Inyección de lipopolisacárido en ratones para imitar la entrada de productos derivados de microbios después de la ruptura de la barrera Intestinal

El intestino humano es colonizado con un gran consorcio de microorganismos que forman la microbiota, que ha desarrollado una relación mutuamente beneficiosa con el anfitrión durante la evolución. En esta relación, el anfitrión ofrece un lugar seguro para la microbiota, mientras que la microbiota proporciona vitaminas, nutrientes digestión y protección contra agentes patógenos al host, donde la microbiota reside¹. Cuando se altera esta relación beneficiosa entre el host y la microbiota, pueden desarrollar enfermedades, tales como enfermedad inflamatoria intestinal (EII). EII es una enfermedad inflamatoria crónica multifactorial del intestino causada por factores genéticos y ambientales que se presentan en dos formas principales, (CD) de la enfermedad de Crohn y colitis ulcerosa (Cu). A pesar de las similitudes entre las dos formas de EII, se caracterizan por ciertas diferencias en la ubicación y naturaleza de las modificaciones inflamatorias. CD es un desorden inflamatorio de recaída transmural que potencialmente se puede extender a cualquier parte del tracto gastrointestinal, mientras que la UC es no transmural y se limita a los dos puntos. Además, las mutaciones de nucleótido-Oligomerización dominio-que contienen proteína 2 (NOD2), un receptor de reconocimiento de patrón (PRR) que reconoce Muramil dipéptido (MDP), un componente de la pared celular de más bacterias Gram positivas y - negativo, es asociados con el CD². Además, Listeria y estreptococos , Escherichia coli (e. coli)y sus productos todos se encontraron dentro de los macrófagos en pacientes con EC que han entrado en el host después de que una barrera de incumplimiento³. Cuando las bacterias o sus productos entran en el host durante el desarrollo del CD, el sistema inmunológico desarrolla una respuesta lleva a la producción de anticuerpos anti-bacterial⁴en circulación. Tal vez, la evidencia más convincente para el papel de la microbiota en la patogenia de la EII deriva en modelos de ratón. Cuando los animales son tratados con antibióticos, o cuando los ratones se mantienen en condiciones libres de gérmenes de (GF), la severidad de la enfermedad se reduce en la mayoría de los modelos de colitis, como de IL-10-/-ratones que desarrollan colitis en GF instalaciones^5,6. Además, la colitis también perturba la composición de la microbiota, que se caracteriza por una composición desequilibrada y reducida riqueza llamada disbiosis⁷. La consecuencia de la EII puede ser un aumento de la permeabilidad intestinal que puede conducir a la entrada de microbios y productos derivados de microbios en el host.

En los animales, la aplicación de sulfato de sodio-dextrano (DSS) induce una infracción epitelial intestinal conduce a un aumento de la permeabilidad de la barrera epitelial⁸. Portal LPS concentraciones son elevadas en animales con DSS colitis⁹. Curiosamente, animales que carecen el C tipo lectina receptor adherencia intracelular específica molécula-3 ase nonintegrin relacionadas con homólogo 1 (señal-R1) son protegidos de colitis DSS y endotoxemia inducida por LPS¹⁰. Para difundir aún más en el huésped, bacterias o productos derivados de las bacterias tienen que pasar la barrera vascular¹¹, la cavidad peritoneal, donde se encuentra el intestino pequeño y grande, los nodos de linfa mesentéricos y el hígado¹². Para reducir la complejidad de este sistema, se utilizó un compuesto de origen bacteriano definido. LPS, que causa la endotoxemia después intraperitoneal (i.p.) o intravenosa (i.v.) inyección¹³ se inyectó en ratones, para estudiar la expresión de interleuquinas Il6 y Ilb y la citoquina Tnfa en respuesta a LPS.

LPS es un patrón asociado a patógenos molecular (PAMP) expresado como un componente de la pared celular de bacterias Gram-negativas, que consiste en lípido A (PAMP principal en la estructura del LPS), un oligosacárido núcleo y una O lado cadena¹⁴. Receptor de tipo Toll 4 (TLR4) expresadas por las células dendríticas, macrófagos y células epiteliales reconoce LPS¹⁵, que requiere de receptores de cooperación para el enlace apropiado. La fase aguda proteína de unión a LPS (LBP) une a LPS para formar un complejo que transfiere LPS al cluster de diferenciación 14 (CD14), una proteína de membrana glicosilfosfatidilinositol anclada. CD14 más lanzaderas LPS para antígeno de linfocito 96 o también conocido como el MD-2, que se asocia con el dominio extracelular de TLR4. La Unión del LPS a MD-2 facilita la dimerización del TLR4/MD-2 inducen cambios conformacionales para reclutar moléculas intracelulares adaptador para activar el downstream señalización vía¹⁴, que incluye la diferenciación mieloide primaria gen de respuesta 88 (MyD88) - camino del dependiente y el TIR dominio-que contienen adaptador induce interferón-β (TRIF) - dependiente de la vía¹⁶. El reconocimiento de los LPS por TLR4 activa la vía de NF-κB e induce la expresión de citocinas proinflamatorias, como el TNFα, IL-6 e IL-1β¹⁷.

En particular, cuando LPS se inyecta en animales, la concentración de LPS a los animales, el fondo genético del animal y la dieta tiene que ser considerado. Altas concentraciones de LPS conduce a un choque séptico, caracterizado por hipotensión y fallos múltiples del órgano y finalmente a muerte¹⁸. Ratones son menos sensibles al LPS comparados con los seres humanos, donde están capaces de inducir una tormenta del cytokine del¹⁹LPS las concentraciones entre 2-4 ng/kg de peso corporal (BW). Para los ratones, la dosis letal (DL50), que induce la muerte en la mitad de los rangos de ratones de 10-25 mg/kg BW²⁰ dependiendo de la cepa de ratón utilizada. Para las cepas utilizadas ratón C57Bl/6 y BALB/c, la dosis letal 50% (DL50) es de 10 mg/kg BW. En contraste, las cepas C3H/HeJ y C57BL/10ScCr son protegidas de endotoxemia inducida por LPS, que es debido a mutaciones en Tlr4²¹. En consecuencia, deficientes en Tlr4 ratones son hyporesponsive a las inyecciones con LPS²². Otras líneas de ratón modificados genéticamente, como PARP1/ratones²³ son resistentes al choque tóxico inducida por LPS.

El modelo de ratón descrito aquí utiliza una dosis subletal de LPS administrado sistémicamente para imitar las consecuencias de la difusión de LPS después de una ruptura de la barrera de las superficies del cuerpo. La concentración de LPS solicitada (2 mg/kg BW) no indujo mortalidad en ratones C56Bl/6, pero la inducida por liberación de citoquinas proinflamatorias.

Ratones fueron criados y mantenidos bajo libre de patógenos (SPF) condiciones específicas en el Animalario del Departamento de Biomedicina, Universidad de Basilea (Basilea, Suiza). Se realizaron todos los experimentos de ratón conformidad con el Federal suizo Cantonal (número de protocolo animal 2816 [Cantón de Basilea-Stadt]).

1. preparación de solución de LPS

1. Abra el stock de LPS purificado de Escherichia coli 0111:B4 en condiciones estériles y reconstituir en agua a la concentración de 5 mg/mL.
2. Diluir la acción de LPS con el tampón de fosfato estéril salino (PBS) a la concentración de trabajo de 0,2 μg/μl.

2. intraperitoneal inyección de LPS a los ratones

1. Aspire los LPS solución diluida en una jeringa de 0.5 mL con una aguja de 30 G en un flujo de aire laminar.
2. Pesar ratones C57Bl/6 mujeres (seis a 10 semanas de edad) y calcular la cantidad de LPS que se inyecta: 10 μl (2 μg) / g de peso corporal.
   Nota: por ejemplo, si un ratón pesa 20 g y 20 g x 10 μl = 200 LPS μl trabajo necesidades de solución para ser inyectada.
3. Manejar el mouse con suavidad pero con firmeza y refrenar el animal en una mano. Asegúrese de que el animal es capaz de respirar normalmente pero no girar y girar durante la contención.
4. Inclinación de la nariz del ratón ligeramente hacia el suelo para exponer el abdomen para la inyección. Busque la línea media del abdomen y el lugar de la inyección en el abdomen bajo izquierdo o derecho de la línea media. Inyectar la i.p. PBS en lugar de LPS en ratones de control.
5. Con la mano libre, inyectar el volumen adecuado (el volumen calculado en el paso 2.2) de los LPS de solución. Asegúrese de que la aguja ha entrado en la cavidad peritoneal en caso contrario, pueden ocurrir mal las inyecciones en la capa del músculo abdominal. Todavía, no ir demasiado profundo con la aguja en la cavidad peritoneal para evitar lesionar órganos internos ubicados en esa zona.
6. Volver cuidadosamente al animal a la jaula con 5 ratones por jaula.

3. Controle los ratones

1. Controlar los animales en el momento de inyección y cada 2 h después de la inyección de 8 h para la ocurrencia y la severidad de endotoxemia. Por lo tanto, utilizar una hoja de puntuación (tabla 1) que ha sido adaptada de un manuscrito previamente publicados ²⁴.
2. Cuenta los ratones inyectados de LPS para los parámetros enumerados en la tabla 1
   1. Compruebe el aspecto de la piel que es normalmente suave. Si el pelo rizado, pelo spiky o hinchada que indica incomodidad o dolor, cuenta como 1, 2 o 3.
   2. Compruebe que la actividad del ratón.
      Nota: Ratones normalmente moverse libremente alrededor de la jaula todo comer, beber, subir, pero suprimida o restringida de la actividad podría ser un signo de dolor.
   3. Compruebe el nivel de conciencia.
      Nota: Los ratones son muy curiosos, y normalmente se mueven alrededor de la jaula, investigar los alrededores. Falta de o disminución del movimiento sugerir dolor y malestar.
   4. Revise los ojos.
      Nota: Ojos totalmente abiertos se espera que en los ratones sanos, pero ojos parcial o totalmente cerrados, posiblemente con la secreción, pueden ser un indicio de dolor.
   5. Compruebe que la tasa de respiración.
      Nota: Ratones sanos suelen tienen un ritmo de respiración normal y rápida, un ritmo de respiración reducido podría ser un indicio de malestar).
   6. Compruebe la calidad de la respiración.
      Nota: Respiración lenta con o sin jadear es un signo de dolor.

4. tejido muestreo para la extracción de ácido ribonucleico (ARN) y homogeneización

1. Preparar los tubos de colección/homogeneización: Agregue 1 mL solo paso RNA aislamiento reactivo en tubos de 2 mL prellenada con esferas cerámicas de 1.4 milímetros.
2. En los momentos apropiados (antes (0 h) y 2 h, 4 h y 8 h después de la inyección de LPS) eutanasia el ratón con sobredosis de anestésico (isoflurano) seguido de exsanguinación y proceder con la disección.
3. Cortar la piel y la capa muscular exponiendo la cavidad abdominal con los órganos internos con un par de tijeras.
4. Diseccionar el bazo, el hígado y el colon, la limpieza los órganos de la grasa y mantenerlos en PBS en el hielo.
5. Corte un trozo pequeño (de unos 0,5 cm) de cada órgano mediante tijeras o bisturí.
   Nota: Es importante siempre tomar la pieza de aproximadamente la misma parte del órgano en cada ratón (mismo lóbulo de parte de hígado, proximal o distal del colon).
6. Poco seco el tejido en un pedazo de papel tejido y colóquelo en el tubo de colección/homogeneización asegurándose de que está completamente inmerso en reactivo de aislamiento de RNA.
7. Homogeneizar el tejido en un homogeneizador de alta velocidad de la mesa. Para los tejidos blandos como bazo, hígado y colon usan 1 ciclo de homogeneización a velocidad 6.00 para 30 s.
8. Incubar las muestras durante 5 minutos a temperatura ambiente.
9. Con cuidado coloque el tubo en el nitrógeno líquido para congelar el tejido lisado. Almacenar el resorte congelado lisado a-80 ° C hasta el aislamiento de RNA.

5. RNA extracción del tejido

Nota: Los reactivos de aislamiento de RNA, cloroformo y alcoholes se consideran como material peligroso. Realizar extracción de RNA bajo una campana química. Uso certificado libre de Rnasa reactivos y equipo para mantener un ambiente libre de Rnasa.

1. Separación de la fase
   1. Descongelar el lisado de tejido congelado en el hielo.
   2. Centrifugar la muestra a 1.000 x g durante 5 min a 4 ° C para que sedimenten las partículas restantes de tejido que pudieran quedar.
   3. Transferir el sobrenadante a un nuevo tubo libre de nucleasa 1,5 mL.
   4. Añadir cloroformo helada de 200 μL por aislamiento de RNA de 1 mL Reactivo y agitar vigorosamente a mano s de 10-15.
   5. Incubar durante 2-3 min a temperatura ambiente.
   6. Centrifugar a 12, 000 x g durante 15 min a 4 ° C.
      Nota: La muestra ahora contiene 3 fases: inferior de rojo fenol-cloroformo fase, la interfase y la fase acuosa incolora superior. El ARN está presente en la fase acuosa superior.
   7. Recoger la fase acuosa superior (50% del volumen total) y la transferencia en un nuevo tubo libre de nucleasa 1,5 mL.
2. Precipitación de RNA
   1. Agregar 0,5 mL isopropanol helada por 1 mL Reactivo de aislamiento de RNA y mezclar suavemente por inversión del tubo 5 - 6 veces.
   2. Incubar por 10-15 min a temperatura ambiente.
   3. Centrifugar a 12.000 x g durante 10 min a 4 ° C.
      Nota: El pellet de RNA debe ser visible en esta etapa.
3. Lavado del pellet de RNA
   1. Eliminar completamente el sobrenadante que contiene el isopropanol sin perturbar el pellet.
   2. Lavar el pellet con etanol del de 75% helada 1 mL por 1 mL RNA aislamiento de reactivo utilizado para la lisis inicial.
   3. Vórtice la muestra brevemente.
   4. Centrifugar la muestra a 7.500 (o 12.000) x g durante 5 min a 4 ° C.
4. Disolución de ARN
   1. Eliminar por completo el etanol en el sobrenadante sin perturbar el pellet.
   2. Dejar el tubo abierto debajo de la campana química 3-5 minutos secar el pellet de RNA en la temperatura ambiente (no demasiado seco, en ese caso va a ser difícil disolver RNA).
   3. Disolver el pellet de RNA en 20-50 μl libre de nucleasa de agua mediante pipeteo con cuidado hacia arriba y hacia abajo.
   4. Incubar la muestra a 55 ° C durante 10-15 min mejorar aún más la solución del ARN.
      Nota: En esta etapa, el RNA se puede almacenar a-80 ° C hasta su análisis posterior.

6. digestión del ADN restante

1. Medir la concentración de RNA con un espectrofotómetro por pipetear una alícuota (2 μL) en el espectrofotómetro y ajustar a la concentración recomendada.
2. Comenzar la digestión de la contaminación de ADN con max. 10 μg RNA en 50 μl de agua libre de nucleasa.
3. Agregar 0.1 volumen de 10 x DNasa tampón y 1 μl rDNase I por la muestra y mezclar suavemente mediante pipeteo arriba y abajo.
4. Incubar a 37 ° C durante 20-30 min.
5. Reactivo de inactivación de DNasa de vórtice y añadir volumen 0.1 de la muestra mezclando bien con la pipeta.
6. Incubar por 5 min a temperatura ambiente, mezclar de vez en cuando a mano.
7. Centrifugar a 10.000 x g durante 1,5 minutos.
8. Transferir el sobrenadante que contiene RNA DNA-libre en el nuevo tubo libre de nucleasas.
9. Medir la concentración de RNA y la calidad de espectrofotómetro.

7. transcripción reversa

1. Utilice un kit de transcripción inversa (RT) de cDNA ácido desoxirribonucleico comercialmente disponible para reversa de la transcripción.
   Nota: Aquí, hasta 2 μg de ARN puede revertirse transcrito.
2. Calcular el volumen, que contiene 2 μg de RNA. Pipetear 2 μg de RNA en un nuevo tubo PCR.
3. Añadir agua libre de nucleasa a la muestra en el tubo PCR hasta el volumen final de 10 μl.
4. Preparar 2 x Master Mix mezclando los siguientes componentes enumerado en la tabla 2
5. Añadir 10 μl de 2 x Master Mix a 10 μl de RNA para obtener 1 x Master Mix en el volumen total de 20 μl.
6. Cerrar el tubo de reacción en cadena (PCR) polimerasa y el giro de la muestra brevemente.
7. Coloque las muestras en un termociclador de PCR y establezca los ajustes enumerados en la tabla 3.
8. Almacenar el cDNA generado a-20 ° C para su posterior análisis.

8. PCR cuantitativa (qPCR)

1. Realizar la reacción de qPCR con un kit disponible comercialmente.
2. Uno mismo-diseñe y pruebe los iniciadores del intrón-atravesar, antes de su uso, con diferentes concentraciones de cDNA de la plantilla. Analizar la eficacia de la cartilla mediante la creación de una curva estándar y los cebadores con alta eficacia y las curvas de fusión correcta.
   Nota: Las secuencias de los primers utilizados en este experimento se enumeran en la tabla 2.
3. Preparar la reacción cuantitativa de polimerasa de reacción en cadena (qPCR) en la placa de 384 pozos con la configuración de la reacción que se describe en la tabla 4.
4. Mantenga todas las soluciones y la placa de hielo usando papel de aluminio para evitar que la placa se humedezcan cuando se prepara la mezcla de reacción.
5. Llevar a cabo todas las reacciones en triplicado.
6. Llevar a cabo la reacción de PCR en un termociclador utilizando la configuración que se enumeran en la tabla 5.
7. Calcular el valor medio de la Ct para todas las reacciones de los triplicados. Normalizar todos los genes de objetivo para el nivel de expresión de la glycerinealdehyde-3-fosfato-deshidrogenasa (Gapdh) gen housekeeping mediante el cálculo de 2^(-ΔCt).
   Nota: Todos los genes de la blanco con el Ct promedio > 35 considerados bajo límite de detección.

Para imitar las consecuencias para el huésped después de la entrada de bacterias o productos derivados de bacterias que se produce después de la ruptura de la barrera intestinal, LPS se inyectó en ratones C57Bl/6 en dosis subletal (2 μg/g de peso corporal). Cada ratón fue supervisado y anotó para la aparición de endotoxemia con parámetros enumerados en la hoja de puntuación que incluye, la aparición de los ratones, la actividad de los animales, la condición de los ojos y la tasa de respiración y de la calidad (tabla 1) . Los animales mostraron signos clínicos de la enfermedad que alcanzó su punto máximo de 6 a 10 h después de la inyección de LPS y recuperado dentro de 24 h (figura 1). Los ratones fueron sacrificado 2 h, 4 h y 8 h después de la inyección de LPS. Se recolectaron piezas de tejido de bazo, hígado y colon. RNA fue aislado de estos órganos y atrás transcrito a cDNA. El cDNA se utilizó como plantilla para qPCR para determinar los niveles de expresión de Il6 (figura 2A) Il1b (figura 2B), TNFa (figura 2) y Il10 (Figura 2D) con cebadores utilizados para la qPCR listados en la tabla 6. La expresión de Il6 alcanzó 2 h después de la inyección en el bazo y colon y 4 h después de la inyección en el hígado. La expresión de la Il1b, TNFa y Il10 alcanzó 4 h después de la inyección en bazo, hígado y colon. Dentro de las 8 h después de la inyección, la expresión de Il6, Il10 , Il1by TNFa, volvió a los niveles basales.

Figura 1: inyección de LPS (2 μg/g de peso corporal) inducida por signos clínicos de la endotoxemia en C57Bl/6mice. Después de la inyección de 2 μg/g de peso corporal de LPS, los ratones fueron supervisados con la puntuación de la enfermedad presentada en la tabla 1 que incluye el aspecto y la actividad de los animales, abriendo sus ojos y su tasa de respiración y calidad cada 2 h durante 12 h y 24 h de popa ER la inyección de LPS. La puntuación de la enfermedad (eje y) fue borrado en el tiempo respectivo (eje x). Promedio ± SD para 4-5 ratones por cada punto del tiempo se presenta. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: inyección de LPS (2 μg/g de peso corporal) induce la expresión de cytokines favorable-inflamatorios en ratones C57Bl/6. Ratones fueron inyectados con 2 μg/g peso de LPS y los niveles de expresión de Il6 (A), (B)de la Il1b , Tnfa (C) y Il10 (D) se analizaron por qPCR en bazo, hígado y colon en el tiempo indicado puntos después de la inyección. Niveles de expresión de citocinas se normalizan a la expresión de la Gapdh. Promedio ± SD para 4-5 ratones por cada punto del tiempo se muestra. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Tabla 1: hoja de puntuación de enfermedades para controlar ratones C57Bl/6 después de la inyección de LPS. Parámetros que son monitoreados después de la inyección de LPS. Los animales fueron monitoreados cada 2 h después de la inyección durante un período de 12 horas, y decenas fueron dadas para cada parámetro individual indicado en la tabla. El puntaje final para cada animal representa la suma de todas las puntuaciones individuales. Esto es adaptado de la referencia24. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Tabla 2: Reactivos utilizan para preparar la mezcla principal para reversa de la transcripción.

Tabla 3: Configuración de Termociclador utilizado para transcripción reversa.

Tabla 4: Descripción de la reacción de PCR.

Tabla 5: Configuración de Termociclador utilizado para PCR.

Tabla 6: iniciadores utilizados en la reacción de qPCR. La secuencia de los primers utilizados para qPCR para detectar ratón citoquinas y gen housekeeping Gapdh.

Los autores no tienen nada que revelar.