Artículo de método

Ultra bajo entrada genoma secuencia biblioteca elaboración de un solo espécimen Tardigrade

DOI:

10.3791/57615

⸱

15 de julio de 2018

 ,  ,  ,  ,  , 
1Institute for Advanced Biosciences, Keio University, 2Systems Biology Program, Graduate School of Media and Governance, Keio University, 3Faculty of Environment and Information Studies, Keio University

En este artículo

Resumen

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Contaminación durante la secuenciación de organismos microscópicos sigue siendo un gran problema. A continuación, os mostramos un método para secuenciar el genoma de un tardígrado de una sola muestra con tan poco como 50 pg de ADN genómico sin amplificación del genoma entero para minimizar el riesgo de contaminación.

Resumen

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Tardígrados son animales microscópicos que entran en un estado ametabólico anhydrobiosis llamados frente a la desecación y puede volver a su estado original cuando se suministra agua. La secuenciación genómica de los animales microscópicos como la contaminación bacteriana de tardígrados riesgos que a veces conduce a interpretaciones erróneas, por ejemplo, en relación con el grado de transferencia horizontal del gene en estos animales. Aquí, ofrecemos un método de entrada ultrabajo para secuenciar el genoma de tardígrado, Hypsibius dujardini, de una sola muestra. Empleando la rigurosa exclusión de lavado y contaminante junto con una extracción eficiente del 50 ~ 200 pg de ADN genómico de una sola persona, construimos una biblioteca ordenada con un instrumento de la secuencia de ADN. Estas bibliotecas fueron altamente reproducible y objetiva, y un análisis de informática de la Lee secuenciado con otros genomas de H. dujardini mostró un mínimo de contaminación. Este método puede aplicarse a unculturable tardígrados que no podrían ser secuenciados utilizando los métodos anteriores.

Introducción

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Tardígrados son animales microscópicos que pueden entrar en un estado ametabólico llamado anhydrobiosis frente a la desecación. Se recuperan por la absorción de agua1,2. En el estado de ametabólica, los tardígrados son capaces de tolerar ambientes extremos distintos, que incluyen temperaturas extremas3 y presiones de4,5, una alta dosis de luz ultravioleta6, rayos x y rayos gamma 7 , 8y9de espacio cósmico. Datos genómicos están un fundamento indispensable para el estudio de mecanismos moleculares de anhydrobiosis.

Los intentos anteriores para secuenciar el genoma de tardígrados han mostrado señales de contaminación bacteriana10,11,12,13,14. Secuenciación de estos pequeños organismos requiere una gran cantidad de animales y es propenso a la contaminación bacteriana; por lo tanto, previamente hemos establecido un protocolo de secuenciación utilizando un método ultra bajo de la entrada a partir de una única muestra de tardígrado, para minimizar el riesgo de contaminación15. Con estos datos, hemos realizado más un resecuenciación de alta calidad y el ensamblado del genoma de H. dujardini16,17. Aquí describimos en detalle este método de secuenciación de un solo individuo tardigrade ()figura 1). La validación de este método de secuenciación es más allá del enfoque de este trabajo y ya se ha discutido exhaustivamente en nuestro anterior informe16.

Este método se compone de dos partes: el aislamiento de un tardígrado solo con el más bajo posible de la contaminación y la extracción de alta calidad de niveles de pictograma de ADN. El tardígrado es hambre y enjuagarse con agua, así como antibióticos y observado bajo un microscopio con 500 aumentos para asegurar la eliminación de cualquier contaminación bacteriana. Mediciones y estimaciones previas muestran que un solo individuo de tardígrado contiene aproximadamente 50-200 pg de genomic DNA16, que se extrae por agrietar el exoesqueleto de quitina por ciclos de hielo-deshielo u homogeneización manual. Este ADN genómico es enviado a la construcción de la biblioteca y ordenado en un instrumento de la secuencia de ADN. Un análisis de informática adicional muestra la secuencia de alta calidad, así como bajos niveles de contaminación en comparación con anteriores proyectos de secuenciación tardigrade.

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Protocolo

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1. preparación

  1. Preparar el gel de agarosa al 2% con agua destilada (DW) como solvente en una placa de cultivo de plástico de 90 mm y 10 mL de un 1% penicilina/estreptomicina cóctel con DW. El gel puede almacenarse durante 2-3 semanas en una incubadora a 18 ° C.
    Nota: Evite cualquier almacenamiento de información de gel por debajo de 10 ° C, para la baja temperatura reducirá el gel de agarosa, resultando en un espacio minúsculo entre el gel y la pared del plato de cultura en la que los tardígrados pueden quedar atrapados.

2. muestra preparación y la exclusión de contaminantes

  1. Recoger un tardígrado sola, coloque sobre la placa preparada de agar y lavarlo 2 x - 3 x con DW para eliminar cualquier partícula restante.
  2. Incubar el tardígrado a 18-22 ° C durante 24 h para eliminar cualquier exceso de comida de los intestinos.
  3. Coloque el tardígrado hambrienta en antibióticos de penicilina/estreptomicina durante 2-6 h para retirar cualquier contaminación bacteriana y colocar el animal descontaminado en un vidrio portaobjetos limpio con una pipeta P10.
  4. Observar el tardígrado bajo un microscopio con 500 aumentos y confirmar que no hay ningunas bacterias restantes.
    Nota: La alta magnificación con un estereomicroscopio es óptima, pero un microscopio óptico puede utilizarse alternativamente sin aplicar un cubreobjetos.
  5. Recoger al individuo utilizando una pipeta P10 con un máximo de 5 μl de líquido, colóquelo en un tubo de reacción en cadena (PCR) polimerasa de baja obligatoria y eliminar todo el exceso de líquido posible.
    Nota: Los microtubos, tubos PCR y las puntas de pipeta todos debe enlace baja para reducir al mínimo la pérdida de ADN.
    Nota: Realizar una homogeneización tan pronto como sea posible, para la rápida desecación o muerte del animal puede dañar significativamente la DNA genomic.

3. homogeneización y extracción de ADN

  1. Homogeneizar el animal para obtener su ADN genómico (gDNA) con uno de los métodos siguientes.
    Nota: Es fundamental para utilizar el equipo especificado que se muestra en la Tabla de materiales en los siguientes pasos de extracción de ADN, para otros equipos (ya sea columna y base del grano) no son eficaces en esta entrada muy baja. El tampón de lisis genómica ha sido suministrado con beta-mercaptoetanol 0,5% antes del uso.
    1. Homogeneizar el animal con ciclos de congelación y descongelación18.
      1. Inmediatamente después de paso 2.5, añadir 100 μl de tampón de lisis en el tubo PCR que contiene el tardígrado.
      2. Coloque el tubo PCR en nitrógeno líquido durante 10 minutos y, durante 10 minutos, mover a un bloque de calor calentado a 37 ° C. Repetir este paso 2 x.
        Nota: Este paso puede repetirse cuando la homogeneización no es suficiente o puede realizarse después de la trituración manual.
    2. Machacar manualmente el animal.
      1. Inmediatamente después de paso 2.5, bajo un estereomicroscopio, aplastar al individuo con la punta de la pipeta de P10 presionando el animal contra la pared del tubo PCR y añadir 100 μl de tampón de lisis.
        Nota: Es fundamental observar este procedimiento bajo un estereomicroscopio, porque fácilmente puede escaparse el tardígrado, y machacando ineficiente dará como resultado un fracaso para extraer gDNA. Asegúrese de que la cutícula tardigrade es rota para que el tampón de lisis puede infiltrarse en el organismo.
  2. Incubar el tubo durante 30 min a temperatura ambiente por lisis ocurrir.
    Nota: Un mínimo de 30 minutos es necesario para una lisis eficiente, pero la incubación puede ser más larga.
  3. Transferir el volumen completo (100 μL) de la mezcla de lisis en un microtubo de enlace de baja limpio de 1,5 mL.
  4. Añadir 100 μl de tampón de lisis en el tubo PCR bajo Unión que fue usado para la homogeneización y ahora está vacía y después de haber efectuado la mezcla, ponerlo en el microtubo de enlace de baja 1,5 mL utilizado en el paso 3.3. Repetir este paso 2 x.
  5. Como en el paso 3.4, añadir 300 μL de tampón de lisis en el tubo PCR de baja obligatoria, y, después de su uso, pasar la mezcla a los microtubos de 1,5 mL enlace de baja. Los microtubos de 1,5 mL baja unión deben contener 600 μl de la mezcla después de este paso.
    Nota: Estos pasos son minimizar la pérdida de gDNA atado a la pared del tubo PCR, lavando la muestra varias veces.
  6. Añadir el total de 600 μl de mezcla de lisis a la columna de vuelta colocada en un tubo de colección y centrifugar a 10.000 x g durante 1 minuto.
  7. Vuelva a aplicar el flujo a través de la columna y centrifugar a 10.000 x g durante 1 minuto.
    Nota: Este paso es vital para asegurar que la mayoría de lo gDNA está enlazado a la columna.
  8. Añadir 500 μl de tampón de lavado a la columna de spin y centrifugar a 10.000 x g durante 1 minuto transferencia la columna de la vuelta a un microtubo limpio de 1,5 mL.
  9. Aplicar 20 μl de 10 mM Tris-HCl, pH 8,5, a la columna de centrifugado, espere 5 minutos a temperatura ambiente y centrifugar a 10.000 x g durante 1 minuto.
    Nota: El tampón de elución no debe contener EDTA, porque interfiere con las enzimas de la preparación de biblioteca.
  10. Vuelva a aplicar el flujo a través de la columna de vuelta y después de 5 minutos de incubación a temperatura ambiente, centrifugue durante 1 min a 10.000 x g.
    Nota: Este paso es crítico para asegurar la máxima elución del gDNA enlazado a la columna.

4. Biblioteca construcción secuencia

  1. Fragmentación del ADN
    1. Transferencia 15 μl del eluant gDNA en un microtubo de 15 μl de fragmentación del ADN y centrifugar el tubo durante 1 min, utilizando una microcentrífuga de sobremesa.
      Nota: El microtubo especificado que se muestra en la Tabla de materiales es óptimo para una entrada. La fragmentación con volumen bajo sonicación es fundamental, y esto no se puede sustituir con la fragmentación enzimática debido a la muy baja concentración de ADN.
    2. Fragmento del gDNA a 550 bp.
      Nota: El 550 bp hemos utilizado con los siguientes parámetros: energía incidente máxima = 30 W, factor de servicio = 20%, ciclos por explosión = 50, tiempo de tratamiento = 23 s.
    3. Después de un cuidadoso pipeteado, transferir 10 μl de la mezcla de ADN fragmentada a un tubo PCR limpia baja obligatoria.
      Nota: El experimento se puede parar aquí. Preservar el ADN a 4 º C ó -20 ° C.
  2. Secuencia de construcción de biblioteca
    Nota: Es imprescindible utilizar el juego especificado en la Tabla de materiales en los siguientes procedimientos, debido a la baja cantidad de ADN de entrada.
    1. Añadir 2 μl de la solución de la preparación de plantilla y 1 μl de la enzima de preparación de la plantilla y homogeneizar con una pipeta.
    2. Realizar la reacción de preparación de la plantilla en un termociclador con las siguientes condiciones: 22 ° C por 25 min, 55 ° C por 20 min, hold de 4 ° C y una tapa caliente en 101-105 ° C. Una vez completada la reacción, proceder al siguiente paso.
    3. Añadir 1 μl del buffer de síntesis biblioteca y 1 μl de la enzima de síntesis de biblioteca a producto de la reacción de preparación de plantilla e incubar la mezcla a 22 ° C durante 40 minutos (con una espera de 4 ° C). Una vez completada la reacción, proceder al siguiente paso.
    4. Añadir 30 μl de la mezcla principal biblioteca amplificación (25 μl del buffer de amplificación de biblioteca, 1 μl de la enzima de la amplificación de la biblioteca y 4 μL de agua libre de nucleasas) y 5 μl del reactivo de indexación.
    5. Mezclar todo bien con una pipeta y centrifugar brevemente la mezcla con una centrífuga de mesa.
    6. Realizar una PCR con las condiciones presentadas en la tabla 1.
TemperaturaTiempoCiclos de
72 ° C3 minutos
85 ° C2 minutos
98 ° C2 minutos
98 ° C20 segundos4 ciclos
67 ° C20 segundos
72 ° C40 segundos
98 ° C20 segundos16 ciclos
72 ° C50 segundos
4 ° CMantenga

Tabla 1: Condiciones PCR.

  1. Purificación de los productos PCR
    Nota: Este paso puede ser sustituido con otros métodos de purificación. Si se utiliza un método alternativo, asegúrese de comprobar la pureza de ADN resultante usando un espectrofotómetro. Relación de absorbancia 260/280 y 260/230 debe estar por encima de 1,8.
    1. Añadir 50 μl de bolas magnéticas, pipetear la solución 10 x y centrifugar brevemente con una microcentrífuga de sobremesa.
    2. Incubar la solución por 2 min a temperatura ambiente.
    3. Incubar en un soporte magnético para 5 min o hasta que la solución esté completamente claro y eliminar el sobrenadante.
    4. Añadir 200 μL de etanol al 80% recién preparada para el tubo PCR de baja obligatoria en un soporte de imán, esperar 30 s y eliminar el sobrenadante. Repetir este paso 2 x. No molestes a los granos.
    5. Brevemente Centrifugue el tubo PCR de baja obligatoria con una centrifugadora de mesa y retire cualquier exceso etanol en soporte magnético. Secar los granos, pero evitar el secado excesivo.
    6. Resuspender los granos con 15 μl de 10 mM Tris-HCl, pH 8.5 Fondo pipetear la solución para que los granos magnéticos se distribuyen homogéneamente, incubar el tubo durante 2 min a temperatura ambiente y después de una breve centrifugación, incubar en un soporte magnético de 2 min hasta que la solución es clara.
      Nota: El tampón de elución no debe contener EDTA, pues interfiere con la química de secuenciación.
    7. Transferir el sobrenadante, sin perturbar el pellet, a un nuevo tubo PCR de baja obligatoria.
      Nota: El experimento se puede parar aquí. Preservar el ADN a 4 º C o a-20 ° C para el almacenamiento de largo plazo.

5. calidad verificación, cuantificación y secuencia de la DNA

Nota: No se realiza un control de calidad antes de este paso debido a la baja cantidad de ADN.

  1. Validación de la distribución del tamaño de ADN biblioteca
    Nota: Pueden utilizarse otros sistemas de electroforesis de alta sensibilidad con una divulgación digital de distribución de tamaño.
    1. Regresa el agente reactivo tampón de electroforesis y gel de cartucho (25-1.000 bp en gama) a temperatura ambiente.
    2. Agregar 3 μl del reactivo del tampón de electroforesis con 1 μl de la biblioteca de la secuencia y mezclar bien durante 1 minuto con un vórtex y brevemente de centrífuga con una centrífuga de mesa.
    3. Realizar la electroforesis y validar la distribución de tamaño de la biblioteca con el software asociado. El pico principal del fragmento debe ser ampliamente desde cerca de 300 a 1.000 bp.
  2. Cuantificación de ADN
    Nota: Otros métodos basados en fluorescencia o PCR cuantitativa puede también ser utilizado, pero espectrofotometría debe evitarse, ya que no es lo suficientemente precisa como para la cuantificación de las bibliotecas de la secuencia.
    1. Añadir 796 μl de solución tampón y 4 μL de reactivo fluorescente y mezclar bien. Dispensar 190 μl de la solución de trabajo a los dos tubos de ensayo y 197 μl a un tubo de ensayo.
    2. Añada 10 μl de estándares con concentraciones conocidas de ADN en cada tubo de ensayo que contiene 190 μl de la solución de trabajo y 3 μl de la biblioteca preparada para el tubo de ensayo que contiene 197 μl de la solución de trabajo.
    3. Vortex brevemente los tubos y centrifugar en una centrifugadora de mesa. Cuantificar el ADN utilizando un fluorómetro con configuración de 3 μl.
  3. Secuencia de ADN biblioteca
    Nota: La plataforma de secuenciación debe ser compatible con el kit de construcción de la biblioteca especificada.
    1. Preparar la biblioteca de secuencia basada en el protocolo del fabricante.
    2. Establecer la célula del cassette y del flujo de reactivos en el instrumento de la secuencia y entrar en la secuencia de funcionamiento información siguiendo el protocolo del fabricante.
    3. Ejecutar la secuencia.
      Nota: Hemos realizado dos carreras de la secuencia: una muestra/carrera, así como cuatro muestras multiplexadas en una carrera.

6. Computación Análisis

  1. Base de llamada y, si es necesario, demultiplexar la Lee.
  2. Validar la calidad de los datos de la secuencia con FastQC19.
    Nota: Para una validación más profunda de los datos obtenidos, véase nuestro anterior informe16.

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Resultados

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Exclusión de contaminantes:

Este protocolo trata de un lavado exhaustivo de una esterilización con tratamiento de antibióticos para minimizar la contaminación y el tardígrado. También implica un proceso de control visual para asegurar la integridad de estos procesos. Una imagen de microscopio en la validación (paso 2.4 del Protocolo) se muestra en la figura 2. Cuando se observa un a...

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Discusión

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La contaminación bacteriana es una amenaza para la secuenciación de organismos microscópicos. Mientras que estudios anteriores sobre la secuenciación del genoma tardigrade han filtrado contaminación empleando métodos de informática amplia12,20, hemos secuenciado el genoma de un solo individuo para minimizar el riesgo de contaminación. Puesto que un tardígrado individual contiene aproximadamente 50-200 pg de ADN genómico16 y es encerrado en...

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Divulgaciones

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Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

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Los autores agradecen a Nozomi Abe Yuki Takai y Nahoko Ishii por su apoyo técnico en la secuencia genomic. Este trabajo fue apoyado por subvenciones de la sociedad japonesa para la promoción de la ciencia (JSPS) investigador KAKENHI subvenciones para jóvenes científicos (No.22681029) y KAKENHI subvenciones para investigación científica (B), no. 17 H 03620 desde las JSP, por un Subvención para proyectos básicos de investigación de ciencia de la Fundación de Sumitomo (No.140340) y en parte por fondos de investigación del gobierno de la Prefectura Yamagata y ciudad de Tsuruoka, Japón. Chlorella vulgaris utilizado para alimentar los tardígrados fue cortesía de Chlorella Industry LTD. Co.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Microscopio SZ61OLYMPUS
BactoAgarLaboratorios Difco214010
Penicilina Estreptomicina (10.000 U/mL)Gibco by life technologies15140-148
VHX-5000 SistemaKeyence
0.2mL Tubo de recubrimiento de siliconaBio Medical ScienceBC-bmb20200
Quick-DNA Kit de micropreparaciónZYMO ResearchD3021El uso de este kit es absolutamente crítico; ver paso 3.1
1.5 mL microtubogreiner bio-one616-201ver 4.1.1
Microcentrífuga refrigerada de alta velocidadTOMYMX-307
Covaris M220Covaris Inc.
Kit ThruPLEX DNA-SeqRubicon GenomicsN.º de cat. R400406El uso de este kit es absolutamente crítico; consulte el paso 4.2
TermocicladorBioer TechnologyTC-96GHbC
AMPure XP reactivoBECKMAN COULTER Ciencias de la VidaA63881
EtanolWako054-027335
EB tampónQIAGEN19086
2200 TapeStationAgilentG2965AA 
D1000 ReactivosAgilent5067-5583
D1000 ScreenTapeAgilent5067-5582
Qubit dsDNA BR Tampón/ReactivoThermoFisher ScientificQ32850
Cubee Mini-CentrífugaRecenttecGenereachR5-AQBD01aqbd
MiSeq 600 ciclo v3Illumina Inc.MS-102-3003
Secuenciador MiSeqIllumina Inc.SY-410-1003
4482277

Referencias

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