Aquí, presentamos un protocolo detallado para distinguir las células de vástago pluripotent humanas (hPSCs) en la proteína de páncreas/duodeno homeobox 1+ (PDX1+) las células para la generación de linajes pancreáticos basan en el crecimiento de monocapa tipo de Colonia no de disociar las células. Este método es adecuado para producir células derivadas del hPSC homogéneas, manipulación genética y selección.
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Artículo de método
Eficiente generación de páncreas/duodeno Homeobox proteína 1+ progenitores del Foregut pancreática Posterior de hPSCs en las culturas de la adherencia
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Resumen
Resumen
Célula de vástago de pluripotent humanas (hPSC)-derivado de las células pancreáticas son una fuente prometedora de células para la medicina regenerativa y una plataforma para el estudio de procesos de desarrollo humanos. Paso a paso dirigido a la diferenciación que recapitula los procesos de desarrollo es una de las principales formas de generar células pancreáticas incluyendo proteína de páncreas/duodeno homeobox 1+ (PDX1+) células progenitoras pancreáticas. Protocolos convencionales inician la diferenciación con pequeñas colonias poco después del paso. Sin embargo, en el estado de colonias o agregados de células son propensas a heterogeneidades, que podrían dificultar la diferenciación a PDX1+ las células. Aquí, presentamos un protocolo detallado para distinguir hPSCs en PDX1+ las células. El protocolo consta de cuatro pasos e inicia la diferenciación de células disociadas siembra. La inducción de SOX17+ las células del endodermo definitivo fue seguida por la expresión de marcadores de tubo de intestino primitivo dos, HNF1β y HNF4α y eventual diferenciación en PDX1+ las células. El presente Protocolo proporciona fácil manejo y puede mejorar y estabilizar la eficiencia de la diferenciación de algunas líneas de hPSC que previamente fueron encontrados ineficazmente diferenciarse en linajes endodérmicos o PDX1+ las células.
Introducción
El páncreas principalmente consiste en las células exocrinas y endocrinas, y su disfunción o sobrecarga causa varias enfermedades, como la pancreatitis, diabetes y cáncer de páncreas. Para aclarar la patogenia de la pancreatopathy, es necesario analizar el proceso de desarrollo y la función de las células pancreáticas. Además, una fuente estable de la célula con sólida calidad es necesaria para establecer la terapia de suplementación de tejido de la célula. Célula de vástago de pluripotent humanas (hPSC)-derivado de las células pancreáticas son una fuente prometedora de células para estos fines, y el protocolo de diferenciación hacia células pancreáticas ha sido inten....
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Protocolo
Experimentos con hPSCs fueron aprobados por el Comité de ética del Departamento de medicina y postgrado Facultad de medicina, Universidad de Kyoto.
1. preparación de materiales
Nota: Preparar todos los medios y reactivos para cultivo celular en un ambiente estéril. Calentamiento de base medios de cultivo a temperatura ambiente (RT) antes de su uso. Medio para la diferenciación se utiliza dentro de 6 h a RT. información de los reactivos se enumeran en la Tabla de materiales.
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Diferenciación (figura 1A)
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Resultados
Propagación hiPSCs (585A129,30) se condensan y forman una monocapa homogénea (figura 1B) que es conveniente para la diferenciación. HiPSCs indiferenciados (etapa 0) son disociados y volver a sembrar como células individuales en densidades bajas de la célula (1-1.5 x 105 células/cm2). Dentro de 1 h, las células se unen a la placa y comiencen a mostrar protrusión. El día 1, las células proliferan y bien distribuid.......
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Discusión
La generación de PDX1+ células se compone de varios pasos; por lo tanto, es fundamental para el tratamiento de las células en el momento adecuado. Entre las medidas, la eficacia de la inducción del endodermo definitivo afecta en gran medida la eficacia de la inducción final, posiblemente por interferencia de otras células contaminantes linaje (es decir, mesodermo y ectodermo), que pueden proliferar o secretar factores interrumpir la diferenciación específica. Si la proporción de SOX17+ las células e.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Este trabajo fue apoyado en parte por fondos de la sociedad japonesa para la promoción de la ciencia (JSP) a través de Scientific Research (C) (JSP KAKENHI Grant Number15K09385 y 18 K 08510) T.T. y subvenciones para investigadores de JSP (JSP KAKENHI número 17J07622) A.K., y la Agencia de Japón para la investigación médica y desarrollo (AMED) a través de su investigación conceder "Centro base para iPS red de centro de investigación para la realización de la medicina regenerativa, investigación con células" a K.O. Los autores agradecen a Dr. Peter Karagiannis por leer el manuscrito.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| 3-Keto-N-aminoetil-N′-aminocaproildihidrocinamoil ciclopamina | Toronto Research Chemicals | K171000 | CYC |
| 4-[(E)-2-(5,6,7,8-tetrahidro-5,5,8,8-tetrametil-2-naftalenil)-1-propenil]-benzoico | Santa Cruz Biotechnology | SC-203303 | TTNPB |
| 50 mL Tubos de centrífuga de polipropileno estériles cónicos | Thermo Fisher Scientific | 339652 | |
| Anticuerpo anti-CDX2 [EPR2764Y] | Abcam | Ab76541 | Anti-CDX2, &veces; 1/1000 dilución |
| B-27 Suplemento (50 &veces;) | Thermo Fisher Scientific | 17504-044 | Suplemento sin suero |
| BD FACSAria II Clasificador | de células BD Biosciences | Para citometría de flujo | |
| Congelador biomédico | SANYO | MDF-U538 | Para -30 ° C |
| Almacenamiento Portaobjetos de recuento de células para TC10/TC20 Contador de células, de doble cámara | BIO-RAD | 1450011 | portaobjetos de recuento |
| de vidrio PLACA MULTIPOCILLO PARA CULTIVO CELULAR, 6 POCILLOS, PS, Transparente | Greiner Bio-One | 657165 | Para cultivo de diferenciación/placa de 6 pocillos |
| centrífuga | TOMY AX-310 | Para cultivo celular | |
| Centrífuga | TOMY | MX-305 | Para RT-qPCR |
| CHIR99021 | Axon Medchem | Axon 1386 | |
| BANCO LIMPIO | SHOWA KAGAKU | S-1601PRV | Banco limpio |
| Corning CellBIND Placa de 6 pocillos | Corning | 3335 | Para el cultivo sin alimentador de hPSCs/placa de 6 pocillos |
| Corning Matrigel Membrana Basal Factor de Crecimiento Factor de Crecimiento Reducido | Corning | 354230 | Matriz de membrana basal |
| Corning Synthemax II-SC | Sustrato Corning | 3535 | Para el cultivo sin alimentador de hPSCs/material de superficie sintético para hPSCs |
| Criostato | Leica | Leica CM1510 S | Para inmunotinción de agregados. |
| Cytofix/Cytoperm Kit | Becton Dickinson | 554714 | tampón de permanente/lavado es Tampón de permeabilización/lavado. El tampón Cytofix/Cytoperm es un tampón de fijación y permeabilización. |
| Bolígrafo Dako | Dako S2002 | Para la inmunotinción de agregados | |
| Mezcla dNTP (10 mM) | Thermo Fisher Scientific | 18427-088 | Para RT-qPCR |
| Anticuerpo secundario de adsorción cruzada Donkey anti-Goat IgG (H+L), Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A11055 | Anticuerpo secundario, &veces; dilución 1/500 |
| Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Anticuerpo secundario altamente adsorbido cruzado, Alexa Fluor 546 | Thermo Fisher Scientific | A10036 | Anticuerpo secundario, &veces; dilución 1/500 Donkey |
| anti-Rabbit IgG (H+L) Anticuerpo secundario altamente adsorbido cruzado, Alexa Fluor 546 | Thermo Fisher Scientific | A10040 | Anticuerpo secundario, y veces; dilución 1/500 Suero |
| burro | Merck Millipore | S30 | Suero de burro |
| D-PBS(-) sin Ca o Mg | Nacalai tesque | 14249-95 | DPBS |
| Essential 8 Medium | Thermo Fisher Scientific | A1517001 | Para el cultivo sin alimentador de hPSCs/medio de mantenimiento hPSC |
| Falcon 5 mL Tubo de ensayo de poliestireno de fondo redondo, con filtro de celdas Tapón a presión | Corning | 352235 | 5 mL tubo de poliestireno de fondo redondo con filtro de celdas |
| Punta de filtro, 1,000 y micro; L | Watoson | 124-1000S | Úselo junto con pipetas |
| Punta de filtro, 20 y micro; L | Watoson | 124-P20S | Úselo junto con pipetas |
| Punta de filtro, 200 y micro; L | Watoson | 124-P200S | Úselo junto con pipetas |
| Microscopio de fluorescencia | Keyence | BZ-X700 | para inmunotinción |
| Forma Steri-Cycle Incubadora de CO2 | Thermo Fisher Scientific | 370A | Incubadora |
| HNF-1β Anticuerpo (C-20) | Santa Cruz Biotechnology | sc-7411 | Anti-HNF1β, &veces; dilución 1/200 |
| HNF-4&alfa; Anticuerpo (H-171) | Santa Cruz Biotechnology | sc-8987 | Anti-HNF4α, &veces; dilución 1/200 |
| Hoechst 33342 | Thermo Fisher Scientific | H3570 | Para tinción de núcleos, &veces; dilución 1/200 |
| Páncreas humano ARN total | Ambion | AM7954 | para RT-qPCR |
| Anticuerpo humano PDX-1/IPF1 R | & D Systems | AF2419 | Anti-PDX1, IgG de cabra, × dilución 1/200 |
| Anticuerpo SOX17 humano | R& D Systems | AF1924 | Anti-SOX17, &veces; dilución 1/200 |
| MEM mejorado Opción de zinc medio | Thermo Fisher Scientific | 10373-017 | iMEM |
| Cámara de incubación | Cosmo Bio | 10DO | Para la inmunotinción de agregados Guantes de |
| examen de látex | Adachi | ||
| Vidrio deslizante recubierto MAS | Matsunami Glass | 83-1881 | Para inmunotinción de agregados |
| MicroAmp Fast placa de reacción de 96 pocillos | Applied Biosystems/Thermo Fisher Scientific | 4346907 | para RT-qPCR |
| Microscopio | Olympus | CKX41N-31PHP | Para cultivo celular |
| Microtubo | Watoson | 131-515CS | |
| Monoclonal Anti-&alfa;-Fetoproteína | SIGMA | A8452 | Anti-AFP, &veces; dilución 1/200 |
| Nanodrop 8000 | Thermo Fisher Scientific | para RT-qPCR | |
| Oligo dT | FASMAC | Oligo hecho a medida | Para RT-qPCR de la secuencia es "TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT" |
| Paraformaldehído, polvo | Nacalai tesque | 26126-54 | PFA, fijador, diluido en DPBS |
| Refrigerador farmacéutico | SANYO | MPR-514 | Para 4 & deg; C almacenamiento |
| PIPETMAN P | GILSON | Pipeta | |
| Humana Recombinante KGF/FGF-7 | R& D Systems | 251-KG | KGF |
| Recombinante Humano Noggin | PeproTech | 120-10C | NOGGIN |
| Recombinante Humano/Ratón/Rata Activina A | R& D Systems | 338-AC | Activin A |
| ReverTra Ace (100 U/μ L) | TOYOBO | TRT-101 | para RT-qPCR |
| Juego de DNasa libre de RNasa (50) | QIAGEN | 79254 | Para RT-qPCR |
| RNeasy Mini Kit | QIAGEN | 74104 | para RT-qPCR |
| RPMI 1640 con L-Gln | Nacalai tesque | 30264-85 | RPMI 1640 |
| Película de sellado para tiempo real | Takara | NJ500 | para RT-qPCR |
| Pipetas serológicas 10 mL | Costar/Corning | 4488 | Para el cultivo celular |
| Pipetas serológicas 25 mL | Costar/Corning | 4489 | Para el cultivo celular |
| Pipetas serológicas 5 mL | Costar/Corning | 4487 | Para el cultivo celular |
| Sox2 (D6D9) XP Rabbit mAb | Señalización celular | 3579S | Anti-SOX2, y dilución 1/200 |
| StepOnePlus | Applied Biosystems/Thermo Fisher Científico | Para RT-qPCR | |
| Sacarosa | Nacalai tesque | 30406-25 | Para la inmunotinción de agregados |
| TB Green Premix Ex Taq II | Takara | RR820B | para RT-qPCR |
| TC20 Contador de células automatizado | BIO-RAD | 1450101J1 | Contador de células automático |
| Compuesto Tissue-Tek OCT 4583 | Sakura Finetechnical | 4583 | Para la inmunotinción de agregados |
| Tissue-Tek Cryomold Moldes/Adaptadores | Sakura Finetechnical | 4566 | Para la inmunotinción de agregados |
| Triton X-100 | Nacalai tesque | 35501-15 | |
| Trypan Blue | BIO-RAD | 1450021 | |
| Congelador ultrafrío | SANYO | MDF-U33V | Para -80 ° C almacenamiento |
| UltraPure 0,5M EDTA, pH 8,0 | Thermo Fisher Scientific | 15575-038 | Diluir con DPBS para preparar 0,5 mM EDTA |
| Veriti Termociclador | Applied Biosystems/Thermo Fisher Scientific | para RT-qPCR | |
| Y-27632 | Wako | 251-00514 |
Referencias
- D'Amour, K. A., et al. Production of pancreatic hormone-expressing endocrine cells from human embryonic stem cells. Nature Biotechnology. 24 (11), 1392-1401 (2006).
- Pagliuca, F. W., et al. Generation of functional human pancreatic beta cells in vi....
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Reimpresiones y permisos
