Artículo de método

Ultra bajo entrada genoma secuencia biblioteca elaboración de un solo espécimen Tardigrade

DOI:

10.3791/57615

⸱

15 de julio de 2018

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1Institute for Advanced Biosciences, Keio University, 2Systems Biology Program, Graduate School of Media and Governance, Keio University, 3Faculty of Environment and Information Studies, Keio University

En este artículo

Resumen

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Contaminación durante la secuenciación de organismos microscópicos sigue siendo un gran problema. A continuación, os mostramos un método para secuenciar el genoma de un tardígrado de una sola muestra con tan poco como 50 pg de ADN genómico sin amplificación del genoma entero para minimizar el riesgo de contaminación.

Resumen

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Tardígrados son animales microscópicos que entran en un estado ametabólico anhydrobiosis llamados frente a la desecación y puede volver a su estado original cuando se suministra agua. La secuenciación genómica de los animales microscópicos como la contaminación bacteriana de tardígrados riesgos que a veces conduce a interpretaciones erróneas, por ejemplo, en relación con el grado de transferencia horizontal del gene en estos animales. Aquí, ofrecemos un método de entrada ultrabajo para secuenciar el genoma de tardígrado, Hypsibius dujardini, de una sola muestra. Empleando la rigurosa exclusión de lavado y contaminante junto con una extracción eficiente del 50 ~ 200 pg de ADN genómico de una sola persona, construimos una biblioteca ordenada con un instrumento de la secuencia de ADN. Estas bibliotecas fueron altamente reproducible y objetiva, y un análisis de informática de la Lee secuenciado con otros genomas de H. dujardini mostró un mínimo de contaminación. Este método puede aplicarse a unculturable tardígrados que no podrían ser secuenciados utilizando los métodos anteriores.

Introducción

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Tardígrados son animales microscópicos que pueden entrar en un estado ametabólico llamado anhydrobiosis frente a la desecación. Se recuperan por la absorción de agua1,2. En el estado de ametabólica, los tardígrados son capaces de tolerar ambientes extremos distintos, que incluyen temperaturas extremas3 y presiones de4,5, una alta dosis de luz ultravioleta6, rayos x y rayos gamma 7 , 8y9de espacio cósmico. Datos genómicos es....

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Protocolo

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1. preparación

  1. Preparar el gel de agarosa al 2% con agua destilada (DW) como solvente en una placa de cultivo de plástico de 90 mm y 10 mL de un 1% penicilina/estreptomicina cóctel con DW. El gel puede almacenarse durante 2-3 semanas en una incubadora a 18 ° C.
    Nota: Evite cualquier almacenamiento de información de gel por debajo de 10 ° C, para la baja temperatura reducirá el gel de agarosa, resultando en un espacio minúsculo entre el gel y la pared del plato de cultura en la que los tardígrados pueden quedar atrapados.

2. muestra preparación y la exclusión de contaminantes

  1. Recoger un tardígrado sola, coloque s....

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Resultados

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Exclusión de contaminantes:

Este protocolo trata de un lavado exhaustivo de una esterilización con tratamiento de antibióticos para minimizar la contaminación y el tardígrado. También implica un proceso de control visual para asegurar la integridad de estos procesos. Una imagen de microscopio en la validación (paso 2.4 del Protocolo) se muestra en la figura 2. Cuando se observa un a.......

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Discusión

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La contaminación bacteriana es una amenaza para la secuenciación de organismos microscópicos. Mientras que estudios anteriores sobre la secuenciación del genoma tardigrade han filtrado contaminación empleando métodos de informática amplia12,20, hemos secuenciado el genoma de un solo individuo para minimizar el riesgo de contaminación. Puesto que un tardígrado individual contiene aproximadamente 50-200 pg de ADN genómico16 y es encerrado en.......

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Divulgaciones

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Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

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Los autores agradecen a Nozomi Abe Yuki Takai y Nahoko Ishii por su apoyo técnico en la secuencia genomic. Este trabajo fue apoyado por subvenciones de la sociedad japonesa para la promoción de la ciencia (JSPS) investigador KAKENHI subvenciones para jóvenes científicos (No.22681029) y KAKENHI subvenciones para investigación científica (B), no. 17 H 03620 desde las JSP, por un Subvención para proyectos básicos de investigación de ciencia de la Fundación de Sumitomo (No.140340) y en parte por fondos de investigación del gobierno de la Prefectura Yamagata y ciudad de Tsuruoka, Japón. Chlorella vulgaris utilizado para alimentar los tardígrados fue cortesía de Ch....

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Microscopio SZ61OLYMPUS
BactoAgarLaboratorios Difco214010
Penicilina Estreptomicina (10.000 U/mL)Gibco by life technologies15140-148
VHX-5000 SistemaKeyence
0.2mL Tubo de recubrimiento de siliconaBio Medical ScienceBC-bmb20200
Quick-DNA Kit de micropreparaciónZYMO ResearchD3021El uso de este kit es absolutamente crítico; ver paso 3.1
1.5 mL microtubogreiner bio-one616-201ver 4.1.1
Microcentrífuga refrigerada de alta velocidadTOMYMX-307
Covaris M220Covaris Inc.
Kit ThruPLEX DNA-SeqRubicon GenomicsN.º de cat. R400406El uso de este kit es absolutamente crítico; consulte el paso 4.2
TermocicladorBioer TechnologyTC-96GHbC
AMPure XP reactivoBECKMAN COULTER Ciencias de la VidaA63881
EtanolWako054-027335
EB tampónQIAGEN19086
2200 TapeStationAgilentG2965AA 
D1000 ReactivosAgilent5067-5583
D1000 ScreenTapeAgilent5067-5582
Qubit dsDNA BR Tampón/ReactivoThermoFisher ScientificQ32850
Cubee Mini-CentrífugaRecenttecGenereachR5-AQBD01aqbd
MiSeq 600 ciclo v3Illumina Inc.MS-102-3003
Secuenciador MiSeqIllumina Inc.SY-410-1003
4482277

Referencias

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  1. Crowe, J. H., Hoekstra, F. A., Crowe, L. M. Anhydrobiosis. Annual Review of Physiology. 54 (1), 579-599 (1992).
  2. Mobjerg, N., et al. Survival in extreme environments - on the current knowledge of adaptations in tardigrades. Acta Physiologica. 202 (3), 409-420 (2011).
  3. Becquerel, P.

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