Artículo de método

Aislamiento de glándula Mandibular depósito contenidos de Borneo ' explosión de hormigas (Formicidae) para análisis por GC-MS y MetaboliteDetector de Volatilome

DOI:

10.3791/57652

⸱

26 de agosto de 2018

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1Center for Analytical Chemistry, Department of Agrobiotechnology (IFA-Tulln), University of Natural Resources and Life Sciences Vienna (BOKU), Austria, 2Institute of Chemical, Environmental and Biological Engineering, TU Vienna, Austria, 3Department of Computational Biology of Infection Research, Helmholtz Centre for Infection Research, Germany, 4Institute for Biochemistry, Biotechnology and Bioinformatics, University of Technology (TU) Braunschweig, Germany, 52nd Zoological Department, Natural History Museum Vienna, Austria, 6Chemical Sciences, Universiti Brunei Darussalam, Brunei, 7Environmental and Life Sciences, Universiti Brunei Darussalam, Brunei

En este artículo

Resumen

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Menores trabajadores de la especie de hormiga explodens Colobopsis son disecados para aislar el contenido de cera almacenado en sus embalses hipertrofiada glándula mandibular para la posterior extracción de solvente y análisis por cromatografía de gases-espectrometría de masas. También se describe la anotación e identificación de los constituyentes volátiles utilizando el software de la abrir-fuente MetaboliteDetector.

Resumen

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El objetivo de este manuscrito es presentar un protocolo que describe el análisis metabolómicos de Borneo 'hormigas explosivas' perteneciente al grupo Colobopsis cylindrica (COCY). Para ello, la especie modelo C. explodens es usado. Hormigas que pertenecen a la casta de trabajadores menores poseen glándulas mandibulares hipertrofiadas distintivo (MGs). En el combate territorial, utilizan el contenido viscoso de sus embalses de agrandamiento de la glándula mandibular (MGRs) para matar artrópodos rivales en característica suicidas 'explosiones' por la ruptura voluntaria de la gastral tegumento (autothysis). Se muestra la disección de las hormigas obreras de esta especie para el aislamiento de la porción gastral de los contenidos MGR de cera así como listado de los trámites necesarios para la extracción de disolvente de los compuestos volátiles contenidos en el mismo con posterior gas Análisis de cromatografía-espectrometría de masas (GC-MS) y supuesta identificación de metabolitos contenidos en el extracto. El procedimiento de la disección se realiza bajo condiciones de frías y sin el uso de cualquier solución de tampón de disección para minimizar los cambios en la composición química de los contenidos MGR. Después de la extracción de disolventes de metabolitos volátiles contenidas en ella, las medidas necesarias para el análisis de las muestras mediante líquido-inyección-GC-MS se presentan. Por último, procesamiento de datos e identificación de metabolito putativo con el uso del software de código abierto se muestra MetaboliteDetector. Con este enfoque, el de perfiles e identificación de metabolitos volátiles en MGRs de hormigas pertenecientes a la COCY grupo mediante GC-MS y el software de MetaboliteDetector llegado a ser posible.

Introducción

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El objetivo general del flujo de trabajo presentado aquí es la investigación general de composiciones químicas en las secreciones de los insectos. Esto se hace con el principal objetivo de elucidar las funciones ecológicas de la secreción en su conjunto, o de sus compuestos individuales. Por otra parte, estamos interesados en investigar las vías metabólicas subyacentes los compuestos encontrados en las secreciones respectivas. Especialmente glándula contenido de hormigas (Hymenoptera, Formicidae) ha adquirido creciente interés en los últimos años, ya que proporcionan las fuentes hasta ahora inexploradas compuestos potencialmente bioactivos (colas, antimicrobianos, etc.)1, 2. menor obreras de algunas especies pertenecientes al grupo COCY3,4 pueden proporcionar tales compuestos contenidos en sus gerentes hipertrofiados que se extienden desde las piezas bucales al gaster5,6. Cuando amenazado por enemigos putativos, menores trabajadores de explodens C.7 y algunos relacionados con la especie puede hacer uso de su Gerente de contenidos de una manera inusual: se sacrifican por la ruptura de su pared gastral para expulsar el contenido pegajoso de la MGRs explosivamente hacia el oponente, con lo cual el supuesto enemigo es detenido y puede incluso morir5,6,8,9. El propósito del desarrollo y el uso de los métodos presentados aquí fue ayudar a mejorar la comprensión de la composición química y el carácter de tentativo tóxicos componentes de esta secreción de ant.

Para ello, presentamos un protocolo para la disección de C. explodens obreras para obtener la porción gastral de contenido similar a la cera MGR con posterior extracción de solvente y análisis por GC-MS.

Análisis por GC-MS es uno de los métodos bien establecidos para la generación de perfiles e identificación de metabolitos volátiles (volatilome) de los insectos. Típico analitos de interés en las hormigas incluyen hidrocarburos cuticulares10, semioquímicos11y en general, los compuestos con actividad biológica12. Las muestras pueden obtenerse de animales enteros o de partes del cuerpo y fluidos aislados mediante disección de los insectos13,14. Técnicas de preparación de muestra incluyen la extracción de los metabolitos contenidos en el mismo con el uso de solventes14 o headspace-sólido--microextracción en fase (HS-SPME)15.

Estudios metabolómicos, es vital que las muestras se congelan rápidamente directamente después del muestreo, con el fin de minimizar los cambios en la composición química y cantidad de los compuestos. Las hormigas utilizadas para este estudio fueron muertas por congelación rápida in situ en un bolso fresco relleno con paquetes fríos congelados. Luego, las muestras se almacenaron en un congelador de-20 ° C usando generador impulsado por energía eléctrica, antes de que fueron transportadas al laboratorio en hielo seco. El procedimiento de disección presentado aquí ofrece la posibilidad de aislar el contenido MGR sin analizar la hormiga entera o el gaster como un todo, como lo ha hecho antes para diferentes COCY especies16,17,18. Por otra parte, el protocolo presentado también permite acceso directo y análisis de las glándulas y los tejidos, como el veneno de la glándula (VG)5,8, de (DG) de la glándula de Dufour8o los intestinos en otros estudios biológicos, o alrededores Busque posibles Cruz-contaminaciones durante el manejo o la disección de las hormigas. Para minimizar los cambios en la composición química de los contenidos MGR durante la disección, la descongelación de las muestras o mediante el uso de productos químicos, se optimizó el proceso de disección para llevarse a cabo en un envase en frío (-20 ° C), sin el uso de cualquier reservas adicionales, soluciones de lavado, o disolventes. Las muestras obtenidas mediante este método son adecuadas para responder a preguntas cualitativas y cuantitativas.

Análisis de los datos con el propósito de identificación y anotación de metabolito putativo se hace vía el software de la abrir-fuente MetaboliteDetector19, que fue desarrollado para el análisis automático de datos de la metabolómica basada en GC-MS. Detecta solo iones presentes en los cromatogramas, realiza un paso de deconvolución y extractos de los espectros de masas deconvoluted de los compuestos químicos contenidos en las muestras analizadas. Supuesta identificación de compuestos con MetaboliteDetector se basa en el índice de retención determinado (RI; la poder de Kovats RI calculados automáticamente por el software) así como la similitud de los espectros de masas deconvoluted. RI y el factor de coincidencia espectral pueden ser Cruz-comprobado contra cualquier bibliotecas existentes (que se puede importar, si están en el formato común del NIST), o una biblioteca interna establecida. Esto es de acuerdo a las directrices para la (supuesta) compuesto identificación sugerida, por ejemplo, por la química análisis trabajo grupo (CAWG) de la iniciativa de estándares de metabolómica (MSI), donde un mínimo de dos datos independientes y ortogonales en relación con un compuesto auténtico (aquí retención tiempo (RT) /RI y espectro de masa) analizaron bajo idénticas condiciones experimentales se proponen como necesarias para confirmar la no novela metabolito identificaciones20.

Se lleva a cabo el experimento completo sobre el contenido MGR de la especie modelo COCY explodens C., pero los pasos de la disección también pueden ser adaptados para aislar las glándulas presentes en el gaster de la hormiga. Por otra parte, mientras que se presenta un protocolo para el análisis integral de la volatilome de los contenidos de la MGR, las piezas más genéricos del flujo de trabajo que describen la extracción, medición de GC-MS y la evaluación de datos pueden usarse para el análisis y (supuesta) identificación de los metabolitos volátiles en general.

Puesto que los experimentos descritos en este manuscrito se llevan a cabo en los insectos, no aprobación ética se requiere. Trabajo de campo, muestreo de las hormigas, así como su uso para la publicación están de acuerdo con las directrices de este proyecto a través de la Universiti Brunei Darussalam, la investigación y el Departamento Forestal centro de innovación y de Brunei, Brunei de Brunei Darussalam.

Protocolo

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1. colección de hormigas

  1. Recoger hormigas menores con el uso de un aspirador (figura 1).
  2. Inmediatamente después del muestreo, fijar las hormigas por congelamiento rápido a-20 ° C y guardarlas en esto o una temperatura más baja hasta su análisis.

2. aislamiento de los contenidos MGR y DG de hormigas

  1. Antes de la disección de las hormigas, preparar lo siguiente:
    1. Limpie el plato de Petri de vidrio y los instrumentos de disección utilizando una mezcla de agua y metanol (MeOH/H2O; 1 + 1 v/v) y los tejidos.
      PRECAUCIÓN: MeOH es tóxico para los seres humanos. Siempre usar guantes adecuados, una bata de laboratorio y gafas protectoras y realice la limpieza bajo una campana de humos.
    2. Congelar el envase en frío y el vidrio de Petri a-20 ° C.
    3. Determinar las masas de 1,5 mL viales de rosca corta incluyendo tapones con septos del silicón/politetrafluoroetileno (PTFE) y mantener en hielo al lado del microscopio.
      Nota: La elección de la cubeta de la muestra es opcional. Aquí, el contenido MGR se pone directamente en frío 1.5 mL frascos de vidrio. Los plásticos pueden contener compuestos (por ejemplo, los ftalatos) que pueden causar artefactos, que interfieren con las señales de los metabolitos de destino.
    4. Coloque el envase en frío congelado en una caja de espuma de poliestireno extruido. Coloque el plato Petri en la parte superior del envase en frío y una hormiga congeladora en el plato. Monte la caja debajo de un microscopio estéreo. Ajuste la ampliación (20 – 40 X) y el enfoque hasta que la hormiga entera puede verse claramente.
  2. Compruebe la hormiga congeladora por la integridad de sus compartimientos gastral. De disección, tome solamente a las hormigas con una región intacta gaster (figura 2A, B). Excluir a las hormigas con gasters planas o rastros de endurecido contenido MGR en sus superficies corporal de mayor análisis (figura 2, D).
  3. Coge la hormiga seleccionada con un par de pinzas de punta fina en el propodeum (primer segmento abdominal) y con el otro par de pinzas en el peciolo (segmento segundo abdominal). Suelte la región gaster tirando suavemente lejos del resto del cuerpo de hormiga (Figura 3A).
  4. Fijar el gaster de la hormiga ahora separados sosteniendo con unas pinzas de punta fina en el tergito 4. Con otro par de pinzas de punta fina agarra tergito 1 (ubicado al lado del peciolo) y quitarlo suavemente desprendiendo (figura 3B). Repita esto también para tergitos 2 y 3 (figura 3, D) hasta la porción gastral de los gerentes (coloreado de amarillo en C. explodens obreras, pero el color del contenido de magnesio puede variar desde blanco sobre amarillo a rojo en otras especies) es visible para la mayoría parte.
    Nota: Al eliminar el exoesqueleto, la membrana de la MGR también en parte desaparecerá.
  5. Por el uso de una aguja de disección, retire con cuidado el contenido similar a la cera de los gerentes emparejados por rascarse fuera del compartimiento gastral (figura 3E). Eliminar sólo aquellas partes del contenido MGR que pueden ser aislados sin ruptura de otras glándulas presentes en el gaster de la hormiga. Si más fuerza o esfuerzos tienen que aplicarse para obtener el contenido MGR en su conjunto, aceptar su retiro incompleto (figura 4).
  6. Recoger el contenido MGR tocándolos suavemente con la punta de la aguja de disección hasta que se pegan a él. Luego transferir el contenido MGR en un frasco de rosca corta 1.5 refrigerado con conocida Tara masa.
    1. Para quitar el pegajoso contenido MGR de la punta de la aguja de disección, mover la punta de la aguja a la pared de la cubeta de la muestra y mancha en la pared. Cerrar el frasco y coloque en hielo hasta que el próximo contenido MGR es aislado.
  7. Para más tarde comprobar la posible contaminación de la muestra contenida de MGR compuestos procedentes de la DG adyacente (sección 6), también recopila DGs de las hormigas, están todavía intactos (figura 4) y ponerlos en un frasco separado de HPLC.
  8. Siempre limpie el plato de Petri y los instrumentos de disección con MeOH/H2O (1 + 1 v/v), al cambiar de la glándula de glándula o de la hormiga a la hormiga.
  9. Para una muestra analítica, combinar el contenido de depósito o de las glándulas de varias hormigas.
    Nota: El número de glándulas o de su contenido que se utiliza para una muestra analítica puede variar dependiendo del diseño del experimento. Aquí contenido de gerente o directores generales de cinco hormigas se combinaron para obtener una muestra analítica.

3. solvente de extracción de contenidos aislados de la glándula

  1. Determinar las masas de las muestras analíticas (aquí, MGR contenidos o glándulas adyacentes de cinco hormigas).
  2. Agregar acetato de etilo de alta pureza helado (EtOAc) en una proporción constante de 1:14 w/v y agitar las muestras durante 5 minutos en condiciones de frías; aquí, realizado en 7 ° C en un laboratorio termostatizado.
  3. Centrifugar las muestras durante 10 min a 3.820 x g a 7 ° C y transferir el sobrenadante (sobre 55 – 75 μl de extracto contenido MGR de cinco hormigas) en 1.5ml previamente enfriado corta hilo frascos conteniendo 0,1 mL micro-insertos. Sellar bien los frascos con tapas de rosca que contiene agujeros y septos rojos de goma/PTFE.
    Nota: Si el análisis no pueden llevarse a cabo inmediatamente, mantenga el extracto a-80 ° C hasta el análisis, pero se recomienda analizar las muestras inmediatamente después de la preparación para minimizar el riesgo de alteraciones químicas durante el ciclo de congelación/descongelación.

4. GC-MS

  1. Para una secuencia completa de medición de GC-MS, preparar las siguientes soluciones, cada uno en un frasco de rosca corta de 1.5 mL:
    1. Preparar una mezcla de calibrant RI diluyendo las soluciones estándar de alcano disponibles comercialmente a una concentración final de 8 mg/L por compuesto usando hexano.
    2. Preparar un blanco de disolvente consistente en EtOAc puro.
  2. Lugar los viales que contienen 1) solvente en blanco, 2) RI calibrant mezcla, contenido 3) MGR de extracto y contenido 4) DG extracción en la bandeja refrigerada (10 º C) de los muestreadores acoplada a la cromatografía de gases (GC).
    Nota: Se recomienda reducir al mínimo el intervalo de tiempo que cada frasco se mantiene en el inyector automático antes de la medición. Para las muestras críticas, como la muestra del contenido de MGR, el frasco se puede colocar en el automuestreador inmediatamente antes del análisis.
  3. Para cada muestra, inyectar una alícuota de 1 μL en la GC-MS para la separación cromatográfica en una columna conveniente para los compuestos de la blanco (aquí: columna HP - 5MS UI).
    1. Establecer los parámetros adecuados de la GC, que pueden verse como sigue:
      1. Utiliza helio como gas portador y establecer un flujo constante de columna de 1 mL/min conjunto una rampa de temperatura de horno a partir de 40 ° C con una espera de 2 min, seguido de una rampa de 10 ° C/min hasta 330 ° C, con un tiempo de espera de 7 minutos ajustar la temperatura de entrada a 270 ° C.
      2. Elegir y si es necesario, ajustar las proporciones de split para la inyección de GC-MS que resultan en formas de pico adecuada e intensidades para los compuestos de interés (figura 5).
        Nota: En el ejemplo presentado es necesario medir el extracto DG en un split de 2:1 y la mezcla de calibrant RI en modo splitless. Se analizó el extracto contenido de MGR en un cociente de la división de 2:1 y una segunda vez a 50: 1.
      3. Ajuste la temperatura auxiliar en 350 ° C.
    2. Establecer los parámetros del espectrómetro de masas (MS) como sigue: MS Fuente de temperatura 230 ° C, temperatura de MS Quad 150 ° C, rango de exploración de baja masa 30 a 500, solvente de alta masa retardo 4.1 min (para muestras en blanco de disolvente y experimentales) o min 6,1 (para mezcla de calibrant RI) , respectivamente. Establecer la frecuencia de barrido a aproximadamente 3 exploraciones/s.
      Nota: Los parámetros de la MS, especialmente los MS scan-, tasa de muestreo y tiempo de ciclo puede afectar cosecha pico y deconvolución de espectro y deben considerarse al seleccionar la configuración de los parámetros para la evaluación de datos adecuada con el software MetaboliteDetector.
  4. Cuando se haya completado la medición, exportar los datos como. AIA proyecto archivo (aquí se realizan con el uso del software de análisis de datos con el GC) en un dispositivo de almacenamiento portátil de datos.
    1. Seleccione archivo | Exportar datos a formato AIA..., entonces Compruebe crear nuevo directorio y haga clic en Aceptar. Seleccione la ubicación de almacenamiento deseado (por ejemplo, unidad flash USB) y haga clic en abrir. Seleccione los archivos que se exportan y golpear el icono ---> . Confirmar con clic en proceso.

5. metabolito detección e identificación con el uso de Software MetaboliteDetector

  1. Antes de iniciar el análisis de los archivos de datos, abrir MetaboliteDetector, elija Herramientas de | Configuración dey establecer los parámetros necesarios como sigue (hojas individuales de MetaboliteDetector se indican en negrita):
    1. En la hoja de apariencia, establece la escala de tiempo en minutos y habilitar la opción de etiquetas de ejes.
    2. En la hoja de deconvolución, establecer los parámetros para la configuración máxima: umbral máximo: 10 y altura mínima de pico (unidades de ruido): 10. Desactive permitir ajuste de línea de base. Establecer los parámetros para que la detección de metabolitos: contenedores/Scan: 10, ancho de deconvolución (scans): 5, requiere intensidad (% del pico base): 0 y el número de picos: 10.
    3. En la hoja de identificación, defina la opción de búsqueda biblioteca: compuesto de la Lib: 'CalibrationLibrary_Alkanes' y NIST (una librería de sqlite y NIST puede incluirse en el formato .lbr). Establecer los parámetros como sigue: Max. Diferencia de RI: 10, puntuación de corte: 0,9, puro/impuro composición: 0,5, número de fragmentos: 2, número mínimo de fragmentos idénticos: 1. uso escala lib: marcada; Puntuación de similitud: Similitud de espec.; Filtro de masa: m/z 207, 221, 281, 355 y 1147 (para conocidos contaminantes derivados de la fase estacionaria de la columna de GC).
    4. En la hoja de cuantificación establece los parámetros en: número de iones de cuantificación: 3, mínima distancia entre los iones siguientes: 5 y el índice de calidad requerida mínima: 1. excluir los iones de cuantificación, 207, 221, 281, 355 y 1147.
      Nota: En caso de datos de MS de alta resolución, además establecer los parámetros siguientes en la hoja de centroide a: umbral pico comenzar: 10, final de umbral pico: -5 y la distancia máxima de la línea de base: 30, FWHM: 0.5.
  2. Importar los archivos en el. Formato CDF en el generado. Archivo de proyecto de AIA como. NetCDF en el software MetaboliteDetector al seleccionar archivo | Importación | NetCDF importación. Elija el icono en forma de carpeta y luego seleccione los archivos para las categorías de la muestra a ser importados y procesados: 1) solvente-blank, calibradores 2) RI, extracto contenido 3) MGR y extracto contenido 4) DG. Confirme con OK para iniciar el procesamiento de datos. Después de procesar, seleccione cerrar en la ventana que aparece.
  3. Para la calibración de RI y determinación de los valores de RI para compuestos contenidos en el extracto MGR, seleccionar archivo | Abierto y elegir el archivo que contiene los datos de los calibradores de RI.
    1. Después de abre el archivo de calibrant RI, seleccione el icono de la lupa . Confirmar la ventana que aparece con OK.
    2. Para la correcta calibración de RI, compruebe el rango de alkanes detectables en el archivo de calibrant RI.
      1. Para ello, seleccione el triángulo que aparece por debajo del máximo del primer pico, origina el primer alcano (con la RT más bajo, figura 6) detectable haciendo clic una vez sobre él.
      2. Compruebe el golpe con la mayor similitud de espectro (espec. sim., máxima puntuación = 1) en comparación con las entradas de la biblioteca de alcano (figura 6).
      3. Para verificar la identidad del alcano sugerido compuesto, comparar su espectro de masas para el espectro de masas en la literatura, por ejemplo, NIST Química WebBook22.
      4. Determinar el alcano última detectable en la mezcla de calibrant RI contando hasta el último pico de alcano que aparecen en el cromatograma.
    3. Para la calibración de la RI, seleccione Herramientas de | Asistente de calibración RI. Seleccione siguiente.
    4. Haga clic en el icono en forma de carpeta y seleccione el archivo que contiene el cromatograma de la mezcla de calibrant RI. Seleccione siguiente.
    5. Seleccione la biblioteca que contiene las entradas de los calibradores de alcanos en la ventana aparecida.
    6. Seleccione las entradas de la biblioteca de todos los alkanes detectables en el archivo de calibrant RI y haga clic en el >> icono. Después de seleccionar >>, elija siguiente.
    7. Compruebe el RTs listado para cada alcano detectable en la tabla que aparece. Para ello, compruebe el RTs representado en la ventana principal de cada alcano haciendo clic en el triángulo respectivo (figura 7). Si es necesario (figura 8), corrige la RT en la tabla de calibración manualmente haciendo doble clic en el campo respectivo, seleccionando el menú desplegable y que sugirió el correcto RT. alternativamente, escriba en el RT con la ayuda de la (teclado Figura 9).
    8. Cuando la RT para cada alcano es correcto, seleccione siguiente. Haga clic en siguiente en la ventana emergente que muestra la tabla de calibración de RI.
    9. Seleccione el símbolo verde + en la ventana de Selección del cromatograma que aparece, elija el archivo de datos de la solvente-en blanco y los archivos de la glándula extractos y seleccione siguiente. Ajuste la configuración de los parámetros en la ventana que aparece como sigue: desactivación del ajuste de línea de base, pico umbral: 5, altura mínima: 5, contenedores/Scan: 10 y la anchura de la deconvolución: 5. golpe siguiente y luego comenzar a realizar el cálculo de la RI de los compuestos contenidos en los archivos de la muestra seleccionada.
  4. Para la anotación y la identificación de los metabolitos solicitados en el extracto MGR, abra el archivo de datos de medida extracto contenido MGR, para que la RIs se han calculado como se describe anteriormente (paso 5.3.9), seleccionando archivo | Abierto y elegir el archivo de datos deseado.
    1. Seleccione Herramientas de | Configuración | Deconvolución y cambiar el umbral de máxima como la mínima altura (unidades de ruido) ambos a 5. Seleccione el icono de la lupa y confirme la ventana de advertencia que aparece otra vez con OK.
    2. Haga clic en un triángulo que aparece debajo de un máximo de un pico de interés y comparar su espectro de masas con los almacenados en la biblioteca NIST seleccionando el icono NIST .
    3. Seleccione el primer éxito resultante de la búsqueda de NIST (figura 10).
    4. Si la similitud de espectro resultante del compuesto de interés está por encima de la puntuación de similitud espectro elegido (aquí ≥ 0.9) en comparación con una entrada de NIST (figura 10), busque la RI (similar fase estacionaria de la columna GC, el espesor de la película y la columna diámetro) para este compuesto en la literatura (p. ej., NIST Química WebBook22).
    5. Calcule la diferencia relativa entre la referencia NIST RI (o el promedio RIs cuando se dan varios valores de RI) y el RI derivado experimentalmente. Si la diferencia es igual o menor que el especificado por el usuario máximo tolerado valor (aquí, ≤ ±1%), designar el compuesto como 'anota'.
    6. Repita los pasos 5.4.2–5.4.5 para todos los compuestos de interés contenida en el archivo de muestra MGR.
    7. Para la identificación de compuestos, comparar la RI y la espectrometría de masas de las soluciones estándar (por ejemplo, 2-100 mg/L) medidos en las mismas condiciones como se describe en la sección 4 a aquellos de los compuestos anotados.
    8. Analizar la norma tal como se explica en la sección 4 y procesar los datos como se describe para el alcano y datos de contenido de la glándula MGR en pasos de 4.4 y 5.2.
    9. Calibrar los datos obtenidos de la norma mediante la selección de herramientas | Asistente de calibración RI | Próximo y elegir el mismo archivo de calibrant RI como antes. Seleccione siguientey luego otra vez siguiente y seleccione el archivo que contiene los datos adquiridos de la solución estándar haciendo clic en el símbolo verde + . Golpe siguiente y luego empezar a calcular la RI para el compuesto estándar.
      Nota: Si el análisis de la norma no puede realizarse sin demora después de análisis de la muestra, se recomienda analizar calibradores RI otra vez y realizar nueva calibración de RI y el cálculo de la norma.
    10. Abra el archivo respectivo de la norma y confirman su identidad por comparación de su espectro con la biblioteca NIST como se explica en el paso 5.4.2.
    11. Después de la confirmación de la identidad de la norma, añadir el espectro de masa y RI del estándar del compuesto a la biblioteca interna. Para ello, haga clic en el símbolo verde + e introduzca el nombre preferido de la entrada de la biblioteca. Confirme con OK para añadir el espectro de masas y la RI del estándar del compuesto a la biblioteca. Si la nueva entrada no puede verse en la biblioteca, activar el botón Actualizar .
      Nota: Si la calibración de RI fue realizada con éxito, el RI determinado por MetaboliteDetector aparecerán en la respectiva entrada de la biblioteca. Después de crear la entrada de la biblioteca de la norma, la identificación de este metabolito en el extracto de MG se basa en una combinación de RI y similitud de espectros es posible.
    12. Vuelva a abrir el archivo de datos de contenido de MGR. Seleccione Herramientas de | Configuración | Identificación. Ahora, como la RI del compuesto estándar se calcula y se agrega a la entrada de la biblioteca, cambiar la Puntuación de similitud de Espectro parecido a Puntaje combinado.
    13. Haga clic en el icono de la lupa y seleccione el triángulo debajo el compuesto que ha sido anotado en el paso 5.4.5.
    14. Haga clic en el golpe y compruebe el valor dado para el 'puntaje total semejanza' (OSS, abreviado por Detector de metabolitos como 'General simil.'), teniendo en cuenta una combinación de espectro semejanza y similitud de RI puntuación (figura 11).
      Nota: Si un golpe se encontró en la biblioteca interna, se mostrará en el lado derecho de la ventana principal.
    15. Si el OSS está por encima del umbral definido por el usuario (aquí ≥ 0.9, también indicado por el color verde del triángulo), designar el compuesto como 'identificados' (figura 11).

6. verificación del extracto contenido de MGR de contaminaciones por el contenido de la dirección general

  1. Abra el archivo calibrado de la muestra de la dirección general para que el RIs de los compuestos ya se han calculado con MetaboliteDetector (paso 5.3.9).
  2. Para un recubrimiento del cromatógrama obtenido después de la medición de la muestra contenida de MG y la muestra DG, seleccione Herramientas de | Cromatograma de recubrimiento y elija los dos archivos respectivos mediante el icono verde + . Confirme con OK.
  3. Para ver la superposición, seleccione la hoja de Superposición del cromatograma que aparece en la parte inferior de la ventana.
  4. Verifique superposición de compuestos entre el contenido MGR extracto (figura 12) y el contenido de la dirección general extraer y excluir superposición compuestos de más análisis de contenido MGR.

Resultados

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Un flujo de trabajo esquemático los pasos experimentales para identificación de metabolitos putativo en las secreciones de la glándula de C. explodens el listado se muestra en la figura 13. Además, se proporciona una descripción esquemática de las partes del cuerpo más importante de hormigas COCY utilizadas para el experimento presentado como suplementario S1 de la figura A, B. Los pasos principales de la disección de las hormigas hasta identificación de metabolitos putativos en el contenido MGR se ilustran en el Suplementario S2 figura.

Para aislar el contenido MGR de volatilome análisis, un estado refrigerado se mantuvo a lo largo de transporte, almacenamiento y también durante el proceso de disección. Con este fin, las hormigas fueron congeladas inmediatamente después de su colección con el uso de un aspirador de insectos (sección 1 y figura 1) en situ. Después del almacenaje por 2 días en un congelador de-20 ° C, las muestras de la hormiga fueron transportadas en hielo seco a Austria, donde fueron puestos inmediatamente a-80 ° C hasta su análisis posterior. Apto para ser elegido para el aislamiento de su contenido MGR de hormigas exhiben una región gaster que es redonda e intacto (figura 2A) y en el mejor caso surtido con contenido de Monseñor, como lo indica el Gerente visible entre los tergitos (Fig. 2B). Gasters de hormigas que no son adecuadas para su posterior análisis se muestran en la figura 2, D. Los principales pasos (pasos 2.3-2.6 involucrados en el proceso de aislamiento de los contenidos MGR de hormigas COCY) se ilustran en la figura 3. Los contenidos aislados de MGR (amarillo en el caso de C. explodensy colores puede variar de blanco a rojo en otras especies pertenecientes al grupo de COCY) se muestran en la figura 14.

Cuando las hormigas por su contenido MGR de disección, se debe tener cuidado para no pinchar o romper otras glándulas o los intestinos (paso 2.5). La figura 4 muestra un gaster de la hormiga disecada que todavía contiene las dos otras, intactas glándulas (DG y VG) después de aislamiento de los contenidos MGR. En la figura 15se muestra un ejemplo de contaminación visible por el contenido de los intestinos de la hormiga. Puesto que la contaminación con el contenido de la DG, situado debajo de la MGR, no puede evitarse totalmente, se representa una parte del protocolo para analizar estas glándulas para la comparación de las señales resultantes con las señales del extracto contenido MGR (sección 6). Cuando el procedimiento de la disección se realiza correctamente, es posible obtener alrededor de 0.75-1.2 mg de contenido en MGR por ant. Para el protocolo descrito aquí, contenido MGR de cinco hormigas se combinaron para recibir muestras repetitivas de 3.9-5.9 mg cada una.

El contenido del depósito aislado de la glándula se extrae con EtOAc (sección 3) y analizado por GC-MS (sección 4). Resultados de la medida del extracto contenido de MG del C. explodens obreras en un cromatograma consta de picos y espectros de masas de decenas de supuestos compuestos contenidos MGR (figura 5). Los dos metabolitos dominantes 1-(2,4,6-trihydroxyphenyl)-ethanone (ID 4) y 5,7-dihydroxy-2-methylchromen-4-one (ID 5) en el extracto contenido de MG causado la sobrecarga de la columna, razón por la cual se analizó la misma muestra partido otra vez en una mayor proporción de 50: 1 ( Figura 5, inserción). Posible contaminación cruzada con el contenido MGR por componentes de la dirección general por ejemplo, sería visible como adicionales picos en el cromatograma GC-MS que RTs finales, a partir de unos minutos 29 (figura 12). Exclusión de picos cromatográficos y espectrometría de masas de compuestos también se encuentra en el solvente blanco, originario de la fase estacionaria de la columna de GC o de contenidos de la DG en el gaster de la hormiga y posterior procesamiento con el MetaboliteDetector software resultó alrededor de 110 MGR contenido de compuestos con una señal de ruido relación ≥ 10. Para posterior anotación de metabolitos e identificación con el software MetaboliteDetector, los cromatogramas fueron calibrados y se determinaron los valores de RI para los archivos de muestra medido (paso 5.3 y subpasos, figura 6, figura 7 , Figura 8 , Figura 9). Los metabolitos contenidos detectados supuestos MGR fueron anotados basado en una combinación de similitud de espectro a la biblioteca NIST, que forma parte integrante del software MetaboliteDetector en el ejemplo presentado (paso 5.4 y subpasos, figura 10 ). Además, RI los valores encontrados en la literatura para la fase estacionaria igual o comparable, espesor de la película y el diámetro de la columna de GC se consideraron para anotación compuesto (pasos 5.4.4 y 5.4.5). Después de establecer criterios que emparejan y confirmación de los espectros de masas mediante el uso de estándares, como se explica en la sección de protocolo para un estándar de compuesto (pasos 5.4.7-5.4.15 y figura 11), fue posible confirmar la identidad de unos 10 % de los metabolitos detectados. Desde un informe detallado sobre la volatilome del contenido de C. explodens MGR se publicará en otro lugar, el presente estudio centrado en los metabolitos que ya se han descrito en una publicación anterior por Jones et al. 17 (especies aquí señalado como KB02-108; ver también Cook et al. 23). la tabla 1 proporciona una visión general de estos compuestos identificados.

Diagrama de configuración experimental de un tubo mallado con T1 y T2 en sistema de cromatografía.
Figura 1: esquema de un aspirador de insectos. En una tapa que sella un frasco o envase, se hacen dos agujeros donde se colocan dos tubos flexibles a través de. La apertura de un tubo (T1) que mira hacia el interior del frasco se sella con una malla lo suficientemente fina para bloquear los insectos. Además, se hacen agujeros en el tubo para facilitar el intercambio de aire. El extremo del tubo T2 es apuntado cerca hacia los insectos que se aspiran en el frasco de muestreo por aspiración a través de T1. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Diagrama de segmentación del abdomen de las hormigas con tergitos etiquetados T1-T5; Análisis microscópico a escala de 1 mm.
Figura 2: intacta versus gaster roto. (A) gaster intacto conveniente para la disección. (B) gaster intacta casi completamente llena de contenido MGR, también conveniente para la disección. (C) y (D) roto gasters de hormiga con contenido MGR expulsado y endurecido (amarillo), posiblemente rotos durante la ruptura del tegumento gaster durante el muestreo. Estas hormigas están excluidas de la disección, extracción y posterior análisis. T: terguito. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Proceso de disección del abdomen de insectos, imagen de microscopio, identificación de herramientas, segmentos marcados T1-T4.
Figura 3: principales pasos en el proceso de disección. (A) separación de región gaster del resto del cuerpo de hormiga. (B) pelar el exoesqueleto: tergito 1 tergito 2 (C) y terguito 3, después de que el contenido de los emparejados MGRs de color amarillo es casi completamente visible (D). (E) eliminar el pegajoso contenido MGR con la ayuda de una aguja de disección. T: terguito. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Imagen micrográfica de la anatomía de Drosophila diseccionada que muestra glándulas (DG) y vesículas (VG), marcadas.
Figura 4: gaster de la hormiga después de aislamiento contenido MGR. Las dos glándulas presentan en el gaster (VG: glándula de veneno y DG: glándula de Dufour) puede ser visto. Después del retiro del contenido MGR (restos después de aislamiento puede ser visto en amarillo), ambos compartimientos deben estar intactos. Estas glándulas pueden ser analizadas en la misma forma que el contenido MGR. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Gráfico de cromatografía, que muestra la abundancia de compuestos frente al tiempo de retención, destacando los picos de noreugenina.
Figura 5: Representante ion total actual (TIC) cromatograma del extracto contenido de MGR. Los dos picos más abundantes de GC-MS resultaron más simétricamente en forma de picos cromatográficos, cuando un cociente más alto de la fractura (50: 1) fue elegido en lugar de la regular proporción 2:1 (ver recuadro). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Resultados de la cromatografía de gases; Tiempo de retención y análisis espectral para compuestos alcanos, m/z 128.
Figura 6: determinación de primer alcano detectable en el cromatograma de RI calibrant. Se selecciona el triángulo bajo el máximo pico del primer pico de alcano. El alcano elutes min 6,31 y muestra la mayor similitud de espectro (aquí, espec. sim.) para la entrada de la biblioteca 'Alkane_C09'. Para confirmar la identidad de alcano, se compara el espectro de masas a una biblioteca (p. ej., NIST Química WebBook22). En el ejemplo presentado, nonano es identificado por su ion molecular con un valor de m/z de 128. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Gráfico de cromatografía con tabla de calibración; Análisis del tiempo de retención para la separación de compuestos.
Figura 7: calibración de RI con el uso de una mezcla estándar del n-alkane. El calibrant RI se ha abierto el archivo de datos y la función de 'RI-calibración-Wizard' elegido. Debe revisarse la adecuación correcta del tiempo de retención a la RI en la tabla de calibración. El RT de 6,31 min para alkane_C09 (nonano) se muestra correctamente en la tabla. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Análisis de cromatografía de gases; Diagrama de tiempos de retención de compuestos y datos de calibración para alcanos.
Figura 8: RTs se muestran en la tabla de calibración mal. El RTs no se muestran correctamente (ya sea demostrado por un valor de RT incorrecto o por un valor de RT falta aparece como -1). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Análisis de cromatografía; Gráfico TIC; configuración de calibración; datos de tiempo de retención; espectrometría de masas.
Figura 9: corrección Manual de RTs mal en la tabla de calibración. Los valores incorrectos se pueden corregir manualmente insertando el correcto RT para el alcano correspondiente, como se muestra aquí para Alkane_C39. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Análisis de espectrometría de masas; TIC y gráfico de espectros; Se muestra el proceso de identificación de compuestos.
Figura 10: comparación del espectro de masas del compuesto solicitada a las entradas de la biblioteca NIST. Después de seleccionar el máximo pico liberador en 6,16 min (RI 891) y activación de la función de 'Búsqueda de NIST' (círculo rojo), aparece una similitud de espectro de 0.99 para la 2-heptanona. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Diagrama de cromatografía, TIC, comparando compuestos detectados frente a compuestos de biblioteca para análisis de similitud espectral.
Figura 11: identificación de metabolitos en el extracto contenido de MGR. El espectro de masas y la RI origina el compuesto liberador en 891 de RI en el cromatograma de la muestra se comparan con las entradas de la biblioteca interna con RIs y los espectros de compuestos estándar medidos. Si la 'puntuación de similitud general' (OSS, abreviado en metabolito Detector como 'General simil.' aplicación de espectro de masa y RI) entre un compuesto en la propia biblioteca y un compuesto en la muestra de archivo es ≥ 0.9, el compuesto es señalado como 'identificado'. Aquí, la OSS entre la entrada de la biblioteca interna de 2-heptanona y liberador compuesto en RI 891 es 0.96, lo que resulta en la identificación de 2-heptanona en el contenido MGR de extracto. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Gráfico de cromatografía; Extractos de glándulas mandibulares vs Dufour; Comparación de picos, análisis de tiempo de retención.
Figura 12: superposición de secciones de cromatograma TIC (min 29 min 35) de los contenidos DG extracto (rojo) y (azul) del extracto el contenido MGR. Áreas de pico correspondiente a la superposición de compuestos (supuestos) son más altas en la dirección general de contenido extracto del extracto que en el contenido MGR; Estos compuestos potencialmente proceden de la dirección general y por lo tanto se consideran como el extracción de contaminantes (menores) en el contenido MGR. En el caso del extracto contenido C. explodens MGR, los picos cromatográficos procedentes de una supuesta contaminación de DG pueden encontrarse en unos min 29, y esta parte del cromatograma puede excluirse del análisis del contenido MGR. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Diagrama de flujo de análisis de secreciones de hormigas; GC-MS, proceso de identificación de metabolitos, pasos de extracción de glándulas.
Figura 13: esquema flujo de trabajo de muestras de hormiga para anotación/identificación de metabolitos en el contenido del depósito de glándula extractos después del análisis por GC-MS. El protocolo que presentamos explica pasos todo experimentales a partir del aislamiento de los contenidos MGR por disección de la hormiga y el análisis de GC-MS así como evaluación de los datos (indicado en negro). Como alternativa, la secreción de insectos también puede ser generados y recolectados en situ (indicado en color gris). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Diagrama de desarrollo de semillas; comparación a escala de ~1 mm; microscopía para estudios botánicos.
Figura 14: aislado cerosa contenido Gerente antes de la extracción de. (A) el contenido de los dos gerentes se pega, pero (B) también pueden ser separados después de aislamiento. En C. explodens, el color del contenido MGR es naranja amarillento, pero puede variar de blanco a rojo en otras especies del grupo COCY. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Primer plano de la muestra de tejido (~1 mm) que muestra daños por quemaduras, utilizada en análisis forenses y pruebas de materiales.
Figura 15: ilustración de una secreción de MGR aislada Cruz-contaminado por los mandantes de los intestinos de los insectos (brown). Estos tipos de aislamientos MGR están excluidos de la extracción y posterior análisis. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

IDMetabolitoNombre trivialCadena de InCHIFórmula de la suma
1Heptan-2-oneInChI=1S/C7H14O/c1-3-4-5-6-7 (2) 8/ h3 - 6H 2, 1-2H 3C7H14O
2n-UndecaneInChI=1S/C11H24/c1-3-5-7-9-11-10-8-6-4-2/h3-11H2,1-2H3C11H24
3n-HeptadecanoInChI=1S/C17H36/c1-3-5-7-9-11-13-15-17-16-14-12-10-8-6-4-2/h3-17H2,1-2H3C17H36
41-(2,4,6-Trihydroxyphenyl)-ethanoneMonoacetylphloroglucinolInChI = 1S C8H8O4, c1-4, (9) 8-6 (11) 2-5 (10) 12/h2-3,10-12 H, 1 H 3 3-8C8H8O4
55,7-Dihydroxy-2-methylchromen-4-OneNoreugeninInChI = 1S/C10H8O4/c1-5-2-7 (12) 10-8 (13) (11) 3-6 4-9 (10) 14-5/h2-4,11, 13H, 1H 3C10H8O4

Cuadro 1: extracción de metabolitos identificados en el EtOAc del contenido MGR aislado de C. explodens obreras menores. Se presentan metabolitos seleccionadas.

Suplementario figura S1. Descripción de las partes del cuerpo más importantes pertenecientes a las hormigas COCY (menores trabajadores) presenta en este manuscrito. (A) los gerentes se muestran en amarillo. Su porción gastral se utiliza para el análisis de volatilome. (B) la porción gastral de los gerentes se encuentra por debajo de 1 a 3 en tergitos. T: terguito. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Figura suplementaria S2. Resumen esquemático del experimento presentado. Se ilustran los pasos principales de la disección de la hormiga hasta la supuesta identificación de metabolitos presentes en el contenido MGR. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Discusión

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

En este manuscrito, presentamos un protocolo completo para el análisis de la volatilome del contenido encontrado en el hipertrofiado MGRs de obreras menores C. explodens . Ya que las hormigas utilizadas aquí pueden 'explotar' y expulsar su contenido MGR en forma descontrolada cuando se toca con pinzas, se recomienda utilizar una técnica de la colección 'soft' como un aspirador de insectos (figura 1). Para algunas especies de hormiga entre las hormigas COCY, puede ser necesario limitar el número máximo de las hormigas a cinco individuos por el frasco de 50 mL, puesto que de lo contrario uno mismo-envenenamiento de las hormigas (por ejemplo, por acumulación de ácido fórmico en el espacio de cabeza) puede ocurrir. Para la congelación de las hormigas en el campo, puede utilizarse una bolsa fresca rellena con paquetes fríos congelados. Las muestras deben ser rápidamente congeladas y almacenadas en condiciones frías (por ejemplo, -20 ° C, mejor a-80 ° C), pero no se recomienda para eliminar y almacenar las hormigas en nitrógeno líquido, ya que se ha observado aumento de los daños de sus glándulas con este método.

La metodología de disección presenta buffer solvente-libre y es conveniente para obtener el contenido del depósito de glándula mandibular similar a la cera así como otras glándulas presentes en hormigas obreras congelados. Para el análisis volatilome del contenido MGR de explodens C., aspectos importantes a considerar durante la disección son continuo enfriamiento de la hormiga (paso 2.1.4) y minimizar la contaminación cruzada de las muestras de la MG con otras glándula contenido/fluidos presentes en el gaster de la hormiga (paso 2.5, figura 4y figura 15). Una fracción considerable de las hormigas congeladas puede dañarse, ya sea porque las hormigas 'explotaron' durante el muestreo o fueron dañadas durante el transporte en hielo seco en el sitio de muestreo al laboratorio. Si la región de gaster se rompe, estas hormigas no son adecuadas para su posterior análisis (figura 2, D). Si sólo antenas y piernas faltantes o rotas, estas hormigas pueden seguir utilizándose para la extracción de los contenidos MGR y posterior análisis. Puesto que el contenido MGR de enfriado explodens C. hormigas tienen una consistencia similar a la cera es sencillo aislar con el uso de agujas de disección (paso 2.5 figura 3Ey figura 14). Cuidado adicional debe ser tomado mientras que maneja al Gerente pegajoso contenido. Puede pegarse a cualquier cosa que entra en contacto físico con él y también a menudo se adherirá a las pinzas de disección, que aumenta el riesgo de contaminación de otras muestras. Es necesario tocar solamente el contenido MGR con la aguja de disección y transferirlo inmediatamente en los frascos de vidrio utilizados para la extracción (pasos 2.5 y 2.6). Por otra parte, se recomienda limpiar el equipo de disección con una mezcla de MeOH/H2O cuando se cambia entre las hormigas o tipos de glándula (paso 2.8).

Contenido de la glándula de otras especies de hormigas puede estar presente en un estado líquido incluso durante el enfriamiento con compresas frías. En este caso, la glándula entera incluyendo la membrana puede ser aislada y luego pinchar para obtener el contenido. Las secreciones de líquido pueden obtenerse también con la ayuda de pipetas capilares finos. Con una longitud de cuerpo media de unos 4-5 mm (sin antenas), trabajadores de explodens C. pertenecen a la especie más pequeña del grupo COCY. Su gaster a menudo hinchado se compone de unos 2-2.5 mm de longitud y 1-1.5 mm de ancho. Los trabajadores de la especie conocida más grande hasta ahora del grupo COCY pueden alcanzar un tamaño de unos 8 mm de longitud corporal, con un tamaño de gaster de unos 3 mm de longitud y 2,5 mm de ancho. Puesto que el protocolo es adecuado para analizar e investigar hormigas individuales y gasters de ese tamaño de diferentes especies COCY, aquí utilizaron instrumentos de disección y microscopio tenga que ser adaptado para ser aplicable para las hormigas más pequeñas o pequeños órganos. Por otra parte, el número de hormigas por cada muestra analítica puede tener que aumentarse así.

Mientras la hormiga por el contenido MGR de disección, es fundamental no para dañar otras glándulas y los intestinos - cuyo contenido puede Cruz-contaminar la muestra (paso 2.5, figura 4 y figura 15). En el caso óptimo, después de la extracción de los contenidos de la MGR, la dirección general, así como del VG se visiblemente mantienen intacto (figura 4). Contaminación con el contenido de la dirección general, que se encuentra debajo de los gerentes, es difícil de evitar completamente. Razones también pueden incluir la interrupción parcial de la integridad de la glándula durante el transporte de hielo seco desde el sitio de muestreo al laboratorio. También es posible que la DGs se dañan durante el muestreo o en el proceso de explosión, como nos hemos dado cuenta de la MGR en un número de hormigas investigados. Puesto que el contenido de la dirección general puede analizarse del mismo modo como el administrador de contenidos (secciones 3 y 4), los resultados pueden ser comparados con los datos resultantes tras el análisis de las muestras de contenido de MGR (sección 6). En el caso de extractos de contenido de MGR obtenidos de C. explodens hormigas, los compuestos contenidos en la dirección general también comienzan a eluir en el cromatograma (figura 12). Para evitar confundir la DG compuestos para los mandantes de la MGR, los respectivos metabolitos pueden excluirse del análisis. De estudios en otras especies de hormigas se conoce que DGs también pueden contener compuestos volátiles (muy)1,24, que por lo general procederá a la elución en el cromatograma GC.

En estudios previos relacionados con la composición química de los contenidos MGR de COCY hormigas, hormigas todo o sus gasters todo fueron analizados16,17,18,23, mientras que contenidos aquí la MGR se obtuvieron mediante la disección de las hormigas.

Análisis de contenido MGR disecada permite a los investigadores para llevar a cabo una amplia gama de estudios bioquímicos, incluyendo la identificación de metabolitos que en él figuran. Puesto que el estudio realizado se centró en la identificación de los componentes volátiles contenidos en el MGR de C. explodens, GC-MS fue elegido para su análisis (sección 4). Para ello, los extractos deben idealmente medidos inmediatamente después de la preparación o almacenados a-80 ° C hasta su análisis. Cabe señalar que el almacenamiento (prolongado) puede causar alteraciones químicas de los extractos (ver notas después del paso 3.3 y 4.2). Puesto que la concentración de los contenidos MGR puede cubrir un rango de varios órdenes de magnitud, puede ser necesario analizar los extractos MGR en GC diferentes cocientes de dividir. Puesto que los dos compuestos principales en el contenido MGR extracción de las hormigas para ejemplificar el protocolo causado columna sobrecarga cuando se utilizó la proporción split 2:1, esta muestra se analizó una segunda vez en un cociente más alto de la división de 50: 1 (paso 4.3.1.2and figura 5). El GC-MS parámetros presentados en la sección 4 son adecuados para datos generados con el GC-MS los dispositivos especificados en la Tabla de materiales. Junto el RI calibradores (paso 4.1.1), un disolvente-espacio en blanco (paso 4.1.2) debe analizarse también para reconocer artefactos no biológicos y contaminantes durante el análisis de datos posteriores. Para identificación de metabolitos, también es importante medir el auténtico estándares de compuestos anotados en las mismas condiciones de GC-MS como el usado para el análisis de los extractos de la muestra (después de 5.4.7and de pasos). Para mejorar la exactitud y fiabilidad de los datos finales, se recomienda analizar todas las categorías de muestra (solvente blanco, RI calibradores, extractos de muestra y normas) dentro de la misma secuencia de medición. Por otra parte, deben analizarse las normas auténticas en una concentración comparable a la observada para los extractos de muestra. Esto ayuda a mejorar la exactitud de los valores de RI y similitud entre la muestra y estándar espectros de masas, que finalmente conducirá a anotación/identificación de metabolitos de mayor y más significativa. Para ello, los estándares pueden medirse repetidamente usando split diferentes factores.

Para identificación de metabolitos, el software sofisticado, MetaboliteDetector se utiliza para la comparación de espectros y RI y deconvolución de espectros a una implementación NIST biblioteca así como una biblioteca interna establecida (sección 5). Se recomienda ejecutar MetaboliteDetector en un 64 bits LINUX-basado sistema operativo (por ejemplo, KUBUNTU) y copiar el generado *. Archivos de datos CDF (paso 4.4) desde el dispositivo de almacenamiento portátil de datos en el disco duro local. MetaboliteDetector es capaz de importar datos GC-MS en formato netCDF centroide o perfil. El software de la mayoría de GC-MS los instrumentos debe ser capaces de convertir los datos crudos grabados en este formato19. Antes de iniciar el análisis de datos, se recomienda leer la bibliografía disponible para versiones anteriores de software de MetaboliteDetector para familiarizarse con las características y la interfaz gráfica de usuario19,25, 26.

Para la calibración de RI y posterior cálculo del valor de la RI de los picos compuestos presentes en los extractos de la muestra, se utiliza una biblioteca que contiene los espectros de calibradores de RI (aquí, n-alkanes) y RIs. Tal biblioteca puede ser auto establecida o preexistente ('CalibrationLibrary_Alkanes') puede ser descargado27. La biblioteca de calibrant predeterminado proporcionado contiene RIs y espectros de n-alkanes desde C09 C39 que se han analizado como se describe en la sección 4. La biblioteca proporcionada permite a los usuarios trabajar con Detector de metabolito a empezar directamente con el proceso de calibración de sus datos. Si es necesario, esta biblioteca puede ampliarse con entradas adicionales de otros alcanos. Basado en la semejanza de referencia y experimental derivada los espectros de masas (ver paso 5.3 y subpasos, figura 7, figura 8, figura 9), anotación o identificación de los compuestos puede ser realizado (paso 5.4 y subpasos, Figura 11). También es fundamental que después de tratamiento automatizado de datos con MetaboliteDetector, el usuario manualmente comprobará deconvolución de picking y espectro de pico correcto mediante la inspección de espectros de masas subyace el triángulo para cada supuesta compuesto de interés. Por otra parte, dependiendo de la instrumentación de GC-MS y la configuración de los parámetros utilizada para la generación de datos, adaptaciones de los ajustes de MetaboliteDetector presentados pueden ser necesarios. El software MetaboliteDetector es capaz de realizar muchas operaciones más útiles que explican en este manuscrito, por ejemplo, exhibición de cromatogramas de (EIC) actuales de iones extraídos, exportación de cromatogramas como .csv, lote-cuantificación automática de compuestos y muchos más.

El protocolo presentado en este manuscrito puede servir como sugerencia para los experimentos realizados por otros investigadores centra en aislamiento de glándulas o de contenido de la glándula de insectos, volatilome análisis, así como la identificación de metabolitos.

Divulgaciones

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Financiamiento para este estudio se obtuvo a través de la Viena de la ciencia y tecnología fondo (WWTF) LS13-048 ISD. Un agradecimiento especial a Diane W. Davidson (Universidad de Utah, ahora jubilado) por compartir sus conocimientos sobre las hormigas de COCY Bornean con nosotros. Agradecemos a las administraciones de la Kuala Belalong campo estudios centro (KBFSC) y Universiti Brunei Darussalam (UBD) para la aprobación del proyecto, así como de Brunei Departamento Forestal y de Brunei centro investigación e innovación para permiso para recoger las hormigas y aprobación y emisión de permisos de exportación. Un agradecimiento especial al personal de la UBD y KBFSC, especialmente Muhammad Salleh Abdullah bin Bat Teddy Chua Wee Li, Masnah Mirasan, Rafhiah Kahar, Roshanizah Rosli, Rodzay Wahab, Chan Chin Mei y Kushan Tennakoon para facilitar nuestra investigación.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Tubo 50 ml, 115 x 28 mm, base plana/cónica PPSarstedt62.559.001ver Figura 1 en el manuscrito
Tubos de PVCRehau290 4489ver Figura 1 en el manuscrito
Malla, acero inoxidable, tamaño de malla 0,63 mmAntstore1000378ver Figura 1 en el manuscrito
CongeladorSeverinKS 9890 -20 ° Caja
espuma de poliestireno C o inferior, dimensiones interiores 155 mm x 100 mm x 45 mmThorsten Koch4260308590481
Placa de Petri, vidrio, 100 mm x 15 mmAldrichBR455742
Acumulador de frío 150 mm x 100 mmElite Bags1998congelar a -20 ° C
Cubo con hielo
1,5 mL Viales de Rosca Corta, 32 x 11,6 mm, vidrio transparente, 1.ª clase hidrolítica, apertura ampliaLa-Pha-Pack11090500
Tapones de rosca para viales de rosca corta de 1,5 mL, cerrados, tabique blanco silicio/rojo PTFE, 55 grados Shore A, 1,0 mmLa-Pha-Pack9151799
Microscopio estereoscópicoBresser5806100
Pinzas, punta superfina curvadaMedizinische Instrumente May, Norman MayPI-0005B
Pinzas, punta superfina rectaazulINOXBL-3408
Aguja de disección 140 mm, puntiaguda, rectaHeinz Herenz Medizinalbedarf GmbH1110301
Metanol, LC-MS CHROMASOLV, Honeywell Riedel-de Haë nfisher scientific15654740
agua destilada
Rotizell-Tissue-Tü cherCarl Roth GmbH + Co.KG0087.2
Éster etílico de ácido acético ROTISOLV ≥ 99,8 %Carl Roth GmbH + Co.KG4442.1congelación a -20 ° C
Vortex Genie 2neoLab7-0092
Microinsertos de 0,1 mL para viales de rosca corta de 1,5 mL, 31 x 6 mm, vidrio transparente, 1ª clase hidrolítica, punta de 15 mm;La-Pha-Pack06090357
tapones de rosca para viales de rosca corta de 1,5 mL, con orificio, tabique de caucho rojo/PTFE, 45 grados Shore A,de 9151819 alcano La-Pha-Packde
8-C20Sigma-Aldrich 04070
Solución estándar de alcanos C21C40Sigma-Aldrich 04071
n-Hexano SupraSolvMerck104371
muestreador automático de GC, p. ej. MPS2XL-TwisterGerstel
Agilent Cromatógrafo de gases 6890 NAgilent
Cuello de cisne Liner sin divisiónRestek22406
Helium (5.0 - F50)Messer102532501
Columna capilar GC HP-5MS UI 30 m × 0,25 mm y veces; 0,25 y micro; mAgilent19091S-433UI
Agilent Detector selectivo de masas 5975BAgilent
MSD ChemStation Análisis de datos Software de aplicación Software Agilent
MetaboliteDetector (3.1.Lisa20170127Ra-Linux)Hiller Kdescargar desde: http://metabolitedetector.tu-bs.de/node/10
Biblioteca de calibración para MetaboliteDetectorHiller Kdescargar de: http://metabolitedetector.tu-bs.de/node/10
MD Conversion Tool para NIST-libraryHiller Kdescargar desde: http://metabolitedetector.tu-bs.de/node/10
de picado solución estándar 1,0 mm C

Referencias

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Morgan, E. D. Chemical sorcery for sociality: exocrine secretions of ants (Hymenoptera: Formicidae). Myrmecol News. 11, 79-90 (2008).
  2. Betz, O. Biological adhesive systems. , Springer. 111-152 (2010).
  3. Laciny, A., Zettel, H., Druzhinina, I. Workers, soldiers, and gynes-morphometric characterization and description of the female castes of Camponotus singularis (Smith, 1858)(Hymenoptera, Formicidae). Deutsche Entomologische Zeitschrift. 63, 183(2016).
  4. Ward, P. S., Blaimer, B. B., Fisher, B. L. A revised phylogenetic classification of the ant subfamily Formicinae (Hymenoptera: Formicidae), with resurrection of the genera Colobopsis and Dinomyrmex. Zootaxa. 4072 (3), 343-357 (2016).
  5. Davidson, D. W., Salim, K. A., Billen, J. Histology of structures used in territorial combat by Borneo's 'exploding ants'. Acta Zoologica. 93 (4), 487-491 (2012).
  6. Davidson, D., et al. An experimental study of microbial nest associates of Borneo's exploding ants (Camponotus [Colobopsis] species). Journal of Hymenoptera Research. 18 (2), 341-360 (2009).
  7. Laciny, A., et al. Colobopsis explodens sp.n., model species for studies on "exploding ants" (Hymenoptera, Formicidae), with biological notes and first illustrations of males of the Colobopsis cylindrica group. ZooKeys. , (2018).
  8. Maschwitz, U., Maschwitz, E. Platzende Arbeiterinnen: eine neue Art der Feindabwehr bei sozialen Hautflüglern. Oecologia. 14 (3), 289-294 (1974).
  9. Davidson, D. W., Lessard, J. P., Bernau, C. R., Cook, S. C. The tropical ant mosaic in a primary Bornean rain forest. Biotropica. 39 (4), 468-475 (2007).
  10. Martin, S., Drijfhout, F. A review of ant cuticular hydrocarbons. Journal of chemical ecology. 35 (10), 1151(2009).
  11. Pickett, J. Chromatography and isolation of insect hormones and pheromones. , Springer. 299-309 (1990).
  12. Tragust, S., et al. Ants disinfect fungus-exposed brood by oral uptake and spread of their poison. Current Biology. 23 (1), 76-82 (2013).
  13. Menzel, F., Blüthgen, N., Schmitt, T. Tropical parabiotic ants: highly unusual cuticular substances and low interspecific discrimination. Frontiers in Zoology. 5 (1), 16(2008).
  14. Hogan, C. T., Jones, T. H., Zhukova, M., Sosa-Calvo, J., Adams, R. M. Novel mandibular gland volatiles from Apterostigma ants. Biochemical Systematics and Ecology. 72, 56-62 (2017).
  15. Augusto, F., Valente, A. L. P. Applications of solid-phase microextraction to chemical analysis of live biological samples. TrAC Trends in Analytical Chemistry. 21 (6), 428-438 (2002).
  16. Davidson, D. W., et al. Nutrition of Borneo's 'exploding' ants (Hymenoptera: Formicidae: Colobopsis): a preliminary assessment. Biotropica. 48 (4), 518-527 (2016).
  17. Jones, T., et al. The chemistry of exploding ants, Camponotus spp.(cylindricus complex). Journal of chemical ecology. 30 (8), 1479-1492 (2004).
  18. Voegtle, H. L., Jones, T. H., Davidson, D. W., Snelling, R. R. E-2-ethylhexenal, E-2-ethyl-2-hexenol, mellein, and 4-hydroxymellein in Camponotus species from Brunei. Journal of chemical ecology. 34 (2), 215-219 (2008).
  19. Hiller, K., et al. MetaboliteDetector: comprehensive analysis tool for targeted and nontargeted GC/MS based metabolome analysis. Analytical chemistry. 81 (9), 3429-3439 (2009).
  20. Sumner, L. W., et al. Proposed minimum reporting standards for chemical analysis. Metabolomics. 3 (3), 211-221 (2007).
  21. Stein, S. Retention indices by NIST mass Spec data Center. NIST Chemistry Webbook, NIST Standard Reference Base. (69), (2010).
  22. NIST Chemistry WebBook. NIST Standard Reference Database Number 69. , Available from: http://webbook.nist.gov/chemistry/ (2018).
  23. Cook, S. C., Davidson, D. W. Nutritional and functional biology of exudate-feeding ants. Entomologia Experimentalis et Applicata. 118 (1), 1-10 (2006).
  24. Abdalla, F. C., Cruz-Landim, C. d Dufour glands in the hymenopterans (Apidae, Formicidae, Vespidae): a review. Revista Brasileira de Biologia. 61 (1), 95-106 (2001).
  25. Hiller, K. MetaboliteDetector. Documentation. , Available from: http://metabolitedetector.tu-bs.de/wiki/index.php/Documentation (2010).
  26. Nieke, C. MetaboliteDetector - Development Version. , Available from: http://md.tu-bs.de/system/files/Downloads/MD-Development-Version-Documentation.pdf (2012).
  27. Hiller, K., Koschnitzki, N. MetaboliteDetector. Download. , Available from: http://metabolitedetector.tu-bs.de/node/10 (2017).

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