Detección de la pequeña GTPasa Prenilación y GTP obligatorio usar membrana fraccionamiento y GTPasa-linked Immunosorbent Assay

Javad Alizadeh; Shahla Shojaei; Simone da Silva Rosa; Adel Rezaei Moghadam; Amir A. Zeki; Mohammad Hashemi; Marek J. Los; Joseph W. Gordon; Saeid Ghavami

doi:10.3791/57646

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Artículo de método

Detección de la pequeña GTPasa Prenilación y GTP obligatorio usar membrana fraccionamiento y GTPasa-linked Immunosorbent Assay

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DOI:

10.3791/57646

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11 de noviembre de 2018

Javad Alizadeh¹^,² , Shahla Shojaei¹^,²^,³ , Simone da Silva Rosa¹ , Adel Rezaei Moghadam¹^,² , Amir A. Zeki⁴ , Mohammad Hashemi⁵ , Marek J. Los⁶^,⁷^,⁸ , Joseph W. Gordon¹^,⁹ , Saeid Ghavami¹^,²^,¹⁰

¹Department of Human Anatomy and Cell Science, Rady Faculty of Health Sciences, Max Rady College of Medicine, University of Manitoba, ²Biology of Breathing Theme, Children Hospital Research Institute of Manitoba, University of Manitoba, ³Department of Biochemistry, School of Pharmacy and Pharmaceutical Sciences, Isfahan University of Medical Sciences, ⁴Division of Pulmonary, Critical Care, and Sleep Medicine, Department of Internal Medicine, Center for Comparative Respiratory Biology and Medicine, ⁵Department of Clinical Biochemistry, School of Medicine, Zahedan University of Medical Sciences, ⁶Department of Molecular Biology, School of Pharmacy with the Division of Laboratory Medicine in Sosnowiec, Medical University of Silesia, ⁷Centre de biophysique moléculaire - UPR 4301, Centre national de la recherche scientifique (CNRS) CS80054, ⁸LinkoCare Life Sciences AB, ⁹College of Nursing and Children's Hospital Research Institute of Manitoba, Rady Faculty of Health Sciences, University of Manitoba, ¹⁰Health Policy Research Center, Institute of Health, Shiraz University of Medical Sciences

En este artículo

Resumen

Aquí se describe un protocolo para investigar la Prenilación y guanosina-5'-trifosfato (GTP)-carga de la GTPasa Rho. Este protocolo consta de dos métodos detallados, es decir, ensayo de fraccionamiento de la membrana y un GTPasa-ligado del inmunosorbente. El protocolo puede ser usado para medir la Prenilación y GTP carga de diferentes otras GTPasas pequeñas.

Resumen

La familia de Rho GTPasa pertenece a la superfamilia Ras e incluye a aproximadamente 20 miembros en seres humanos. Rho GTPasas son importantes en la regulación de diversas funciones celulares, incluyendo la dinámica del citoesqueleto, motilidad celular, polaridad celular, Guía axonal, tráfico vesicular y el control del ciclo celular. Cambios en la señalización de la GTPasa Rho juegan un papel regulador esencial en muchas condiciones patológicas, tales como cáncer, enfermedades del sistema nervioso central y sistema inmune-enfermedades. La modificación postraduccional de GTPasas Rho (es decir, Prenilación de mevalonate camino intermedios) y la Unión de GTP son factores clave que afectan a la activación de esta proteína. En este trabajo, se proporcionan dos métodos esenciales y simples para detectar una amplia gama de Rho GTPasa Prenilación y actividades de unión de GTP. Detalles de los procedimientos técnicos que se han utilizado son explicados paso a paso en este manuscrito.

Introducción

Rho GTPasas son un grupo de proteínas pequeñas (21-25 kDa), que bien se conservan a lo largo de la evolución y formar una única subfamilia de la superfamilia Ras de GTPasas pequeñas. En cada subfamilia dentro de esta superfamilia, hay un núcleo de dominio compartido G que participa en la actividad de la GTPasa y de intercambio de nucleótidos¹. La diferencia entre la familia de Rho y las otras subfamilias de Ras es la presencia de un "dominio de inserto de Rho" dentro de la 5^th β del filamento y el 4^th α hélice en la pequeña GTPasa dominio².

Basado en la clasificación reci....