Aquí, describimos la inducción del síndrome nefrótico experimental en ratones 129S1/SvImJ por inyección retrobulbar rápido de doxorrubicina. También tratamos ratones nefróticos con gránulos de liberación prolongada que contiene aprotinina para inhibir la actividad de la proteasa de serina urinaria y prevenir la retención de sodio.
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Artículo de método
Inducción del síndrome nefrótico en ratones por la inyección Retrobulbar de la doxorrubicina y la prevención de la retención de volumen por la aprotinina de liberación sostenida
En este artículo
Resumen
Resumen
El síndrome nefrótico es la manifestación más extrema de la enfermedad renal proteinuria y caracterizada por proteinuria pesado, hipoalbuminemia y edema por retención de sodio y la hiperlipidemia. Para estudiar la fisiopatología de este síndrome, roedor han desarrollado modelos basados en la inyección de sustancias tóxicas como la doxorrubicina causando daño Podocito. En los ratones, sólo algunas cepas son susceptibles a este modelo. En los ratones de tipo salvaje 129S1/SvImJ, la administración de doxorubicina por inyección intravenosa rápida en el seno de retrobulbar induce síndrome nefrótico experimental que presenta todos los síntomas de las enfermedades humanas, incluyendo edema y retención de sodio. Después de la aparición de proteinuria, exposición de ratones aumentó actividad de proteasa de serina urinaria que conduce a la activación del canal epitelial del sodio (ENaC) y retención de sodio. Inhibición farmacológica de las proteasas de serina urinaria por el tratamiento con aprotinina de liberación sostenida abroga la activación de ENaC y evita la retención de sodio. Este modelo es ideal para el estudio de la fisiopatología de la proteasuria, es decir., la excreción de las proteasas de serina activa que causa la activación de ENaC por la proteolisis de la subunidad γ. Esto puede considerarse como el mecanismo primario de activación de ENaC y la retención de sodio en enfermedad renal proteinúrica.
Introducción
El síndrome nefrótico se caracteriza por hiperlipemia, hipoalbuminemia, edema y proteinuria pesado y puede considerarse como la manifestación más extrema de la enfermedad renal proteinúrica. En roedores, el síndrome nefrótico experimental puede ser inducido por una inyección de antraciclinas o puromicina que conduce al daño Podocito y se asemeja a la enfermedad humana cambios mínimos y glomerulosclerosis segmentario focal (FSGS)1. Después de su primera descripción en 1955 por Frenk et al. 2, nefrosis de nucleósido puromicina (PAN) en ratas se ha convertido en un modelo estándar para investigar la fisiopatología del síndrome nefrótico en numerosos estudios3,4,5,6. En ratones, el modelo puede ser inducido por la antraciclina doxorrubicina7. Sin embargo, hay una fuerte dependencia de cepa que está genéticamente determinada por al menos dos loci genéticos8. Además, existen diferencias en la respuesta de proteinuria y el curso del síndrome nefrótico9,10. Usando ratones 129S1/SvImJ y la inyección intravenosa rápida de doxorrubicina vía el seno retrobulbar, respuestas de proteinuria alcanzan valores que son suficientes para inducir las características típicas del síndrome nefrótico, especialmente retención de volumen caracterizado por ascitis y casi libre de sodio orina7. Retención de sodio en el síndrome nefrótico experimental ha sido presumida para ser el resultado de la activación del canal epitelial del sodio (ENaC) en el túbulo distal por las proteasas de serina aberrantemente filtrada como plasmina causa proteólisis de la subunidad γ4 ,11,12. Recientemente, este concepto fue probado en ratones nefróticos que estaban protegidos de proteolytic activación de ENaC y la retención de sodio por el tratamiento con la aprotinina de inhibidor de proteasa de serina que era igualmente eficaz como el ENaC bloqueador amilorida13. Para asegurar la continua entrega a los túbulos distales, aprotinina fue administrada mediante pellets de liberación sostenida por vía subcutánea implantado. Se necesitan estudios futuros para identificar las proteasas de serina que son responsables de la activación proteolítica de ENaC en el síndrome nefrótico que se cree que la situación humana en paralelo. Para ello, el síndrome nefrótico inducida por la doxorrubicina es un modelo valioso que puede ser utilizado en los ratones de tipo salvaje o ampliado a ratones modificados genéticamente. Sus ventajas incluyen bajo costo de la droga, menor complejidad de la gestión y buena reproducibilidad14.
En este artículo, nos demuestran la inducción del síndrome nefrótico experimental por inyección intravenosa rápida de la doxorrubicina al sino retrobulbar y la implantación de pellets de liberación sostenida que contienen aprotinina para inhibir la proteasa de serina urinaria actividad medida con un ensayo cromogénico.
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Protocolo
Todos los métodos se realizaron según los institutos nacionales de salud guía para el cuidado y uso de animales de laboratorio y la ley para el bienestar de los animales, y que fueron aprobados por las autoridades locales (Regierungspräsidium Tübingen).
1. inducción del síndrome nefrótico Experimental por doxorrubicina inyectable el seno Retrobulbar
- Preparar una jeringa de 0.5 mL con cánula 30G montado por el tope del pistón de la marca.
- Calcular el volumen de inyección de la doxorrubicina para hombre (7.25 μl/g peso corporal (bw) igual a doxorrubicina de bw de 14.5 μg/g) y los ratones hembra (6,9 μl/g PN igual a doxorrubicina de bw de 13,8 μg/g) según el peso del cuerpo desde la mañana.
Nota: La dosis dada es apropiada para la inducción del síndrome nefrótico. Cambios menores en dosis conducen a un curso diferente crucial de nefropatía alcanza de enfermedad renal crónica leve con sólo pequeños cambios en la tasa de filtración glomerular (doxorubicin de bw de 12.6 μg/g) renal aguda falla (doxorubicin de bw de 15,4 μg/g)7, 15. - Caliente la cantidad calculada de solución doxorrubicina (2 μg/μl) en una cámara caliente de 37 ° C.
PRECAUCIÓN: La doxorrubicina es dañino si es ingerido y puede causar cáncer. Siempre use guantes si trabaja con doxorrubicina y evitar cualquier contacto con la piel. - Rellenar previamente la jeringa con la solución de la doxorrubicina hasta el punto marcado y ajustar el balance a cero. Llene la jeringa con el volumen de inyección y comprobar el volumen por el peso de la jeringa.
- Narcotizar el ratón profundamente con 5 vol % isoflurano con un vaporizador y un flujo de oxígeno de 2 L/min.
- No utilice ungüento en los ojos antes de la inyección. El operador necesita una visión clara de la cavidad orbital para realizar una inyección retrobulbar segura y acertada.
- Evaluar el nivel de anestesia por reflejo pedal y ajuste entrega anestésico si es necesario antes de comenzar la inyección.
- Coloque el ratón en un recumbency lateral derecho con la espalda mirando al cuerpo del operador y su cabeza hacia la mano del operario inyección.
Nota: Se describe el procedimiento para una persona diestra, para las personas zurdas que realizan la inyección con la mano izquierda es más fácil hacer la posición e inyección invertida de derecha a izquierda. - Cuidadosamente sobresalen el globo ocular izquierdo del ratón desde el zócalo del ojo aplicando presión suave a la piel, dorsal y ventral al ojo.
- Punción del seno izquierdo retrobulbar desde el ángulo interno del ojo (comisura palpebral medial). Evitar el contacto con la mouse´s del globo ocular.
- Ligeramente incline la jeringa e inyecte el volumen entero de una sola vez. Asegúrese de que el volumen se inyecta sin oponer resistencia y sin signos de extravasación como exopthalmus o salida desde el sitio de inyección.
- Puesto que la doxorrubicina es una sustancia altamente tóxica, comprobar bienestar al menos una vez al día mediante una hoja de puntuación según Morton y Griffiths et al. 16 y la paga especial atención en el sitio de inyección. Signos de extravasación como exopthalmus, encierro del párpado deteriorado o signos de necrosis como hinchazón o piel lesiones surgen después de la inyección o en los días siguientes, el ratón debe ser sacrificado.
2. implantación de Pellets de liberación sostenida que contienen aprotinina
- Orden pastillas la dosis deseada por día y liberación de la duración de antemano. En el caso de aprotinina, elegir una dosis de 1 mg por día para ser lanzado durante 10 días.
Nota: En este estudio, los pellets de aprotinina contienen una dosis de 10 mg.- Almacenar los pellets bajo condiciones secas y evitar cualquier exposición a la humedad.
- Preparar artículos necesarios para la cirugía, incluyendo un par de tijeras de pelo, un par de tijeras de la preparación de la piel, un bisturí, pinzas quirúrgicas, dos pares de pinzas de tejido, un sostenedor de la aguja y 15 cm monofile sutura no reabsorbible.
- Esterilizar los instrumentos utilizando un esterilizador de calor durante 5 minutos a 240 ° C. Antes de usar los instrumentos, espere 5 minutos hasta que alcance la temperatura ambiente.
- Evite cualquier contacto de puntas de instrumento esterilizado a las superficies no estériles.
- Instrumentos calientes para evitar quemaduras en la piel.
- Esterilizar los instrumentos utilizando un esterilizador de calor durante 5 minutos a 240 ° C. Antes de usar los instrumentos, espere 5 minutos hasta que alcance la temperatura ambiente.
- Narcotizar ratón con isoflurano vol 5% seguido por 1,5 vol % utilizando un flujo vaporizador y el oxígeno de 2 L/min.
- Coloque el ratón en una posición prona en un dispositivo de calentamiento recubierto con una capa de gasa para evitar lesiones térmicas en el ratón. Temperatura de la superficie es de 37 ° C.
- Proteger los ojos con el ungüento.
- Eliminar el vello en el centro en un área de cerca de 0,5 cm2 usando tijeras o un cortador de pelo y desinfectar la piel sin pelo con un desinfectante adecuado para la desinfección de la piel. Eliminar menos pelo como sea posible así que se queda más difícil para el ratón llegar a la herida y extremos roscados más adelante y para mantener la temperatura corporal.
- Haga una incisión en la piel sin pelo con un bisturí en dirección craneo-caudal en una longitud de unos 5 mm. Prepare una bolsa lateral izquierda de aproximadamente 1 cm de profundidad en el tejido conectivo subcutáneo usando una preparación contundente.
- Evaluar el nivel de anestesia por reflejo pedal y ajuste entrega anestésico si es necesario antes de comenzar la cirugía.
- Inserte un perdigón de 10 días de lanzamiento en la bolsa lateral izquierda preparada con unas pinzas de tejido estéril. Dejar el sedimento en el fondo de la bolsa en una posición plana.
- Evitar el contacto de la pelotilla de líquido y humedad hasta en la bolsa preparada.
- Cierre la piel con suturas de 2-3. Sólo dejar muy corto de los hilos extremos para que sea más difícil para el mouse abrir las suturas royendo.
- Colocar los ratones individualmente a reducir la angustia postoperatoria y para prevenir la apertura de las suturas de la roedura. Mantenga el ratón a la vista hasta que ha recuperado la conciencia suficiente después de narcosis.
Nota: No hay para el tratamiento del dolor postoperatorio ya que esta intervención es bien tolerada sin signos de malestar o dolor. Como alternativa recomendamos analgésicos tópicos, por ejemplo, una gota de bupivacaína en la incisión antes del cierre que proporcionaría hasta 8 h de la analgesia.
3. evaluación para el modelo de inducción, signos de síndrome nefrótico y bienestar
- Recoger orina de la mañana (8:00) en un recipiente de reacción (1.5 mL) cada día desde el día de la inyección por masaje de la vejiga.
- Medir proteinuria usando análisis de la proteína de Bradford y normalizar a creatinina.
Nota: Para la inducción del síndrome nefrótico, proteinuria debe alcanzar un umbral de creatinina de 120 mg/mg entre los días 7 y 10 después de la doxorrubicina inyectable.
- Medir proteinuria usando análisis de la proteína de Bradford y normalizar a creatinina.
- Buscar el desarrollo de ascitis. Si hay aumento de circunferencia abdominal o flancos sobresaliente.
- Pesar el ratón, los pellets de alimento y la botella de consumición de la mañana (8:00) todos los días.
- Comprobar bienestar al menos una vez al día mediante una hoja de puntuación según Morton y Griffiths et al. 16
4. medición de la proteasa de serina urinaria con un ensayo cromogénico
- Preparar solución de sustrato de trabajo añadiendo 15 mL de tampón de fosfato estéril salino (PBS) a una botella de 25 mg de liofilizado sustrato cromogénico S-2251, produciendo una concentración de 2 mM. Aprotinina en PBS para obtener una solución de aprotinina con una concentración de 2 mg/mL se disuelven.
- Almacene las soluciones preparadas a-20 ° C. Esto disminuye significativamente la degradación automática de S-2251. No utilice viejas soluciones con un fuerte tono de amarillo.
- Utilizar solución de trabajo de sustrato recién preparado o descongeladas y caliente en una cámara de calor de 37 ° C.
- Descongelar las muestras de orina a temperatura ambiente.
- Evitar la degradación de la proteasa por evitar descongelar y congelar repetidos. Almacenar las muestras de orina a-20 ° C.
- Utilice una placa de 96 pocillos adecuada para la medición fotométrica. 3 μl de orina sin diluir en cada uno de los dos pozos y añadir 50 μl de solución de trabajo de sustrato con 3 μl de PBS o aprotinina solución a los pozos. Cubra la placa con un sellador de placas.
- Incubar la placa de micropocillos cubierto de 60 minutos en una cámara de calor de 37 ° C.
- Medir la densidad óptica de cada pocillo a 450 nm utilizando un lector de microplacas.
- Tener la diferencia entre el OD sin aprotinina y con aprotinina como urinario sensible a la aprotinina serina proteasa.
Nota: Medición de una muestra pareada con y sin aprotinina aumenta la especificidad del ensayo ya que el substrato también podría ser troceado por otras proteasas que desempeñan un papel fisiopatológico.
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Resultados
Después de la inducción de la narcosis de isoflurano, doxorrubicina se inyectó rápidamente vía el seno izquierdo retrobulbar. El volumen total de 7.25 μl/g bw inyectó sin ninguna resistencia y extravasación demostrando corrigen intravenosa localización de la cánula. El ratón de narcosis se recuperó rápidamente y no tenía ningún deterioro en ese día y después de eso. Particularmente, no había señal de daño en el ojo izquierdo. Después de doxorrubicina inyección, comida y líquido producto c...
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Discusión
Aquí, demostramos que la doxorrubicina inyectable vía la inyección retrobulbar del seno induce síndrome nefrótico experimental en ratones 129S1/SvImJ con proteinuria, retención de sodio, hypoalbumenia y la hiperlipidemia. Sin embargo, hay dos cuestiones fundamentales que han de tenerse en cuenta al utilizar este modelo. En primer lugar, la inducción del modelo es estrictamente dependientes de la dosis y desviaciones de la dosis de doxorrubicina tan pequeñas como 0.3 μg/g afectan la respuesta de los ratones
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Este estudio fue apoyado por una beca de la Fundación de investigación alemana (DFG, AR 1092/2-1).
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| suministros | |||
| BD Micro FINE + U-40 (0,30 mm x 8 mm) | BD Deutschland GmbH, Heidelberg, Alemania | PZN: 07468060 | jeringa |
| ETHILON*II (5/0, 16 mm, 3/8c, 45 cm) | Johnson& Johnson Medical GmbH, Ethicon Deutschland, Norderstedt, Alemania) | EH7823H | sutura |
| Nombre | Empresa | >Número de catálogo | Comentarios |
| reactivos | |||
| aprotinina (6000 KIU/mg) | LOXO, Heidelberg, Alemania | CAS 9087-70-1 | |
| Bepanthen, Augen- und Nasensalbe | Bayer Vital GmbH, Leverkusen, Alemania | PZN: | ungüento |
| Chromogenix S-2251 | HAEMOCHROM DIAGNOSTICA GmbH, Essen, Alemania | 82 0332 39 | sustrato cromogénico |
| doxorrubicina (2.0 y micro; g/µ L) | Cell Pharm, Bad Vilbel, Alemania | CAS 25316-40-9 | doxorrubicina |
| isofluran CP (1 mL/mL) | CP-Pharma, Burgdorf, Alemania | CAS 26675-46-7 | isofluran |
| con liberación sostenida impulsada por matriz (hecho a medida) | Innovative Research of America, Sarasota, FL | X-999 | pellet |
| Name | Company | Número de catálogo | Comments |
| >equipment | |||
| BioTek, Bad Friedrichshall, Alemania | ELx808 | lector de microplacas | |
| MICROSTERIL - 436 | B.M.S., Trescore Balneario, Italia | Esterilizador GAL/436 | |
| Horno de hibridación/ agitador | GE Healthcare UK Limited, Amersham LIFE SCIENCE, Little Chalfont, Reino Unido | RPN 2511 | cámara de calor |
| Thermo MAT Pro 10 W, 15x25 cm, Lucky Reptile | Import Export Peter Hoch GmbH, Waldkirch, Alemania | 61201 | dispositivo de calentamiento de ratón |
Referencias
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