Reparación de roturas del DNA de doble cadena es un proceso dinámico, que requiere no sólo la formación de complejos de reparación en los descansos, pero también su resolución después de la lesión se trata. Aquí, utilizamos microscopia de la inmunofluorescencia para roturas de doble hebra transitorias y duradera como una herramienta para diseccionar este mecanismo de mantenimiento del genoma.
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Artículo de método
Caracterización de procesos de reparación del ADN en transitoria y duradera doble cadena DNA roturas por microscopia de la inmunofluorescencia
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Resumen
Resumen
La reparación de roturas de doble hebra (distritales) en el ADN es un proceso altamente coordinado, que requiere la formación y resolución de los complejos de multi-proteínas reparación. Este proceso está regulado por una gran variedad de proteínas que promueven la asociación y disociación de las proteínas a estas lesiones. Gracias en gran parte a la capacidad para realizar pantallas funcionales de una vasta biblioteca de proteínas, hay una mayor apreciación de los genes necesarios para la reparación de rotura de ADN de doble cadena. Pantallas a menudo geneticamente o químico inhibidor identifican las proteínas implicadas en procesos de reparación mediante aumento de la toxicidad como un marcador para una proteína que se requiere para la reparación DSB. Aunque útil para identificables nuevas proteínas celulares involucradas en mantener la fidelidad del genoma, análisis funcional requiere la determinación de si la proteína de interés promueve la localización, formación o resolución de los complejos de reparación.
La acumulación de proteínas de reparación puede ser fácilmente detectada como distintos focos nucleares por microscopia de la inmunofluorescencia. Por lo tanto, asociación y disociación de estas proteínas en los sitios de daño del ADN pueden accederse mediante la observación de estos focos nucleares representante a intervalos después de la inducción de roturas del DNA de doble cadena. Este enfoque también puede identificar proteínas de factor de reparación mal localizada, si reparar los defectos no ocurren simultáneamente con incompletos retrasos en la reparación. En este escenario, roturas de DNA de doble cadena larga duración pueden diseñarse expresando una endonucleasa de corte raro (p. ej., SceI) en las células donde el sitio de reconocimiento para la enzima dijo se ha integrado en el genoma celular. La lesión resultante es particularmente difícil de resolver como reparación fiel será reintroducir sitio de reconocimiento de la enzima, lo que provocó otra ronda de escote. Como resultado, se eliminan las diferencias en la cinética de reparación. Si no se forman complejos de reparación, localización ha sido impedida. Este protocolo describe la metodología necesaria para identificar cambios en la cinética de reparación así como localización de la proteína de reparación.
Introducción
Cada día, cada célula en el cuerpo humano es bombardeado con un estimado 10.000 lesiones de ADN1. Esta amenaza existencial nos pone en riesgo de mutaciones, oncogénesis, así como la célula muerte. Para proteger la fidelidad de genoma, células de mamíferos han evolucionado para responder a daños en el ADN con una compleja serie de asociaciones de proteínas y modificaciones. Esta respuesta está organizada en múltiples vías, conocidas colectivamente como la DNA daños respuesta (DDR)2,3. El DDR consiste en la acumulación de proteínas de reparación del ADN en las lesiones del ADN, coordinada....
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Protocolo
Nota: el presente Protocolo es escrito para U2OS celdas que contengan un-SceI reconocimiento sitio18. Las células no necesitan ser U2OS pero deben contener el sitio SceI. El protocolo puede necesitar ser ajustado (p. ej., número de células sembradas y tiempos de incubación) dependiendo del tipo de células utilizadas.
1. definir la cinética de formación de complejos de reparación DSB
- Cultivar células de U20S-DRGFP en una placa de cultivo de tejidos de 10 cm hasta 85-90% confluente.
- Retire los medios de comunicación e incubar a temperatura ambiente (RT) en 3 mL de EDTA por 2 min.
- ....
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Resultados
La figura 1 muestra la selección de la discriminación de ruido correcto para la cuantificación de maxima/focos con ImageJ. Las imágenes combinadas de DAPI y la proteína de reparación del interés están en el panel izquierdo. Figura 1A muestra una discriminación de ruido de 90 y marca el número correcto de focos. Los núcleos en el borde (representado con una flecha de color rosa) y focos fuera de los núcleos (representados con una .......
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Discusión
El análisis de ADN reparación de daños en general y la reparación de roturas del DNA de doble hebra es específicamente un área activa de investigación porque sus consecuencias abarcan tumorigenesis biología básica6,20. Datos de este manuscrito un enfoque que disecciona con precisión la contribución de proteínas RAD51 y H2AX γ a la resolución de los consejos escolares distritales a través de horas esperando, este método puede utilizarse para aclarar funciones adic.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Agradecemos a Joel Sanneman y Dr. Philine Wangemann de la base de la microscopia Confocal, financiado por el Kansas estado Universidad Universidad de medicina veterinaria, por su apoyo de los esfuerzos para desarrollar esta técnica. pCBASceI fue un regalo de Maria Jasin (plásmido Addgene # 26477) 30. Las células U2OS DR-GFP eran un regalo bueno Maria Jasin18.
....Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Cubreobjetos de 12 mm | VWR | 89015-725 | |
| 16% Paraformaldehído (PFA) | ThermoFisher Scientific | 28908 | |
| Placa de 24 pocillos | VWR | 82050-892 | |
| Placa inferior de vidrio de 96 pocillos | Cellvis | P96-1.5H-N | |
| Anti-H2AX Alexa488 | EMD Millipore | 05-636-AF488 | |
| Anti-Rad51 (D4B10) | Tecnología de señalización celular | 8875S | |
| Bio-formatos plugin para ImageJ | Instituto Nacional de Salud (NIH) | https://imagej.nih.gov/ij/plugins/index.html | |
| Albúmina sérica bovina (BSA) | VWR | 97061-416 | |
| DAPI | ThermoFisher Scientific | D1306 | |
| DMEM, alta glucosa | ThermoFisher Scientific | 12100046 | |
| EDTA | Invitrogen | 15576-028 | |
| Suero fetal bovino (FBS) | VWR | 89510-194 | |
| Cabra Anti-Conejo IgG Alexa594 | ThermoFisher Scientific | A-11012 | |
| Peróxido de hidrógeno | sigma-Aldrich | 216763-100ML | |
| ImageJ Software | Instituto Nacional de Salud (NIH) | https://imagej.nih.gov/ij/ | |
| I-SceI Expression Vector Addgene | 26477 | ||
| Esmalte de uñas- Insta Dri | Sally and Hansen | Clearly Quick (103) | |
| Solución salina tamponada con fosfato (PBS) | Bio Basic | PD8117 | |
| ProLong Gold Reactivo antidecoloración | Life Technologies | P36930 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100-100ML | |
| Tripsina-EDTA | Sigma-Aldrich | T4049-500ML | |
| Reactivo de transfección TurboFect | ThermoFisher Scientific | R0531 | |
| Tween-20 | Fisher Scientific | BP337-500 |
Referencias
- Lindahl, T. Instability and decay of the primary structure of DNA. Nature. 362 (6422), 709-715 (1993).
- Branzei, D., Foiani, M. Regulation of DNA repair throughout the cell cycle. Nat Rev Mol Cell Biol. 9 (4), 297-308 (2008).
- Ciccia, A., Elledge, S. J.
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Reimpresiones y permisos
