Aquí se presenta un protocolo para imitar la entrada de compuestos derivados de bacterias después de la ruptura de la barrera intestinal. Una baja dosis subletal de lipopolisacárido se inyectó sistémica en ratones, que fueron supervisados para la inyección después de 24 h. La expresión de citoquinas proinflamatorias se determinó en varios puntos del tiempo en bazo, hígado y colon.
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Artículo de método
Inyección de lipopolisacárido en ratones para imitar la entrada de productos derivados de microbios después de la ruptura de la barrera Intestinal
En este artículo
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Resumen
Resumen
La barrera epitelial intestinal separa el host de la microbiota que normalmente es tolerada o ignorada. Resultados de la violación de esta barrera en la entrada de bacterias o productos derivados de las bacterias en el host, acceso a la circulación de host y órganos internos, llevando a la inflamación incontrolada, como se observa en pacientes con enfermedad inflamatoria intestinal (EII), que se caracterizan por un aumento de la permeabilidad epitelial intestinal.
Para imitar la entrada de compuestos derivados de bacterias en el host, un modelo de endotoxemia ha sido adoptado en que lipopolysaccharide (LPS), un componente de la pared celular externa de bacterias Gram-negativas, fueron inyectadas en ratones. En este estudio, una dosis subletal de LPS se inyectó por vía intraperitoneal y los ratones fueron posteriormente monitoreados durante 8 h con un marcador de enfermedad. Además, la expresión se analizaron los niveles de las citoquinas pro-inflamatorias Il6, Il1b y Tnfa en bazo, hígado y colon por qPCR en diferentes puntos temporales post inyección de LPS. Este modelo puede ser útil para los estudios de investigación de la respuesta inmune después de la invasión de microorganismos o productos derivados de la bacteriana causados por una violación de la barrera de las superficies del cuerpo.
Introducción
El intestino humano es colonizado con un gran consorcio de microorganismos que forman la microbiota, que ha desarrollado una relación mutuamente beneficiosa con el anfitrión durante la evolución. En esta relación, el anfitrión ofrece un lugar seguro para la microbiota, mientras que la microbiota proporciona vitaminas, nutrientes digestión y protección contra agentes patógenos al host, donde la microbiota reside1. Cuando se altera esta relación beneficiosa entre el host y la microbiota, pueden desarrollar enfermedades, tales como enfermedad inflamatoria intestinal (EII). EII es una enfermedad inflamatoria crónica multifactorial del intestino cau....
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Protocolo
Ratones fueron criados y mantenidos bajo libre de patógenos (SPF) condiciones específicas en el Animalario del Departamento de Biomedicina, Universidad de Basilea (Basilea, Suiza). Se realizaron todos los experimentos de ratón conformidad con el Federal suizo Cantonal (número de protocolo animal 2816 [Cantón de Basilea-Stadt]).
1. preparación de solución de LPS
- Abra el stock de LPS purificado de Escherichia coli 0111:B4 en condiciones estériles y reconstituir en agua a la concentración de 5 mg/mL.
- Diluir la acción de LPS con el tampón de fosfato estéril salino (PBS) a la concentración de trabajo de 0,2 μg/μl.
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Resultados
Para imitar las consecuencias para el huésped después de la entrada de bacterias o productos derivados de bacterias que se produce después de la ruptura de la barrera intestinal, LPS se inyectó en ratones C57Bl/6 en dosis subletal (2 μg/g de peso corporal). Cada ratón fue supervisado y anotó para la aparición de endotoxemia con parámetros enumerados en la hoja de puntuación que incluye, la aparición de los ratones, la actividad de los animales, la condición de los ojos y la tasa de respir.......
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Discusión
Este protocolo imita procesos inmunológicos que se producen después de la invasión de productos derivados de microbios. Pasos críticos en el protocolo son la selección de la línea de ratón, el estado de higiene de los ratones, la dosis de LPS, el seguimiento de los animales para la aparición de endotoxemia y el momento de la terminación del experimento. Lo más importante, el fondo genético de la cepa de ratón ha de ser considerada. Cepas de ratón diferentes tienen diferente susceptibilidad a LPS. Por ejemplo, el C3H/HeJ .......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
JHN es apoyado por la Fundación Nacional Suizo (FNS 310030_146290).
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| DreamTaq Green PCR Master Mix (2x) | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EE. UU | K1081 | |
| Kit de transcripción inversa de ADNc de alta capacidad,Applied | Biosystems, Foster City, CA, EE. UU | 4368813 | |
| Conjunto de DNasa libre de RNasa,Qiagen | , Hilden, Alemania | 79254 | |
| LPS Escherichia coli O111:B4 | Invivogen, San Diego, CA, EE. UU. | tlrl-eblps | |
| Omnican 50 Jeringa de insulina de un solo uso | B. Braun Melsungen, Melsungen, Alemania | 9151125 | |
| Bioanalyzer 2100 | Agilent Technologie, Santa Clara, EE. UU. | No aplicable | |
| Centrífuga 5430 | Eppendorf, Hamburgo, Alemania | no aplicable | |
| Centrífuga Mikro 220R | Hettich, Kirchlengern, Alemania | no aplicable | |
| Herramientas de disección | Aesculap, Tuttlingen, Alemania | no aplicable | |
| Sistema de preparación de muestras Fast-Prep-24 5G | M.P. Biomedicals, Santa Ana, CA, EE. UU. | No aplicable | |
| NanoDrop ND-1000 | NanoDrop Products, Wilmington, DE, EE. UU. | no aplicable | |
| Reactivo TRI | Zymo Research, Irvine, CA, EE. UU | R2050-1 |
Referencias
- Backhed, F., Ley, R. E., Sonnenburg, J. L., Peterson, D. A., Gordon, J. I. Host-bacterial mutualism in the human intestine. Science. 307, 1915-1920 (2005).
- Abreu, M. T., et al. Mutations in NOD2 are associated with fibrostenosing disease in patients with Crohn's dise....
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Reimpresiones y permisos
Erratum
Formal Correction: Erratum: Injections of Lipopolysaccharide into Mice to Mimic Entrance of Microbial-derived Products After Intestinal Barrier Breach
Posted by JoVE Editors on 8/04/2018. Citeable Link.
An erratum was issued for: Injections of Lipopolysaccharide into Mice to Mimic Entrance of Microbial-derived Products After Intestinal Barrier Breach
One of the authors' names was corrected from:
Katarina Raduolovic
to:
Katarina Radulovic
