Artículo de método

Eficiente generación de páncreas/duodeno Homeobox proteína 1+ progenitores del Foregut pancreática Posterior de hPSCs en las culturas de la adherencia

5.4K vistas

⸱

DOI:

10.3791/57641

⸱

27 de marzo de 2019

 ,  ,  , 
1Center for iPS Cell Research and Application (CiRA), Kyoto University

En este artículo

Resumen

Aquí, presentamos un protocolo detallado para distinguir las células de vástago pluripotent humanas (hPSCs) en la proteína de páncreas/duodeno homeobox 1+ (PDX1+) las células para la generación de linajes pancreáticos basan en el crecimiento de monocapa tipo de Colonia no de disociar las células. Este método es adecuado para producir células derivadas del hPSC homogéneas, manipulación genética y selección.

Resumen

Célula de vástago de pluripotent humanas (hPSC)-derivado de las células pancreáticas son una fuente prometedora de células para la medicina regenerativa y una plataforma para el estudio de procesos de desarrollo humanos. Paso a paso dirigido a la diferenciación que recapitula los procesos de desarrollo es una de las principales formas de generar células pancreáticas incluyendo proteína de páncreas/duodeno homeobox 1+ (PDX1+) células progenitoras pancreáticas. Protocolos convencionales inician la diferenciación con pequeñas colonias poco después del paso. Sin embargo, en el estado de colonias o agregados de células son propensas a heterogeneidades, que podrían dificultar la diferenciación a PDX1+ las células. Aquí, presentamos un protocolo detallado para distinguir hPSCs en PDX1+ las células. El protocolo consta de cuatro pasos e inicia la diferenciación de células disociadas siembra. La inducción de SOX17+ las células del endodermo definitivo fue seguida por la expresión de marcadores de tubo de intestino primitivo dos, HNF1β y HNF4α y eventual diferenciación en PDX1+ las células. El presente Protocolo proporciona fácil manejo y puede mejorar y estabilizar la eficiencia de la diferenciación de algunas líneas de hPSC que previamente fueron encontrados ineficazmente diferenciarse en linajes endodérmicos o PDX1+ las células.

Introducción

El páncreas principalmente consiste en las células exocrinas y endocrinas, y su disfunción o sobrecarga causa varias enfermedades, como la pancreatitis, diabetes y cáncer de páncreas. Para aclarar la patogenia de la pancreatopathy, es necesario analizar el proceso de desarrollo y la función de las células pancreáticas. Además, una fuente estable de la célula con sólida calidad es necesaria para establecer la terapia de suplementación de tejido de la célula. Célula de vástago de pluripotent humanas (hPSC)-derivado de las células pancreáticas son una fuente prometedora de células para estos fines, y el protocolo de diferenciación hacia células pancreáticas ha sido intensamente estudiado1,2,3, 4. Los recientes avances en la generación in vitro de las células β pancreáticas mímico la generación de las células β en adultos humanos y estas células Mostrar eficacia terapéutica sobre implante en modelo diabético ratones2,3. Además, el análisis de las células β generados a partir de las células madre pluripotentes inducidas (iPSCs) saludable los donantes paciente de diabetes tipo 1 no reveló ninguna diferencia funcional incluyendo cuando está bajo estrés5. Por otra parte, fenotipos de la enfermedad han sido parcialmente reproducidos en células pancreáticas inducidas con iPSCs derivados del paciente o hPSCs que las mutaciones genéticas en el mismo sitio que los pacientes6,7.

Para generar células pancreáticas de hPSCs, se utiliza la diferenciación dirigida paso a paso que recapitula los procesos de desarrollo. El páncreas se deriva de la capa del endodermo del embrión temprano, que expresa el sexo determina la región Y-caja 17 (SOX17) y forkhead cuadro A2 (FOXA2)8. Basado en los estudios con ratones, la capa endodermal forma el tubo intestino primitivo, que se caracteriza por la expresión de hepatocitos factor nuclear 1-beta (Hnf1β) y el factor nuclear de hepatocito 4-alfa (Hnf4α). El tubo intestino primitivo se alarga y se convierte en el aparato respiratorio, tracto digestivo y órganos. Después de la elongación, el área posterior del foregut se convierte la presunta región pancreática, y marcada por la expresión de la proteína del factor transcripcional páncreas/duodeno homeobox 1 (PDX1)8,9,10. Las partes dorsales y ventrales de la PDX1+ tubo intestinal espesar a brotes pancreáticos forma, que se caracterizan por la coexpresión de páncreas transcripción factor 1 subunidad alfa (PTF1A) y NK6 homeobox 1 (NKX6.1)8,11. Esta expresión marca el comienzo morfológico de la organogénesis pancreática. Las células del páncreas endodermo, que son componentes de las yemas pancreáticas, forman una red tubular ramificada de estructuras epiteliales12 y finalmente se diferencian en células exocrinas y endocrinas, incluyendo β-células secretoras de insulina y α-células secretoras de glucagón. Expresión de PDX1 se detecta primero en la región pancreática presuntiva, que luego se observa a lo largo de todo el desarrollo pancreático y muestra localización de las células β y δ9,13,14. Aunque el Pdx1+ área de células que no expresan Ptf1a o Nkx6.1 distingue en el antro gástrico, duodeno, vía biliar extrahepática y algunas células intestinales en el centro a la última etapa de desarrollo en ratones9, PDX1+ las células son consideradas los progenitores del páncreas en la primera etapa del desarrollo en seres humanos.

Aquí, presentamos un protocolo detallado para distinguir hPSCs en PDX1+ de las células para la generación de linajes pancreáticos. El protocolo inicia la diferenciación por la siembra disocia las células15,16,17. En general, hPSCs indiferenciadas se mantienen como colonias o agregados de células en suspensión o en la adhesión. Como resultado, la mayoría de protocolos inician la diferenciación poco después pases. Sin embargo, en el estado de colonias o agregados de células son propensas a heterogeneidades espaciales y transcripcional18,19,20,21,22, que podrían dificultar la primer paso de diferenciación hacia endodermo definitivo seguido por ineficiente diferenciación PDX1+ las células. El presente Protocolo puede ofrecer un manejo fácil para mejorar y estabilizar la eficiencia de la diferenciación de algunas líneas de hPSC que previamente fueron encontrados para distinguir ineficazmente a linajes endodérmicos y PDX1+ células23, 24 , 25.

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Protocolo

Experimentos con hPSCs fueron aprobados por el Comité de ética del Departamento de medicina y postgrado Facultad de medicina, Universidad de Kyoto.

1. preparación de materiales

Nota: Preparar todos los medios y reactivos para cultivo celular en un ambiente estéril. Calentamiento de base medios de cultivo a temperatura ambiente (RT) antes de su uso. Medio para la diferenciación se utiliza dentro de 6 h a RT. información de los reactivos se enumeran en la Tabla de materiales.

  1. Diferenciación (figura 1A)
    1. Medio de 1A etapa: transferencia de Medio RPMI 1640 en un tubo con una pipeta. Añadir el suplemento libre de suero, activin A, CHIR99021 y Y-27632 a una concentración de 1 x, 100 ng/mL, 3 μM y 10 μM, respectivamente.
    2. Medio de fase 1B: transferencia de Medio RPMI 1640 en un tubo con una pipeta. Añadir el suplemento libre de suero, activina A y CHIR99021 a una concentración de 1 x, 100 ng/mL, ≤ 1 μM, respectivamente.
      Nota: La concentración de CHIR99021 debe ser menor que en medio de 1A etapa y además no es necesario, pero aumenta el número de celular.
    3. Medio de la etapa 2: medio MEM de transferencia mejorado (iMEM) en un tubo con una pipeta. Añadir el suplemento libre de suero y factor de crecimiento de queratinocitos (KGF) a una concentración de 0,5 x y 50 ng/mL, respectivamente.
    4. Medio de la etapa 3: transferencia del iMEM medio en un tubo con una pipeta. Añadir el suplemento libre de suero, KGF, NOGGIN, 3-ceto-N-aminoetil-N'- aminocaproyldihydrocinnamoyl cyclopamine (CYC) y ácido 4-[(E)-2-(5,6,7,8-Tetrahydro-5,5,8,8-tetramethyl-2-naphthalenyl)-1-propenyl]-benzoic (TTNPB) con una pipeta para concentraciones de 0, 5 x, 50 ng/mL, 100 ng/mL, 0.5 μM y 10 nM, respectivamente.
  2. Citometría de flujo (FCM)
    1. 1 x buffer de permeabilización/lavado: transferencia de agua en un tubo con una pipeta. Añadir el tampón de lavado/permeabilización por una pipeta a una concentración de 1 x.
    2. Solución de bloqueo de la FCM: transfiera 1 x buffer de permeabilización/lavado en un tubo con una pipeta. Añadir suero de burro por una pipeta a una concentración del 2% (vol/vol).
  3. Inmunotinción
    1. Solución de bloqueo: salina (Phosphate-Buffered de DPBS de transferencia Dulbecco) en un tubo con una pipeta. Agregar suero de burro y Triton X pipeta a concentraciones de 5% (vol/vol) y 0.4% (vol/vol), respectivamente.

2. hPSC diferenciación Posterior del Foregut pancreática células progenitores (PDX1 células+ )

Nota: Llevar a cabo todos los procedimientos con técnicas estériles. hPSCs se mantienen en placas de 6 pocillos recubiertas por una superficie sintética para hPSCs con medio de mantenimiento hPSC según las instrucciones17,26 el fabricante. Cuando las células llegan a 50-80% de confluencia (etapa 0) utiliza para la diferenciación.

  1. Preparar la membrana del sótano las placas revestidas de matriz.
    1. Transferencia de 6 mL de RPMI 1640 (4 °C) en un tubo refrigerado a 4 °C en hielo. Añadir 2 mg de la matriz de la membrana del sótano (4 °C) con refrigerado 1 mL-Pipetas y mezclar bien mediante pipeteo suave para hacer la matriz de la membrana del sótano de 0,33 mg/mL.
    2. Transfiera 2 mL de la matriz de la membrana del sótano diluido en cada pocillo de las placas de cultivo celular 6-bien por una pipeta. Colocar las placas a 37 °C durante 60-90 minutos en una incubadora. Después, no las placas a temperatura ambiente hasta su uso (dentro de 3 h).
  2. La hPSCs de la semilla e iniciar la diferenciación al endodermo definitivo (Fase 1A).
    1. Aspire el medio utilizado y añadir 2 mL de ácido etilendiaminotetracético de 0,5 mM (EDTA) (RT) por pozo con una pipeta para lavar la hPSCs cultivadas en placas de 6 pozos.
    2. Aspirar 0,5 mM EDTA y añadir 2 mL de EDTA 0.5m por pozo con una pipeta. Incubar las placas a 37 °C durante 5 minutos.
    3. Aspirar 0,5 mM EDTA y añadir 1 mL de medio de mantenimiento hPSC en RT suplementado con 10 μM Y-27632 por pozo con una pipeta. Pipetee suavemente pero rápidamente a golpe Unidas células en las placas y disociar las células agrupadas en celdas individuales. No la burbuja de la suspensión de células durante el pipeteo.
    4. Transferir la suspensión de células en un tubo de centrífuga de 50 mL que contiene 4 mL de medio de mantenimiento hPSC a RT suplementado con 10 μM Y-27632. Pipetee suavemente la suspensión de células.
    5. Contar el número de células en la suspensión de células mediante el procedimiento de exclusión de tinción de azul de tripano.
      1. Mix 15 μL de suspensión celular y 15 μL de azul tripán en un tubo.
      2. Transferir 10 μL de la suspensión de células diluida con azul de tripano en celda contando los portaobjetos en duplicado por una pipeta de 10 μL.
      3. Cuenta la celda número con un contador celular automático y calcular la densidad de células en la suspensión de células. Viabilidad es generalmente > 98%.
    6. Parte alícuota de la suspensión de células en un tubo de centrífuga de 50 mL en 1-1.5 x 106 células por pocillo de las placas de 6 pozos (1-1.5 x 105 células/cm2).
    7. Centrifugar el tubo de 50 mL a 200 x g a temperatura ambiente durante 5 minutos.
    8. Aspirar el sobrenadante con una pipeta y resuspender las células con 1 mL de medio de 1A etapa (RT) por pozo. Pipetear la suspensión de células y añadir otro 1 mL de medio de 1A etapa (total, 2 mL por pozo).
    9. Aspirar la matriz membrana basal diluida en los pocillos de las placas de cultivo celular preparados en el paso 2.1.2 por pipeta 1.000 μL. Proceder inmediatamente al siguiente paso.
    10. Suavemente pipetear la suspensión de células en el paso 2.2.8 otra vez. Inmediatamente después de mezclar, transfiera la suspensión de células (2 mL) en cada pocillo de una placa de 6 pozos. Cubra la placa con un papel de aluminio para proteger la placa de la luz. Colocar la placa en el Banco limpio a temperatura ambiente durante 10-15 minutos.
      Nota: No mueva la placa después de la siembra.
    11. Coloque suavemente la placa a 37 °C, 5% CO2 incubadora (ambiente humidificado) y la cultura durante 24 h.
      Nota: No agitar la placa después de la siembra.
  3. Inducir la diferenciación en endodermo definitivo (etapa 1B).
    1. Aspire el medio utilizado y añadir 2 mL de DPBS los pozos con una pipeta. Repetir la aspiración y la adición de DPBS una vez.
      Nota: Para eliminar las células muertas de la monocapa, agitar suavemente la placa antes de cada aspiración.
    2. Aspire la DPBS usado por una pipeta y añadir 4 mL de medio de la 1B de la etapa (37 °C) por pozo. Coloque suavemente la placa en la incubadora de 37 °C (ambiente humidificado de 5% CO2) y la cultura durante 48 h.
    3. Aspire el medio utilizado y añadir 2 mL de DPBS al pozo con una pipeta. Repetir la aspiración y la adición de DPBS una vez.
      Nota: Retire las células muertas de la monocapa por agitación suave antes de cada aspiración.
    4. Aspire la DPBS usado por pipeta y añadir 4 mL de medio de la 1B de la etapa (37 °C) por pozo. Coloque suavemente la placa en la incubadora (37 °C, atmósfera humidificada de 5% CO2) y la cultura durante 24 h.
  4. Inducir la diferenciación en el tubo del intestino primitivo (etapa 2).
    1. Aspire el medio utilizado y añadir 2 mL de DPBS al pozo con una pipeta.
      Nota: Retire las células muertas de la capa monomolecular agitando suavemente antes de cada aspiración.
    2. Aspire la DPBS usado por pipeta y añadir 4 mL de medio de etapa 2 (37 °C) por pozo. Coloque la placa en la incubadora (37 °C, atmósfera humidificada de 5% CO2) y la cultura durante 4 días.
  5. Inducir la diferenciación en PDX1+ las células (fase 3).
    1. Aspire el medio utilizado y añadir 2 mL de DPBS al pozo con una pipeta. Repetir la aspiración y la adición de DPBS una vez.
    2. Aspire la DPBS usado por pipeta y añadir 4 mL de medio de etapa 3 (37 °C) por pozo. Coloque la placa en la incubadora (37 °C, atmósfera humidificada de 5% CO2) y la cultura durante 3 días.
  6. Inducir la diferenciación en las células endocrinas pancreáticas.
    1. Realizar la inducción celular NKX6.1+ (etapa 4, durante 8 días) seguida por la inducción de células endocrinas (etapa 5, durante 12 días) con protocolos previamente descritos3,16,26. Caracterizar y validar la diferenciación de las células endocrinas por inmunotinción y análisis de (qRT-PCR) reacción en cadena de polimerasa de transcripción inversa en tiempo real cuantitativa.
      Nota: Se refieren a Toyoda et al16 y Kimura et al26 para los procedimientos experimentales detallados. Consulte la tabla 1 para secuencias de la cartilla utilizadas para el análisis de qRT-PCR.

3. flujo Cytometry (FCM)

  1. Aspire el medio utilizado y añadir 2 mL de EDTA 0,5 mM para el pozo con una pipeta. Repetir la aspiración y la adición de EDTA 0,5 mM una vez.
    Nota: Agitar la placa suavemente para eliminar las células muertas de las células de la monocapa antes de cada aspiración.
  2. Para disociar las células (aproximadamente 3-6 × 106 células por pocillo), agregar 2 mL del 0.25% tripsina que contiene 0,5 mM EDTA por pozo. Incubar las placas a 37 °C durante 5-10 minutos.
  3. Pipetee suavemente pero rápidamente para disociar las células agrupadas en celdas individuales. No la burbuja de la suspensión de células durante el pipeteo.
  4. Añadir 8-10 mL de medio base (RPMI 1640 o iMEM, RT) que contiene 0,5 x suplemento libre de suero y 10 μM Y-27632 por bien y mezclar la suspensión de células. Transferir la suspensión de células en un tubo de centrífuga.
  5. Centrifugar el tubo a 300 x g a temperatura ambiente durante 5 minutos.
  6. Aspirar el sobrenadante y resuspender las células con 2 mL de EDTA (RT) de 0,5 mM. Pipetee suavemente la suspensión de células.
  7. Centrifugar el tubo a 300 x g a temperatura ambiente durante 5 minutos.
  8. Aspirar el sobrenadante y resuspender las células con 100 μL de tampón de fijación y permeabilización por 106 células bajo una campana. Pipetee suavemente la suspensión de células debajo de una campana. Mantenga el tubo a temperatura ambiente durante 30 minutos.
  9. Centrifugar el tubo a 400 x g a temperatura ambiente durante 5 minutos.
  10. Aspirar el sobrenadante bajo una campana y resuspender las células con solución de bloqueo de la FCM de μL 500 por 106 células. Pipetee suavemente la suspensión de células. Mantenga el tubo a temperatura ambiente durante 30 minutos.
  11. Transferir 50 μL de la suspensión de células a un tubo (aproximadamente 1 x 105 células). Centrifugar el tubo a 400 x g a temperatura ambiente durante 5 minutos Retire el sobrenadante y resuspender las células con 100 μL de anticuerpo primario diluido (véase Tabla de materiales) en FCM bloqueo solución e incubar a 4 °C para > 16 h.
  12. Centrifugar el tubo a 400 x g a temperatura ambiente por 5 minutos quite el sobrenadante y resuspender las células con 180 μL de 1 x de tampón de lavado/Perm.
  13. Centrifugar el tubo a 400 x g a temperatura ambiente durante 5 minutos Retire el sobrenadante y resuspender las células con 100 μL del anticuerpo secundario diluido (véase Tabla de materiales) en solución de bloqueo de la FCM. Incube las células a temperatura ambiente durante 60 minutos o a 4 °C por > 16 h con la protección de la luz.
  14. Centrifugar el tubo a 400 x g a temperatura ambiente por 5 minutos quite el sobrenadante y resuspender las células con 180 μL de 1 x de tampón de lavado/Perm.
  15. Centrifugar el tubo a 400 x g a temperatura ambiente por 5 minutos Retire el sobrenadante y resuspender las células con 180 μL de 2% de suero de burro en DPBS.
  16. Filtrar la suspensión de células mediante la transferencia en 5 mL tubo de poliestireno fondo redondo con una célula tamiz (malla de nylon de 35 μm) y guardar a 4 °C con protección de la luz hasta el análisis.
  17. Análisis de una proporción de células teñidas positivamente por un citómetro de flujo27.

4. inmunotinción

  1. Aspire el medio utilizado y añadir 2 mL de DPBS al pozo con una pipeta. Repetir la aspiración y la adición de DPBS una vez.
    Nota: Agitar suavemente la placa para eliminar las células muertas de las células de la monocapa antes de cada aspiración.
  2. Añadir 2 mL de paraformaldehído al 4% (PFA) (4 °C) por pozo con una pipeta debajo de una campana. Mantenga la placa a 4 °C por 20 min.
  3. Quite la PFA pipeta bajo una campana. Añadir 2 mL de DPBS en RT al pozo con una pipeta debajo de una campana. Repetir la aspiración y la adición de DPBS una vez.
  4. Añadir 2 mL de solución de bloqueo por bien y mantenga la placa a temperatura ambiente durante 30 minutos.
  5. Aspirar la solución y añadir 1 mL de anticuerpo primario (véase Tabla de materiales) en solución por pozo de bloqueo. Incubar a temperatura ambiente durante 60 minutos o a 4 °C por > 16 h.
  6. Aspirar la solución, añadir 2 mL de DPBS que contenga 0,4% Tritón X-100 e incubar a temperatura ambiente durante 10 minutos repetir la aspiración, además de la solución y la incubación una vez.
  7. Aspirar la solución y añadir 1 mL de anticuerpo secundario (véase Tabla de materiales) en solución por pozo de bloqueo. Incubar a temperatura ambiente durante 60 minutos con protección de la luz.
  8. Aspirar la solución, añadir 2 mL de DPBS que contenga 0,4% Tritón X-100 (RT) e incubar a temperatura ambiente durante 5 minutos con protección de la luz. Repetir la aspiración, además de la solución e incubación dos veces.
  9. Tomar micrografías para examinar la eficacia de diferenciación bajo un microscopio de fluorescencia28.

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Resultados

Propagación hiPSCs (585A129,30) se condensan y forman una monocapa homogénea (figura 1B) que es conveniente para la diferenciación. HiPSCs indiferenciados (etapa 0) son disociados y volver a sembrar como células individuales en densidades bajas de la célula (1-1.5 x 105 células/cm2). Dentro de 1 h, las células se unen a la placa y comiencen a mostrar protrusión. El día 1, las células proliferan y bien distribuid...

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Discusión

La generación de PDX1+ células se compone de varios pasos; por lo tanto, es fundamental para el tratamiento de las células en el momento adecuado. Entre las medidas, la eficacia de la inducción del endodermo definitivo afecta en gran medida la eficacia de la inducción final, posiblemente por interferencia de otras células contaminantes linaje (es decir, mesodermo y ectodermo), que pueden proliferar o secretar factores interrumpir la diferenciación específica. Si la proporción de SOX17+ las células e...

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Este trabajo fue apoyado en parte por fondos de la sociedad japonesa para la promoción de la ciencia (JSP) a través de Scientific Research (C) (JSP KAKENHI Grant Number15K09385 y 18 K 08510) T.T. y subvenciones para investigadores de JSP (JSP KAKENHI número 17J07622) A.K., y la Agencia de Japón para la investigación médica y desarrollo (AMED) a través de su investigación conceder "Centro base para iPS red de centro de investigación para la realización de la medicina regenerativa, investigación con células" a K.O. Los autores agradecen a Dr. Peter Karagiannis por leer el manuscrito.

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
3-Keto-N-aminoetil-N′-aminocaproildihidrocinamoil ciclopaminaToronto Research ChemicalsK171000CYC
4-[(E)-2-(5,6,7,8-tetrahidro-5,5,8,8-tetrametil-2-naftalenil)-1-propenil]-benzoicoSanta Cruz BiotechnologySC-203303TTNPB
50 mL Tubos de centrífuga de polipropileno estériles cónicosThermo Fisher Scientific339652
Anticuerpo anti-CDX2 [EPR2764Y]AbcamAb76541Anti-CDX2, &veces; 1/1000 dilución
B-27 Suplemento (50 &veces;)Thermo Fisher Scientific17504-044Suplemento sin suero
BD FACSAria II Clasificadorde células BD BiosciencesPara citometría de flujo
Congelador biomédicoSANYOMDF-U538Para -30 ° C
Almacenamiento Portaobjetos de recuento de células para TC10/TC20 Contador de células, de doble cámaraBIO-RAD1450011portaobjetos de recuento
de vidrio PLACA MULTIPOCILLO PARA CULTIVO CELULAR, 6 POCILLOS, PS, TransparenteGreiner Bio-One657165Para cultivo de diferenciación/placa de 6 pocillos
centrífugaTOMY AX-310Para cultivo celular
CentrífugaTOMYMX-305Para RT-qPCR
CHIR99021Axon MedchemAxon 1386
BANCO LIMPIOSHOWA KAGAKU S-1601PRVBanco limpio
Corning CellBIND Placa de 6 pocillosCorning3335Para el cultivo sin alimentador de hPSCs/placa de 6 pocillos
Corning Matrigel Membrana Basal Factor de Crecimiento Factor de Crecimiento ReducidoCorning354230Matriz de membrana basal
Corning Synthemax II-SCSustrato Corning3535Para el cultivo sin alimentador de hPSCs/material de superficie sintético para hPSCs
CriostatoLeicaLeica CM1510 SPara inmunotinción de agregados.
Cytofix/Cytoperm KitBecton Dickinson554714tampón de permanente/lavado es  Tampón de permeabilización/lavado. El tampón Cytofix/Cytoperm es un tampón de fijación y permeabilización.
Bolígrafo DakoDako S2002Para la inmunotinción de agregados
Mezcla dNTP (10 mM)Thermo Fisher Scientific18427-088Para RT-qPCR
Anticuerpo secundario de adsorción cruzada Donkey anti-Goat IgG (H+L), Alexa Fluor 488Thermo Fisher ScientificA11055Anticuerpo secundario, &veces; dilución 1/500
Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Anticuerpo secundario altamente adsorbido cruzado, Alexa Fluor 546Thermo Fisher ScientificA10036Anticuerpo secundario, &veces; dilución 1/500 Donkey
anti-Rabbit IgG (H+L) Anticuerpo secundario altamente adsorbido cruzado, Alexa Fluor 546Thermo Fisher ScientificA10040Anticuerpo secundario, y veces; dilución 1/500 Suero
burroMerck MilliporeS30Suero de burro
D-PBS(-) sin Ca o MgNacalai tesque14249-95DPBS
Essential 8 MediumThermo Fisher ScientificA1517001Para el cultivo sin alimentador de hPSCs/medio de mantenimiento hPSC
Falcon 5 mL Tubo de ensayo de poliestireno de fondo redondo, con filtro de celdas Tapón a presiónCorning3522355 mL tubo de poliestireno de fondo redondo con filtro de celdas
Punta de filtro, 1,000 y micro; LWatoson124-1000SÚselo junto con pipetas
Punta de filtro, 20 y micro; LWatoson124-P20SÚselo junto con pipetas
Punta de filtro, 200 y micro; LWatoson124-P200SÚselo junto con pipetas
Microscopio de fluorescenciaKeyenceBZ-X700para inmunotinción
Forma Steri-Cycle Incubadora de CO2Thermo Fisher Scientific370AIncubadora
HNF-1β Anticuerpo (C-20)Santa Cruz Biotechnologysc-7411Anti-HNF1β, &veces; dilución 1/200
HNF-4&alfa; Anticuerpo (H-171)Santa Cruz Biotechnologysc-8987Anti-HNF4α, &veces; dilución 1/200
Hoechst 33342Thermo Fisher ScientificH3570Para tinción de núcleos, &veces; dilución 1/200
Páncreas humano ARN totalAmbionAM7954para RT-qPCR
Anticuerpo humano PDX-1/IPF1 R& D SystemsAF2419Anti-PDX1, IgG de cabra, × dilución 1/200
Anticuerpo SOX17 humanoR& D SystemsAF1924Anti-SOX17, &veces; dilución 1/200
MEM mejorado Opción de zinc medioThermo Fisher Scientific10373-017iMEM
Cámara de incubaciónCosmo Bio10DOPara la inmunotinción de agregados Guantes de
examen de látexAdachi
Vidrio deslizante recubierto MASMatsunami Glass83-1881Para inmunotinción de agregados
MicroAmp Fast placa de reacción de 96 pocillosApplied Biosystems/Thermo Fisher Scientific4346907para RT-qPCR
MicroscopioOlympusCKX41N-31PHPPara cultivo celular
MicrotuboWatoson131-515CS
Monoclonal Anti-&alfa;-FetoproteínaSIGMAA8452Anti-AFP, &veces; dilución 1/200
Nanodrop 8000Thermo Fisher Scientificpara RT-qPCR
Oligo dTFASMACOligo hecho a medida  Para RT-qPCR de la secuencia es "TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT"
Paraformaldehído, polvoNacalai tesque26126-54PFA, fijador, diluido en DPBS
Refrigerador farmacéuticoSANYOMPR-514Para 4 & deg; C almacenamiento
PIPETMAN P GILSONPipeta
Humana Recombinante KGF/FGF-7R& D Systems251-KGKGF
Recombinante Humano NogginPeproTech120-10CNOGGIN
Recombinante Humano/Ratón/Rata Activina AR& D Systems338-ACActivin A
ReverTra Ace (100 U/μ L)TOYOBOTRT-101para RT-qPCR
Juego de DNasa libre de RNasa (50)QIAGEN79254Para RT-qPCR
RNeasy Mini KitQIAGEN74104para RT-qPCR
RPMI 1640 con L-GlnNacalai tesque30264-85RPMI 1640
Película de sellado para tiempo realTakaraNJ500para RT-qPCR
Pipetas serológicas 10 mLCostar/Corning4488Para el cultivo celular
Pipetas serológicas 25 mLCostar/Corning4489Para el cultivo celular
Pipetas serológicas 5 mLCostar/Corning4487Para el cultivo celular
Sox2 (D6D9) XP Rabbit mAbSeñalización celular3579SAnti-SOX2, y dilución 1/200
StepOnePlusApplied Biosystems/Thermo Fisher CientíficoPara RT-qPCR
SacarosaNacalai tesque30406-25Para la inmunotinción de agregados
TB Green
Premix Ex Taq II 		TakaraRR820Bpara RT-qPCR
TC20 Contador de células automatizadoBIO-RAD1450101J1Contador de células automático
Compuesto Tissue-Tek OCT 4583 Sakura Finetechnical4583Para la inmunotinción de agregados
Tissue-Tek Cryomold Moldes/AdaptadoresSakura Finetechnical4566Para la inmunotinción de agregados
Triton X-100Nacalai tesque35501-15
Trypan BlueBIO-RAD1450021
Congelador ultrafríoSANYOMDF-U33VPara -80 ° C almacenamiento
UltraPure 0,5M EDTA, pH 8,0Thermo Fisher Scientific15575-038Diluir con DPBS para preparar 0,5 mM EDTA
Veriti TermocicladorApplied Biosystems/Thermo Fisher Scientificpara RT-qPCR
Y-27632Wako251-00514
de

Referencias

  1. D'Amour, K. A., et al. Production of pancreatic hormone-expressing endocrine cells from human embryonic stem cells. Nature Biotechnology. 24 (11), 1392-1401 (2006).
  2. Pagliuca, F. W., et al. Generation of functional human pancreatic beta cells in vitro. Cell. 159 (2), 428-439 (2014).
  3. Rezania, A., et al. Reversal of diabetes with insulin-producing cells derived in vitro from human pluripotent stem cells. Nature Biotechnology. 32 (11), 1121-1133 (2014).
  4. Kondo, Y., Toyoda, T., Inagaki, N., Osafune, K. iPSC technology-based regenerative therapy for diabetes. Journal of Diabetes Investigation. 9 (2), 234-243 (2017).
  5. Millman, J. R., et al. Generation of stem cell-derived beta-cells from patients with type 1 diabetes. Nature Communications. 7, 11463(2016).
  6. Zeng, H., et al. An Isogenic Human ESC Platform for Functional Evaluation of Genome-wide-Association-Study-Identified Diabetes Genes and Drug Discovery. Cell Stem Cell. 19 (3), 326-340 (2016).
  7. Hosokawa, Y., et al. Insulin-producing cells derived from 'induced pluripotent stem cells' of patients with fulminant type 1 diabetes: Vulnerability to cytokine insults and increased expression of apoptosis-related genes. Journal of Diabetes Investigation. , (2017).
  8. Jennings, R. E., et al. Development of the human pancreas from foregut to endocrine commitment. Diabetes. 62 (10), 3514-3522 (2013).
  9. Jorgensen, M. C., et al. An illustrated review of early pancreas development in the mouse. Endocrine Reviews. 28 (6), 685-705 (2007).
  10. Jensen, J. Gene regulatory factors in pancreatic development. Developmental Dynamics. 229 (1), 176-200 (2004).
  11. Hald, J., et al. Generation and characterization of Ptf1a antiserum and localization of Ptf1a in relation to Nkx6.1 and Pdx1 during the earliest stages of mouse pancreas development. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 56 (6), 587-595 (2008).
  12. Villasenor, A., Chong, D. C., Henkemeyer, M., Cleaver, O. Epithelial dynamics of pancreatic branching morphogenesis. Development. 137 (24), 4295-4305 (2010).
  13. Serup, P., et al. The homeodomain protein IPF-1/STF-1 is expressed in a subset of islet cells and promotes rat insulin 1 gene expression dependent on an intact E1 helix-loop-helix factor binding site. Biochemical Journal. 310 (Pt 3), 997-1003 (1995).
  14. Riedel, M. J., et al. Immunohistochemical characterisation of cells co-producing insulin and glucagon in the developing human pancreas. Diabetologia. 55 (2), 372-381 (2012).
  15. Mae, S. I., et al. Monitoring and robust induction of nephrogenic intermediate mesoderm from human pluripotent stem cells. Nature Communications. 4, 1367(2013).
  16. Toyoda, T., et al. Cell aggregation optimizes the differentiation of human ESCs and iPSCs into pancreatic bud-like progenitor cells. Stem Cell Research. 14 (2), 185-197 (2015).
  17. Toyoda, T., et al. Rho-Associated Kinases and Non-muscle Myosin IIs Inhibit the Differentiation of Human iPSCs to Pancreatic Endoderm. Stem Cell Reports. 9 (2), 419-428 (2017).
  18. Chen, K. G., Mallon, B. S., McKay, R. D., Robey, P. G. Human pluripotent stem cell culture: considerations for maintenance, expansion, and therapeutics. Cell Stem Cell. 14 (1), 13-26 (2014).
  19. Bauwens, C. L., et al. Control of human embryonic stem cell colony and aggregate size heterogeneity influences differentiation trajectories. Stem Cells. 26 (9), 2300-2310 (2008).
  20. Nguyen, Q. H., et al. Single-cell RNA-seq of human induced pluripotent stem cells reveals cellular heterogeneity and cell state transitions between subpopulations. Genome Research. 28 (7), 1053-1066 (2018).
  21. Narsinh, K. H., et al. Single cell transcriptional profiling reveals heterogeneity of human induced pluripotent stem cells. Journal of Clinical Investigation. 121 (3), 1217-1221 (2011).
  22. Rosowski, K. A., Mertz, A. F., Norcross, S., Dufresne, E. R., Horsley, V. Edges of human embryonic stem cell colonies display distinct mechanical properties and differentiation potential. Scientific Reports. 5, 14218(2015).
  23. Torres-Padilla, M. E., Chambers, I. Transcription factor heterogeneity in pluripotent stem cells: a stochastic advantage. Development. 141 (11), 2173-2181 (2014).
  24. Cahan, P., Daley, G. Q. Origins and implications of pluripotent stem cell variability and heterogeneity. Nature Reviews Molecular and Cell Biology. 14 (6), 357-368 (2013).
  25. Chetty, S., et al. A simple tool to improve pluripotent stem cell differentiation. Nature Methods. 10 (6), 553-556 (2013).
  26. Kimura, A., et al. Small molecule AT7867 proliferates PDX1-expressing pancreatic progenitor cells derived from human pluripotent stem cells. Stem Cell Research. 24, 61-68 (2017).
  27. Bhattacharya, S., et al. High efficiency differentiation of human pluripotent stem cells to cardiomyocytes and characterization by flow cytometry. Journal of Visualized Experiments. (91), e52010(2014).
  28. Honvo-Houeto, E., Truchet, S. Indirect Immunofluorescence on Frozen Sections of Mouse Mammary Gland. Journal of Visualized Experiments. (106), (2015).
  29. Okita, K., et al. A more efficient method to generate integration-free human iPS cells. Nature Methods. 8 (5), 409-412 (2011).
  30. Kajiwara, M., et al. Donor-dependent variations in hepatic differentiation from human-induced pluripotent stem cells. Proceedings of the National Academy of Science U S A. 109 (31), 12538-12543 (2012).
  31. Kikuchi, T., et al. Human iPS cell-derived dopaminergic neurons function in a primate Parkinson's disease model. Nature. 548 (7669), 592-596 (2017).
  32. Suemori, H., et al. Efficient establishment of human embryonic stem cell lines and long-term maintenance with stable karyotype by enzymatic bulk passage. Biochemical and Biophysical Research Communication. 345 (3), 926-932 (2006).
  33. Gage, B. K., Webber, T. D., Kieffer, T. J. Initial cell seeding density influences pancreatic endocrine development during in vitro differentiation of human embryonic stem cells. PLoS One. 8 (12), e82076(2013).
  34. Nostro, M. C., et al. Efficient generation of NKX6-1+ pancreatic progenitors from multiple human pluripotent stem cell lines. Stem Cell Reports. 4 (4), 591-604 (2015).
  35. Jonsson, J., Carlsson, L., Edlund, T., Edlund, H. Insulin-promoter-factor 1 is required for pancreas development in mice. Nature. 371 (6498), 606-609 (1994).
  36. Kelly, O. G., et al. Cell-surface markers for the isolation of pancreatic cell types derived from human embryonic stem cells. Nature Biotechnology. 29 (8), 750-756 (2011).
  37. Hohwieler, M., et al. Human pluripotent stem cell-derived acinar/ductal organoids generate human pancreas upon orthotopic transplantation and allow disease modelling. Gut. 66 (3), 473-486 (2017).
  38. Takeuchi, H., Nakatsuji, N., Suemori, H. Endodermal differentiation of human pluripotent stem cells to insulin-producing cells in 3D culture. Scientific Reports. 4, 4488(2014).

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Reimpresiones y permisos

Solicitar permiso para reutilizar el texto o las figuras de este artículo de JoVE

Solicitar permiso

Etiquetas

C lulas PDX1 positivasdiferenciaci n de hPSCendodermo definitivofracci n vascular estromalcitometr a de flujoWestern blotmicroscop a confocalaislamiento celulardigesti n de tejidosc lulas progenitoras

Artículos relacionados