Eficiente generación de páncreas/duodeno Homeobox proteína 1⁺ progenitores del Foregut pancreática Posterior de hPSCs en las culturas de la adherencia

El páncreas principalmente consiste en las células exocrinas y endocrinas, y su disfunción o sobrecarga causa varias enfermedades, como la pancreatitis, diabetes y cáncer de páncreas. Para aclarar la patogenia de la pancreatopathy, es necesario analizar el proceso de desarrollo y la función de las células pancreáticas. Además, una fuente estable de la célula con sólida calidad es necesaria para establecer la terapia de suplementación de tejido de la célula. Célula de vástago de pluripotent humanas (hPSC)-derivado de las células pancreáticas son una fuente prometedora de células para estos fines, y el protocolo de diferenciación hacia células pancreáticas ha sido intensamente estudiado^{1,2,3, 4}. Los recientes avances en la generación in vitro de las células β pancreáticas mímico la generación de las células β en adultos humanos y estas células Mostrar eficacia terapéutica sobre implante en modelo diabético ratones^2,3. Además, el análisis de las células β generados a partir de las células madre pluripotentes inducidas (iPSCs) saludable los donantes paciente de diabetes tipo 1 no reveló ninguna diferencia funcional incluyendo cuando está bajo estrés⁵. Por otra parte, fenotipos de la enfermedad han sido parcialmente reproducidos en células pancreáticas inducidas con iPSCs derivados del paciente o hPSCs que las mutaciones genéticas en el mismo sitio que los pacientes^6,7.

Para generar células pancreáticas de hPSCs, se utiliza la diferenciación dirigida paso a paso que recapitula los procesos de desarrollo. El páncreas se deriva de la capa del endodermo del embrión temprano, que expresa el sexo determina la región Y-caja 17 (SOX17) y forkhead cuadro A2 (FOXA2)⁸. Basado en los estudios con ratones, la capa endodermal forma el tubo intestino primitivo, que se caracteriza por la expresión de hepatocitos factor nuclear 1-beta (Hnf1β) y el factor nuclear de hepatocito 4-alfa (Hnf4α). El tubo intestino primitivo se alarga y se convierte en el aparato respiratorio, tracto digestivo y órganos. Después de la elongación, el área posterior del foregut se convierte la presunta región pancreática, y marcada por la expresión de la proteína del factor transcripcional páncreas/duodeno homeobox 1 (PDX1)^8,9,10. Las partes dorsales y ventrales de la PDX1⁺ tubo intestinal espesar a brotes pancreáticos forma, que se caracterizan por la coexpresión de páncreas transcripción factor 1 subunidad alfa (PTF1A) y NK6 homeobox 1 (NKX6.1)^8,11. Esta expresión marca el comienzo morfológico de la organogénesis pancreática. Las células del páncreas endodermo, que son componentes de las yemas pancreáticas, forman una red tubular ramificada de estructuras epiteliales¹² y finalmente se diferencian en células exocrinas y endocrinas, incluyendo β-células secretoras de insulina y α-células secretoras de glucagón. Expresión de PDX1 se detecta primero en la región pancreática presuntiva, que luego se observa a lo largo de todo el desarrollo pancreático y muestra localización de las células β y δ^9,13,14. Aunque el Pdx1⁺ área de células que no expresan Ptf1a o Nkx6.1 distingue en el antro gástrico, duodeno, vía biliar extrahepática y algunas células intestinales en el centro a la última etapa de desarrollo en ratones⁹, PDX1⁺ las células son consideradas los progenitores del páncreas en la primera etapa del desarrollo en seres humanos.

Aquí, presentamos un protocolo detallado para distinguir hPSCs en PDX1⁺ de las células para la generación de linajes pancreáticos. El protocolo inicia la diferenciación por la siembra disocia las células^15,16,17. En general, hPSCs indiferenciadas se mantienen como colonias o agregados de células en suspensión o en la adhesión. Como resultado, la mayoría de protocolos inician la diferenciación poco después pases. Sin embargo, en el estado de colonias o agregados de células son propensas a heterogeneidades espaciales y transcripcional^{18,19,20,21,22}, que podrían dificultar la primer paso de diferenciación hacia endodermo definitivo seguido por ineficiente diferenciación PDX1⁺ las células. El presente Protocolo puede ofrecer un manejo fácil para mejorar y estabilizar la eficiencia de la diferenciación de algunas líneas de hPSC que previamente fueron encontrados para distinguir ineficazmente a linajes endodérmicos y PDX1⁺ células^{23, 24 , 25}.

Experimentos con hPSCs fueron aprobados por el Comité de ética del Departamento de medicina y postgrado Facultad de medicina, Universidad de Kyoto.

1. preparación de materiales

Nota: Preparar todos los medios y reactivos para cultivo celular en un ambiente estéril. Calentamiento de base medios de cultivo a temperatura ambiente (RT) antes de su uso. Medio para la diferenciación se utiliza dentro de 6 h a RT. información de los reactivos se enumeran en la Tabla de materiales.

1. Diferenciación (figura 1A)
   1. Medio de 1A etapa: transferencia de Medio RPMI 1640 en un tubo con una pipeta. Añadir el suplemento libre de suero, activin A, CHIR99021 y Y-27632 a una concentración de 1 x, 100 ng/mL, 3 μM y 10 μM, respectivamente.
   2. Medio de fase 1B: transferencia de Medio RPMI 1640 en un tubo con una pipeta. Añadir el suplemento libre de suero, activina A y CHIR99021 a una concentración de 1 x, 100 ng/mL, ≤ 1 μM, respectivamente.
      Nota: La concentración de CHIR99021 debe ser menor que en medio de 1A etapa y además no es necesario, pero aumenta el número de celular.
   3. Medio de la etapa 2: medio MEM de transferencia mejorado (iMEM) en un tubo con una pipeta. Añadir el suplemento libre de suero y factor de crecimiento de queratinocitos (KGF) a una concentración de 0,5 x y 50 ng/mL, respectivamente.
   4. Medio de la etapa 3: transferencia del iMEM medio en un tubo con una pipeta. Añadir el suplemento libre de suero, KGF, NOGGIN, 3-ceto-N-aminoetil-N'- aminocaproyldihydrocinnamoyl cyclopamine (CYC) y ácido 4-[(E)-2-(5,6,7,8-Tetrahydro-5,5,8,8-tetramethyl-2-naphthalenyl)-1-propenyl]-benzoic (TTNPB) con una pipeta para concentraciones de 0, 5 x, 50 ng/mL, 100 ng/mL, 0.5 μM y 10 nM, respectivamente.
2. Citometría de flujo (FCM)
   1. 1 x buffer de permeabilización/lavado: transferencia de agua en un tubo con una pipeta. Añadir el tampón de lavado/permeabilización por una pipeta a una concentración de 1 x.
   2. Solución de bloqueo de la FCM: transfiera 1 x buffer de permeabilización/lavado en un tubo con una pipeta. Añadir suero de burro por una pipeta a una concentración del 2% (vol/vol).
3. Inmunotinción
   1. Solución de bloqueo: salina (Phosphate-Buffered de DPBS de transferencia Dulbecco) en un tubo con una pipeta. Agregar suero de burro y Triton X pipeta a concentraciones de 5% (vol/vol) y 0.4% (vol/vol), respectivamente.

2. hPSC diferenciación Posterior del Foregut pancreática células progenitores (PDX1 células⁺ )

Nota: Llevar a cabo todos los procedimientos con técnicas estériles. hPSCs se mantienen en placas de 6 pocillos recubiertas por una superficie sintética para hPSCs con medio de mantenimiento hPSC según las instrucciones^{17,26 el fabricante}. Cuando las células llegan a 50-80% de confluencia (etapa 0) utiliza para la diferenciación.

1. Preparar la membrana del sótano las placas revestidas de matriz.
   1. Transferencia de 6 mL de RPMI 1640 (4 °C) en un tubo refrigerado a 4 °C en hielo. Añadir 2 mg de la matriz de la membrana del sótano (4 °C) con refrigerado 1 mL-Pipetas y mezclar bien mediante pipeteo suave para hacer la matriz de la membrana del sótano de 0,33 mg/mL.
   2. Transfiera 2 mL de la matriz de la membrana del sótano diluido en cada pocillo de las placas de cultivo celular 6-bien por una pipeta. Colocar las placas a 37 °C durante 60-90 minutos en una incubadora. Después, no las placas a temperatura ambiente hasta su uso (dentro de 3 h).
2. La hPSCs de la semilla e iniciar la diferenciación al endodermo definitivo (Fase 1A).
   1. Aspire el medio utilizado y añadir 2 mL de ácido etilendiaminotetracético de 0,5 mM (EDTA) (RT) por pozo con una pipeta para lavar la hPSCs cultivadas en placas de 6 pozos.
   2. Aspirar 0,5 mM EDTA y añadir 2 mL de EDTA 0.5m por pozo con una pipeta. Incubar las placas a 37 °C durante 5 minutos.
   3. Aspirar 0,5 mM EDTA y añadir 1 mL de medio de mantenimiento hPSC en RT suplementado con 10 μM Y-27632 por pozo con una pipeta. Pipetee suavemente pero rápidamente a golpe Unidas células en las placas y disociar las células agrupadas en celdas individuales. No la burbuja de la suspensión de células durante el pipeteo.
   4. Transferir la suspensión de células en un tubo de centrífuga de 50 mL que contiene 4 mL de medio de mantenimiento hPSC a RT suplementado con 10 μM Y-27632. Pipetee suavemente la suspensión de células.
   5. Contar el número de células en la suspensión de células mediante el procedimiento de exclusión de tinción de azul de tripano.
      1. Mix 15 μL de suspensión celular y 15 μL de azul tripán en un tubo.
      2. Transferir 10 μL de la suspensión de células diluida con azul de tripano en celda contando los portaobjetos en duplicado por una pipeta de 10 μL.
      3. Cuenta la celda número con un contador celular automático y calcular la densidad de células en la suspensión de células. Viabilidad es generalmente > 98%.
   6. Parte alícuota de la suspensión de células en un tubo de centrífuga de 50 mL en 1-1.5 x 10⁶ células por pocillo de las placas de 6 pozos (1-1.5 x 10⁵ células/cm²).
   7. Centrifugar el tubo de 50 mL a 200 x g a temperatura ambiente durante 5 minutos.
   8. Aspirar el sobrenadante con una pipeta y resuspender las células con 1 mL de medio de 1A etapa (RT) por pozo. Pipetear la suspensión de células y añadir otro 1 mL de medio de 1A etapa (total, 2 mL por pozo).
   9. Aspirar la matriz membrana basal diluida en los pocillos de las placas de cultivo celular preparados en el paso 2.1.2 por pipeta 1.000 μL. Proceder inmediatamente al siguiente paso.
   10. Suavemente pipetear la suspensión de células en el paso 2.2.8 otra vez. Inmediatamente después de mezclar, transfiera la suspensión de células (2 mL) en cada pocillo de una placa de 6 pozos. Cubra la placa con un papel de aluminio para proteger la placa de la luz. Colocar la placa en el Banco limpio a temperatura ambiente durante 10-15 minutos.
       Nota: No mueva la placa después de la siembra.
   11. Coloque suavemente la placa a 37 °C, 5% CO₂ incubadora (ambiente humidificado) y la cultura durante 24 h.
       Nota: No agitar la placa después de la siembra.
3. Inducir la diferenciación en endodermo definitivo (etapa 1B).
   1. Aspire el medio utilizado y añadir 2 mL de DPBS los pozos con una pipeta. Repetir la aspiración y la adición de DPBS una vez.
      Nota: Para eliminar las células muertas de la monocapa, agitar suavemente la placa antes de cada aspiración.
   2. Aspire la DPBS usado por una pipeta y añadir 4 mL de medio de la 1B de la etapa (37 °C) por pozo. Coloque suavemente la placa en la incubadora de 37 °C (ambiente humidificado de 5% CO₂) y la cultura durante 48 h.
   3. Aspire el medio utilizado y añadir 2 mL de DPBS al pozo con una pipeta. Repetir la aspiración y la adición de DPBS una vez.
      Nota: Retire las células muertas de la monocapa por agitación suave antes de cada aspiración.
   4. Aspire la DPBS usado por pipeta y añadir 4 mL de medio de la 1B de la etapa (37 °C) por pozo. Coloque suavemente la placa en la incubadora (37 °C, atmósfera humidificada de 5% CO₂) y la cultura durante 24 h.
4. Inducir la diferenciación en el tubo del intestino primitivo (etapa 2).
   1. Aspire el medio utilizado y añadir 2 mL de DPBS al pozo con una pipeta.
      Nota: Retire las células muertas de la capa monomolecular agitando suavemente antes de cada aspiración.
   2. Aspire la DPBS usado por pipeta y añadir 4 mL de medio de etapa 2 (37 °C) por pozo. Coloque la placa en la incubadora (37 °C, atmósfera humidificada de 5% CO₂) y la cultura durante 4 días.
5. Inducir la diferenciación en PDX1⁺ las células (fase 3).
   1. Aspire el medio utilizado y añadir 2 mL de DPBS al pozo con una pipeta. Repetir la aspiración y la adición de DPBS una vez.
   2. Aspire la DPBS usado por pipeta y añadir 4 mL de medio de etapa 3 (37 °C) por pozo. Coloque la placa en la incubadora (37 °C, atmósfera humidificada de 5% CO₂) y la cultura durante 3 días.
6. Inducir la diferenciación en las células endocrinas pancreáticas.
   1. Realizar la inducción celular NKX6.1⁺ (etapa 4, durante 8 días) seguida por la inducción de células endocrinas (etapa 5, durante 12 días) con protocolos previamente descritos^3,16,26. Caracterizar y validar la diferenciación de las células endocrinas por inmunotinción y análisis de (qRT-PCR) reacción en cadena de polimerasa de transcripción inversa en tiempo real cuantitativa.
      Nota: Se refieren a Toyoda et al¹⁶ y Kimura et al²⁶ para los procedimientos experimentales detallados. Consulte la tabla 1 para secuencias de la cartilla utilizadas para el análisis de qRT-PCR.

3. flujo Cytometry (FCM)

1. Aspire el medio utilizado y añadir 2 mL de EDTA 0,5 mM para el pozo con una pipeta. Repetir la aspiración y la adición de EDTA 0,5 mM una vez.
   Nota: Agitar la placa suavemente para eliminar las células muertas de las células de la monocapa antes de cada aspiración.
2. Para disociar las células (aproximadamente 3-6 × 10⁶ células por pocillo), agregar 2 mL del 0.25% tripsina que contiene 0,5 mM EDTA por pozo. Incubar las placas a 37 °C durante 5-10 minutos.
3. Pipetee suavemente pero rápidamente para disociar las células agrupadas en celdas individuales. No la burbuja de la suspensión de células durante el pipeteo.
4. Añadir 8-10 mL de medio base (RPMI 1640 o iMEM, RT) que contiene 0,5 x suplemento libre de suero y 10 μM Y-27632 por bien y mezclar la suspensión de células. Transferir la suspensión de células en un tubo de centrífuga.
5. Centrifugar el tubo a 300 x g a temperatura ambiente durante 5 minutos.
6. Aspirar el sobrenadante y resuspender las células con 2 mL de EDTA (RT) de 0,5 mM. Pipetee suavemente la suspensión de células.
7. Centrifugar el tubo a 300 x g a temperatura ambiente durante 5 minutos.
8. Aspirar el sobrenadante y resuspender las células con 100 μL de tampón de fijación y permeabilización por 10⁶ células bajo una campana. Pipetee suavemente la suspensión de células debajo de una campana. Mantenga el tubo a temperatura ambiente durante 30 minutos.
9. Centrifugar el tubo a 400 x g a temperatura ambiente durante 5 minutos.
10. Aspirar el sobrenadante bajo una campana y resuspender las células con solución de bloqueo de la FCM de μL 500 por 10⁶ células. Pipetee suavemente la suspensión de células. Mantenga el tubo a temperatura ambiente durante 30 minutos.
11. Transferir 50 μL de la suspensión de células a un tubo (aproximadamente 1 x 10⁵ células). Centrifugar el tubo a 400 x g a temperatura ambiente durante 5 minutos Retire el sobrenadante y resuspender las células con 100 μL de anticuerpo primario diluido (véase Tabla de materiales) en FCM bloqueo solución e incubar a 4 °C para > 16 h.
12. Centrifugar el tubo a 400 x g a temperatura ambiente por 5 minutos quite el sobrenadante y resuspender las células con 180 μL de 1 x de tampón de lavado/Perm.
13. Centrifugar el tubo a 400 x g a temperatura ambiente durante 5 minutos Retire el sobrenadante y resuspender las células con 100 μL del anticuerpo secundario diluido (véase Tabla de materiales) en solución de bloqueo de la FCM. Incube las células a temperatura ambiente durante 60 minutos o a 4 °C por > 16 h con la protección de la luz.
14. Centrifugar el tubo a 400 x g a temperatura ambiente por 5 minutos quite el sobrenadante y resuspender las células con 180 μL de 1 x de tampón de lavado/Perm.
15. Centrifugar el tubo a 400 x g a temperatura ambiente por 5 minutos Retire el sobrenadante y resuspender las células con 180 μL de 2% de suero de burro en DPBS.
16. Filtrar la suspensión de células mediante la transferencia en 5 mL tubo de poliestireno fondo redondo con una célula tamiz (malla de nylon de 35 μm) y guardar a 4 °C con protección de la luz hasta el análisis.
17. Análisis de una proporción de células teñidas positivamente por un citómetro de flujo²⁷.

4. inmunotinción

1. Aspire el medio utilizado y añadir 2 mL de DPBS al pozo con una pipeta. Repetir la aspiración y la adición de DPBS una vez.
   Nota: Agitar suavemente la placa para eliminar las células muertas de las células de la monocapa antes de cada aspiración.
2. Añadir 2 mL de paraformaldehído al 4% (PFA) (4 °C) por pozo con una pipeta debajo de una campana. Mantenga la placa a 4 °C por 20 min.
3. Quite la PFA pipeta bajo una campana. Añadir 2 mL de DPBS en RT al pozo con una pipeta debajo de una campana. Repetir la aspiración y la adición de DPBS una vez.
4. Añadir 2 mL de solución de bloqueo por bien y mantenga la placa a temperatura ambiente durante 30 minutos.
5. Aspirar la solución y añadir 1 mL de anticuerpo primario (véase Tabla de materiales) en solución por pozo de bloqueo. Incubar a temperatura ambiente durante 60 minutos o a 4 °C por > 16 h.
6. Aspirar la solución, añadir 2 mL de DPBS que contenga 0,4% Tritón X-100 e incubar a temperatura ambiente durante 10 minutos repetir la aspiración, además de la solución y la incubación una vez.
7. Aspirar la solución y añadir 1 mL de anticuerpo secundario (véase Tabla de materiales) en solución por pozo de bloqueo. Incubar a temperatura ambiente durante 60 minutos con protección de la luz.
8. Aspirar la solución, añadir 2 mL de DPBS que contenga 0,4% Tritón X-100 (RT) e incubar a temperatura ambiente durante 5 minutos con protección de la luz. Repetir la aspiración, además de la solución e incubación dos veces.
9. Tomar micrografías para examinar la eficacia de diferenciación bajo un microscopio de fluorescencia²⁸.

Propagación hiPSCs (585A129,30) se condensan y forman una monocapa homogénea (figura 1B) que es conveniente para la diferenciación. HiPSCs indiferenciados (etapa 0) son disociados y volver a sembrar como células individuales en densidades bajas de la célula (1-1.5 x 105 células/cm2). Dentro de 1 h, las células se unen a la placa y comiencen a mostrar protrusión. El día 1, las células proliferan y bien distribuidas para cubrir el 80-90% de la superficie. Durante la etapa 1B, los medios de comunicación aparecerán turbia debido a las células muertas. La eliminación de células muertas es fundamental para diferenciación altamente eficiente ya que las células muertas probablemente molestar a la supervivencia y la diferenciación de las células que mienten por debajo. En los días 3 y 4, las células forman una hoja de monocapa homogénea que puede ser descrita como un aspecto de adoquín. En este momento, mayoría de las células dejar expresar el sexo determina la región Y caja 2 (SOX2), un marcador para las células no diferenciadas y en cambio expresa un marcador del endodermo definitivo, SOX17, en más del 90% (figura 2A y B). La mayoría SOX17+ células expresa FOXA2 (figura 2A). A partir de la diferenciación un compromisos de densidad celular inadecuado la eficiencia diferenciación en este paso (figura 3). En las etapas 2 y 3, muerte de la célula se relaja, y el medio utilizado no es tan turbio como lo es en la etapa 1B. Las células expresan los marcadores de tubo de intestino primitivo HNF1β y HNF4α (figura 2) y finalmente expresan un marcador del progenitor del foregut posterior, pancreático, PDX1, en más del 90% (Figura 2D y E). El PDX1+ celular inducción es reproducible en otra línea hiPSC, 1231A3 31y una línea de células, de KhES-3 32 (figura 4). resultados de qRT-PCR la expresión de mRNA de marcadores de fase eran constantes con inmunotinción (figura 5A). La expresión del mRNA de PDX1 es evidente en la etapa 3 y aumenta sustancialmente el epílogo.

PDX1+ las células en las primeras etapas del desarrollo tienen el potencial de diferenciarse en células pancreáticas no sólo pero también del antro gástrico, duodeno, vía biliar extrahepática y una parte del intestino 9. El potencial de diferenciación de in vitro genera PDX1+ las células a las células pancreáticas pueden evaluarse por la cultura extendida con los protocolos reportados para páncreas endodermo y endocrino pancreático células3,16, 26. las expresiones de un marcador de páncreas endodermo, NKX6.1y dos marcadores endocrinos pancreáticos, insulinay glucagón, se observaron durante los días 19 (etapa 4) y 31 (etapa 5), respectivamente (figura 5).

Figura 1: aspecto representativo de las células en diferenciación paso a paso. (A) A esquema de diferenciación dirigida de hPSCs linajes pancreáticos. Números entre paréntesis indican concentraciones (unidades se escriben a continuación). (B) micrográfos de campo brillante representante de hiPSCs en pasos clave de la cultura de la diferenciación. 585A1 hiPSCs disociados como células individuales e inducidas a diferenciarse en endodermo definitivo, tubo del intestino primitivo y progenitor del foregut posterior, pancreático. Los paneles inferiores son vistas ampliadas de los paneles superiores. RPMI, RPMI 1640; AA, activina (ng/mL); CH, CHIR99021 (ΜM); KGF (ng/mL); NOG, NOGGIN (ng/mL); CYC, 3-Keto-N-aminoethyl-N'-aminocaproyldihydrocinnamoyl cyclopamine (μM); TTNPB, ácido 4-[(E)-2-(5,6,7,8-Tetrahydro-5,5,8,8-tetramethyl-2-naphthalenyl)-1-propenyl]-benzoic (nM). Barras de escala = 300 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: Representante inducción hacia linajes pancreáticos de hiPSCs. (A) la proporción de SOX2–SOX17+ células analizadas por citometría de flujo antes de la diferenciación (etapa 0) y el día 4 (etapa 1B). Undifferentiated hiPSCs (SOX2+SOX17–) fueron distinguidos en endodermo definitivo (SOX2–SOX17+). La mayoría SOX17+ células FOXA2 Co expresado. (B) micrografías inmunofluorescentes representativa el día 4 (etapa 1B). Las células fijas fueron manchadas para núcleos (azul), SOX17 (verde) y SOX2 (rojo). (C) representante micrografías inmunofluorescentes días 4 (etapa 1B) y 8 (etapa 2). Las células fijas fueron manchadas para núcleos, HNF4α (rojo) y HNF1β (verde) (azul). (D) la proporción de células positivas para PDX1, analizada por citometría de flujo en los días 4 (etapa 1B) y 11 (fase 3). (E) representante micrografías inmunofluorescentes de PDX1 (verde) y de los núcleos (azul) el día 11 (etapa 3). Barras de escala = 100 μm.  Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3: Representante inducción hacia el endodermo definitivo desde densidades de células diferentes. Micrografías de representante campo brillante (A) de 1 h después de la diferenciación de células. hiPSCs disociados como células individuales e inducidas a diferenciarse en endodermo definitivo a densidades de células diferentes (1-50 x 104/cm2). Los paneles inferiores son vistas ampliadas de los paneles superiores. (B) la proporción de SOX2–SOX17+ células analizadas por citometría de flujo antes de la diferenciación (etapa 0) y el día 4 (etapa 1B). (C) la proporción de PDX1+ células analizadas por citometría de flujo en los días 8 (etapa 2) y 11 (fase 3). Barras de escala = 300 μm.  Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4: Representación inducción hacia PDX1+ las células hiPCSs y hESCs. Una línea hiPSC, 1231A3 (A), y una línea de células de KhES-3 (B), fueron distinguidos endodermo definitivo y PDX1+ las células. Se analizó la composición celular por citometría de flujo. La proporción de SOX2–SOX17+ analizó las células antes de diferenciación (etapa 0) y el día 4 (etapa 1B). La proporción de PDX1+ células se analizó en los días 8 (etapa 2) y 11 (fase 3).  Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 5: Representante inducción hacia páncreas endodermo y las células endocrinas. hiPSCs (585A1) fueron distinguidos en PDX1+ las células. Las células fueron más distinguidas en páncreas endodermo y las células endocrinas pancreáticas con protocolos reportados3,16,26. (A) mRNA expresiones de marcadores de fase se midieron mediante reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real cuantitativa (qRT-PCR). Los datos fueron normalizados a la expresión de la GAPDH y presentados como el doble cambio en la expresión génica en relación con el valor de pico. Tenga en cuenta que expresión PDX1 se incrementó en > 20-fold de días 8 (etapa 2) y 11 (fase 3) en > 100-fold de días 11 (etapa 3) y 19 (etapa 4). La expresión en el páncreas humano adulto se muestra como Panc. SOX2, negro; SOX17, violeta; HNF1β, marrón; HNF4α, naranja; PDX1, verde claro; NKX6.1, verde; Insulina, azul; Glucagón, rojo. (B) representante inmunofluorescentes micrografías de un marcador de páncreas endodermo, NKX6.1 (rojo), los días 11 (etapa 3) y 19 (etapa 4). PDX1 (verde) y los núcleos (azul) fueron co manchados. (C) representante micrografías inmunofluorescentes de dos fabricantes endocrinos pancreáticos, insulina (INS, verde) y glucagón (GCG, rojo), los días 19 (etapa 4) y 31 (etapa 5). Los núcleos (azul) eran Co manchados.  Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Tabla 1: Cartillas para qPCR.

Los autores no tienen nada que revelar.