

Disección y aneurisma de aorta se asocia con una morbilidad significativa y mortalidad en la población y puede ser altamente letales. Si bien existen modelos animales de enfermedad aórtica, en vivo las imágenes de la vasculatura ha sido limitada. En los últimos años, micro-automatizado tomografía (micro-CT) se ha convertido en una modalidad preferida para grandes y pequeños vasos de la proyección de imagen en vivo y ex vivo. Junto con un método de riego vascular, hemos utilizado con éxito micro-CT para caracterizar la frecuencia y la distribución de la patología aórtica en ratones C57/Bl6 tratados con β-oxidasa. Limitaciones técnicas de este método incluyen variaciones en la calidad de la perfusión por mala preparación de animales, la aplicación de metodologías adecuadas para la cuantificación del tamaño de buque y la no supervivencia de este procedimiento. Este artículo detalla una metodología para la perfusión intravascular de un caucho de silicón radiopaco con base de plomo para la caracterización cuantitativa de aortopathy en un modelo murino de aneurisma y disección. Además de visualizar patología aórtica, este método puede utilizarse para examinar otras camas vasculares en vivo o vascular camas quitar post mortem.

Introduction

La incidencia de la disección aórtica es de 3 casos por 100.000 por año¹. Disección aórtica y aneurisma enfermedades representan más de 10.000 muertes en los Estados Unidos cada año, 1-2% de todas las muertes en los países occidentales². La disección aórtica se inicia por un desgarro en la capa íntima del vaso con la propagación de la sangre a través de las capas de la pared aórtica en presiones fisiológicas. Presión de pulso elevada de pacientes está asociados con una mayor incidencia de disección y complicaciones. Esfuerzo cortante de pared creciente se asocia con la expansión de la pared aórtica a un aneurysm formación^3,4. Las consecuencias de la disección aórtica incluyen la obstrucción del flujo de sangre a órganos distantes como el cerebro, riñones, intestinos y extremidades, la formación de aneurismas crónica, ruptura o muerte^5,6,7.

En la actualidad, los procesos bioquímicos y celulares implicados en la iniciación y progresión de los aneurismas aórticos y disecciones son todavía poco conocidos. Modelos animales reproducibles de aneurisma aórtico y disección son clave para comprender su fisiopatología. Β-oxidasa (BAPN) es un inhibidor de oxidasa lisil, que evita que el cross-linking de colágeno y elastina y se ha demostrado para alterar significativamente la estructura de la matriz extracelular de la pared de recipiente y su integridad biomecánica^{6, 8}. Roedores tratados con BAPN se han utilizado como modelo animal común de aneurisma aórtico y disección^9,10.

Modalidades de imágenes vasculares son instrumentales en la identificación de patología vascular, confirmar la permeabilidad del vaso y evaluar la perfusión de órganos. Recientemente, la tomografía micro computada (micro-CT) se ha utilizado para el estudio de la vasculatura de ratones y animales de tamaño. A diferencia del hueso, la proyección de imagen axial de los vasos sanguíneos por la tomografía computada es limitada, ya que sangre intraluminal es inherentemente relativamente radiolúcido. Cuando se combina con agentes de contraste intravascular, sin embargo, micro-CT permite reconstrucciones tridimensionales detalladas de vasculatures animal para el estudio de patología vascular anatómica macro¹¹.

El agente de contraste seleccionados (véase la Tabla de materiales) es un caucho de silicón radiopaco que contiene cromato de plomo y sulfato de plomo. En perfusión en presencia de un catalizador, rápidamente se endurece para formar un elenco de la vasculatura con mínimas alteraciones en la arquitectura macro anatómicas de los vasos, hacer la vasculatura altamente radiopaco en contraste con los tejidos de fondo cuando examen radiográfico. Este agente del contraste es ventajoso porque es fácil de manejar y evita la degradación del tejido y pérdida de la nave debido a la fractura a menudo asociado con la corrosión del molde vascular. Como cura con la contracción mínima¹², vasos despejados sangre quedan patentes y permiten una evaluación precisa de la macro-vasculatura animal en experimentos de supervivencia no. Trabajo previo ha utilizado goma de silicón radiopaco-contraste en una variedad de estudios en animales. Específicamente, se ha demostrado la aplicabilidad en visualizar las coronarias, glomerular, placenta y las circulaciones cerebral^{11,12,13,14,15} . En este artículo, detallaremos la metodología de punción ventricular izquierda abierta para la perfusión intravascular del caucho de silicón radiopaco con base de plomo para caracterizar cuantitativamente patología aórtica BAPN-inducida en un modelo de ratón por el micro-CT.

Protocol

Los protocolos para el manejo de animales fueron aprobados por el cuidado institucional de Animal y uso de la Universidad de Maryland, Baltimore (número de protocolo animal 0116024) y realizados según los estándares de AAALAC International.

1. preparación de reactivos

1. Heparina
   1. Diluya 250 μl de 1000 sulfato de heparina U/mL en 50 mL de fosfato tampón salino para una concentración final de 5 U/mL.
   2. Caliente la heparinizada (5 U/mL) fosfato tampón salino, que sustituirá a la sangre en la vasculatura en un baño de agua a 37 ° C.
   3. Preparar la bomba mediante la conexión de la tubería necesaria y vacío de 2 jeringas de 10 mL, 1 para el buffer salina heparinizada y 1 para el agente de contraste.
   4. Llenar el tubo con el cálido heparinizada tamponada de fosfato salino y eliminar las burbujas de aire en el tubo de la bomba de presión.
2. Agente de contraste
   Nota: Consulte la Tabla de materiales para los componentes de kit de agente de contraste.
   1. Mezclar un compuesto pigmentado con un diluyente para conseguir un tinte 1:6 al cociente de diluyente.
   2. Inmediatamente antes de su uso (paso 2.3.12), añadir 200 μL de un agente endurecedor para cada alícuota de 5 mL del compuesto pigmentado diluido y mezclar bien (4% en volumen).
      Nota: El fabricante informó que el tiempo de trabajo es de 40 minutos. El agente de contraste de caucho de silicona comienza a polimerizar 20 minutos después de la adición del agente de curado, es importante preparar la solución inmediatamente antes de su infusión.
3. Agua potable BAPN
   1. Β-oxidasa (BAPN) se disuelven en el agua potable para crear una concentración final de 3 g/L (adaptado de protocolos previamente descritos en la literatura)^9,16,17.
   2. Administrar el agua potable que contiene BAPN a un grupo de ratones, una vez que son 4 semanas de edad hasta el momento de la perfusión para micro-CT.

2. quirúrgico

1. Preparación de animales
   1. Destetar a los ratones a las 3 semanas de edad, mantener un ciclo oscuro h 12 h luz/12 y alimentarlos chow roedor estándar. Para el grupo tratado con BAPN, administrar el agua potable BAPN recién preparado para 16-26 semanas ad libitum. Proporcionan que los animales de control con consumo estándar de agua ad libitum.
2. Técnica anestésica
   Nota: se realiza 24 horas antes el análisis de CT, el siguiente procedimiento. Procedimientos quirúrgicos son promulgados para preparar a la muestra para una perfusión intracardiaca post mortem.
   1. Inducir una anestesia a través de un tanque de inducción con 100% O₂ y 3% isoflurano suministra a través de un vaporizador de precisión. Después de la inducción de la anestesia, deje el isoflurano y limpie la cámara con O₂. Mantener la anestesia con isoflurano % 2-2.5 y 1 L/min de O₂ a través de un cono de nariz.
   2. Conecte la cámara de inducción y la máscara a un tesoro carbón para adsorción de gases residuales para proteger al personal. Para asegurar un adecuado plano anestésico, demostrando que no hay ninguna respuesta a los estímulos nocivos (pellizco del dedo del pie).
   3. Preparar un campo operatorio que consiste en una bandeja quirúrgica y el instrumental quirúrgico necesario.
   4. Transferir el animal al campo quirúrgico y posición de recumbency dorsal.
3. Técnica operativa
   1. Con unas tijeras, hacer una incisión de línea media a través de la piel y tejidos blandos de a medio camino entre la sínfisis púbica a la escotadura esternal, extendiéndose a través de la piel y tejidos blandos que cubren el esternón.
   2. Usando las tijeras, crear un orificio en el diafragma en el proceso del xiphoid para entrar en la cavidad torácica.
   3. Utilice tijeras para diseccionar la membrana de la pared ventral del tórax, bilateral.
   4. Corte a través de los cartílagos costales para separar las costillas el esternón en el borde derecho esternal.
   5. Se aplica una pinza hemostática fina en la punta del esternón (cerca del proceso xifoides) y mover la pinza cranially por lo que se coloca sobre la cabeza del ratón. Esto retraerá el timo y el esternón lejos del corazón, exponiendo el corazón y grandes recipientes para la manipulación de otros.
   6. Disecan agudamente cualquier accesorio entre el corazón y la pared torácica.
   7. Conecte la aguja de calibre 27 IV catéter a una jeringa pre cargada con 10 mL de solución salina heparinizada tamponada de fosfato (5 U/mL) y completar todos los tubos con el tampón para eliminar las burbujas de aire de los tubos de la bomba de presión.
   8. Tenga cuidado mientras se prepara el líquido de burbujas en la línea de líquido puede impedir el llenado de recipientes más pequeños. Limitar el número de vasos que están dañados durante la preparación del animal, ya que el agente de contraste para escaparse de los vasos de cortado, cambiar el volumen requerido para un llenado completo y la introducción de artefactos en la imagen final.
   9. Punción del ventrículo izquierdo con una aguja de calibre 27 que se estabiliza con una abrazadera de ángulo recto. Inmediatamente haga una incisión en el ventrículo derecho o vena cava inferior para drenar la solución de heparina y sangre.
      Nota: Se utiliza heparina como anticoagulante para evitar que la sangre de la coagulación en los vasos después de la muerte del animal.
   10. Inundar el animal a una velocidad constante de 2 mL por minuto, usando una sola bomba. Observe la palidez visible de los órganos. Continuar la perfusión hasta que la solución de drenaje de la circulación venosa de la sangre (aproximadamente 5-6 mL). Parar la bomba.
   11. Desconecte el tubo del catéter IV de la jeringa de 10 mL, cuidando de no para alterar la posición de la aguja en el ventrículo izquierdo.
   12. Inmediatamente después de la completa exsanguinación, separar la solución de agente de contraste en alícuotas de 5 mL y agregue el agente endurecedor en este momento (vea el paso 1.2). Mézclelos bien. Elaboración de 5 mL de la mezcla del agente de contraste en una jeringa de 10 mL y perfusión el animal con él.
   13. Para un llenado completo de los vasos (arterias y venas), continuar la infusión más allá del punto cuando se ve salir la solución venosa. Buscar signos de una perfusión exitosa incluyendo la visualización de un agente de casting en las arterias coronarias, arterias pulmonares, del intestino y vasculatura hepática.
   14. El agente de contraste se cura después de aproximadamente 20 minutos a temperatura ambiente. Curado, cosecha los órganos individuales, según sea necesario y fijar en 10% formalina tamponada neutra. Fijar canales todo si las muestras no se utilizan para el día siguiente la exploración micro-CT. Si las canales va a utilizar el día siguiente, colocar en una bandeja de metal y coloque en el refrigerador a 4 ° C para curar durante la noche.

3. micro-exploración del CT y los parámetros

Nota: Los parámetros de adquisición de imagen específica dependerá la máquina en uso.

1. Adquirir imágenes de la tomografía computada de la radiografía de cada ratón el día siguiente la perfusión utilizando un tomógrafo micro con una tensión de tubo de rayos x de 55 kVp, una corriente de 150 mA, un factor de ampliación del sistema de 2.19 y CCD cámara pixel binning factor de 2. Esto produce un tamaño de píxeles efectivos de 29 μm.
   1. Coloque la carcasa del ratón supina sobre la mesa micro-CT escáner y obtener a un scout scan de rayos x.
   2. El detector de campo de visión de 57,4 mm (axial) x 37,1 mm (transaxial) se centran en el torso a la imagen de toda la longitud de la aorta.
   3. Adquirir 180 proyecciones de imagen con un incremento de rotación de 2 grados y tiempo por proyección de 2800 ms.
2. Reconstruir las imágenes usando un algoritmo modificado de Feldkamp; el tamaño del voxel reconstruido es de 29 x 29 x 29 μm³ (espesor de la rebanada = 29 μm) usando la visualización 3D Multimodal plug-in para el software utilizado aquí.

4. post procesamiento y representación

1. Convertir los datos del CT en un formato DICOM usando el software apropiado.
2. Analizar las imágenes para identificar si un aneurisma estaba presente. Mida el diámetro del eje menor en el punto más ancho del arco aórtico, aorta torácica, descendente y aorta abdominal como describió anteriormente¹⁸ (figura 1).
   Nota: En nuestro estudio, imágenes fueron analizadas por dos observadores independientes (uno ciego) utilizando un visor DICOM para identificar si un aneurisma estaba presente. Se midió el diámetro del eje menor en el punto más ancho del arco aórtico, descendente aorta torácica y aorta abdominal como se describió anteriormente¹⁹ (figura 1). Significa no aneurismática segmentos arteriales de los ratones no tratados BAPN establecieron diámetros de vaso normal como los valores de edad comparable del control.
3. Los aneurismas se definen como una dilatación localizada o difusa de los segmentos aórticos para diámetros mayores al 50% del diámetro de referencia. Localizar estos basados en las mediciones anteriores.

Results

Para evaluar este protocolo, 20 ratones adultos machos, del fondo mixto como se describió anteriormente¹⁹ y de 20-30 semanas de edad, con o sin tratamiento BAPN, fueron perfundidos con un caucho de silicón radiopaco con base de plomo (véase el tabla de materiales ) utilizando el protocolo detallado arriba. Experimentaron la exploración micro-CT en el día siguiente (figura 1 y figu...

Discussion

Micro-CT en la proyección de imagen puede utilizarse para proporcionar reconstrucciones altamente detalladas y tridimensionales de la patología vascular en modelos animales. Mediante el uso de medios de contraste intravasculares, no mejora los tejidos blandos, como el lumen de un vaso sanguíneo, se pueden distinguir de aquellos que están mejorando. Láser Doppler, microangiography, angiografía por resonancia magnética, histología con microscopia confocal y dos fotones puede utilizarse para evaluar vasculares camas, suelen...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Microfil	Flow Tech, Inc	MV-122	Utilizamos amarillo, se puede pedir un color diferente según se desee. El kit incluye compuesto MV, diluyente MV y agente de curado MV.
Heparina (1000 U/mL)	Sagent Pharmaceuticals	25021-400-10
Solución salina tamponada con fosfato	Corning	21-031-CV
Isoflurano	Vet One, MWI	502017
3-Sal de fumarato de aminopropionitrilo	Sigma-Aldrich	A3134
Bomba de jeringa única	Fisher Scientific	14-831-200
calibre 27 aguja para juego de venas del cuero cabelludo	Exel Int	26709	tubo de 27G x 3/4", 12"
Escáner Inveon Micro-CT	Siemens Medical Solutions
Osirix MD	Pimxmeo SARL		Versión 8.0.2
Inveon Research Workplace	Siemens Medical Solutions		Versión 4.2
Roedor Chow	Harlan Teklad	2018sx