Se requiere una suscripción a JoVE para ver este contenido. Inicie sesión o comience su prueba gratuita.

Artículo de método

Ruta de subaracnoideo intracraneal de la infección para investigar funciones de biopelículas del Streptococcus suis en Meningitis en un modelo murino de infección

6.6K visualizaciones

⸱

DOI:

10.3791/57658

⸱

1 de julio de 2018

 ,  ,  ,  ,  ,  , 

En este artículo

Resumen

Aquí, describimos la ruta subaracnoidea intracraneal de la infección en ratones para estudiar el papel de los biofilms en Streptococcus suis meningitis. Este modelo de infección también es adecuado para el estudio de la patogenia de otra meningitis bacteriana y la eficacia de nuevos medicamentos contra la meningitis bacteriana.

Resumen

Streptococcus suis es no sólo un patógeno bacteriano importante de cerdos en todo el mundo, sino también un agente zoonótico emergente. En los seres humanos y cerdos, la meningitis es una manifestación importante de infecciones por S. suis . Un modelo adecuado de la infección es una herramienta esencial para comprender los mecanismos de las enfermedades causadas por patógenos. Varias rutas de la infección en ratones se han desarrollado para estudiar la patogenesia de la infección por S. suis . Sin embargo, las rutas de infección intraperitoneales, intranasales o intravenosas no son adecuadas para el estudio de las funciones de componentes superficiales de S. suis meningitis directamente en el cerebro, como la matriz extracelular de la biopelícula. Aunque la inoculación intracisternal se ha utilizado para la infección por S. suis , el sitio de inyección precisa no se ha descrito. Aquí, la ruta subaracnoidea intracraneal de la infección fue descrita en un modelo de ratón para investigar el papel de biofilms en meningitis S. suis . Células planctónicas de S. suis o biofilm estado fueron inyectadas directamente en el espacio subaracnoideo de los ratones a través del sitio de inyección, situado a 3,5 mm rostral de la bregma. El análisis histopatológico y mayor expresión del ARNm de TLR2 y citoquinas del tejido cerebral de los ratones inyectados con las células del biofilm estado indican claramente que biofilm de S. suis juega un papel definitivo en meningitis S. suis . Esta ruta de infección tiene evidentes ventajas sobre otras vías de infección, permitiendo el estudio de la interacción de la bacteria huésped. Además, permite el efecto de componentes bacterianos en las respuestas inmunitarias de host directamente en el cerebro para ser evaluados y simula la entrada de bacteria en el sistema nervioso central. Esta ruta de infección se puede extender para investigar los mecanismos de la meningitis causada por otras bacterias. Además, también puede ser utilizado para probar la eficacia de los medicamentos contra la meningitis bacteriana.

Introducción

Streptococcus suis (S. suis) es un importante patógeno bacteriano de los cerdos en todo el mundo, causando enfermedades graves como meningitis, neumonía, septicemia, endocarditis y artritis1. También es un agente zoonótico emergente. Hasta ahora, se ha informado que nueve serotipos pueden causar infección en seres humanos, incluyendo los serotipos 2, 4, 5, 9, 14, 16, 21, 24 y 312,3,4. En los seres humanos y cerdos, la meningitis es uno de los principales signos clínicos de infecciones por S. suis . En Vietnam y Tailandia,

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Protocolo

Los experimentos de infección del ratón fueron aprobados por el laboratorio Animal seguimiento Comité de la provincia de Jiangsu, China y realizados en el laboratorio Animal centro de Nanjing Universidad (número de permiso: SYXK (Su) 2017-0007).

1. preparación de las bacterias

Nota: Cepa virulenta de S. suis serotipo 2 P1/7 fue aislada de un cerdo enfermo con meningitis19. P1/7 cepa fue cultivada en caldo Todd-Hewitt (THB, fórmula por litro del TP: corazón infusión, 3,1 g neopeptone, 20,0 g dextrosa, 2,0 g; cloruro de sodio, 2.0 g, fosfato disódico, 0,4 g; carbonato de sodio, 2,5 g)....

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Resultados

Análisis de SEM fue realizada para examinar la formación de biopelículas en las condiciones experimentales. Como se muestra en la figura 1, existe una diferencia significativa en la formación de biopelículas entre células planctónicas (figura 1A) y biofilm estado células (figura 1B). Análisis de SEM demostraban que las bacterias del biofilm en grupos y capas y múltip.......

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Discusión

La ruta subaracnoidea intracraneal de la infección descrita aquí tiene evidentes ventajas sobre otras vías de infección. Permite a los investigadores a estudiar la interacción de la bacteria huésped y el efecto de componentes bacterianos en anfitrión inmunorespuestas directamente en el cerebro, que imitan la entrada bacteriana en el sistema nervioso central. Así, esta ruta de infección se puede extender para investigar los mecanismos de la meningitis causada por otras bacterias. Además, también puede ser utilizado para p.......

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Este trabajo fue financiado por becas de la investigación clave y programa de desarrollo de China [2017YFD0500102]; la Fundación Nacional de Ciencias naturales de China [31572544]; el laboratorio estatal clave de Biología veterinaria etiológico [SKLVEB2016KFKT005]; la agricultura de Shanghai aplica programa de desarrollo de tecnología, China [G2016060201].

....

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Todd Hewitt Broth(THB)Becton, Dickinson and CompanyDF0492078Disuelva 30 g del polvo en 1 L de agua purificada. Autoclave a 121 grados; durante 15 min.
AgarDSBIO16C0050Disolver 15 g del polvo en 1 L de THB. Autoclave a 121 grados; durante 15 min.
Sistema de purificación de agua de referencia Milli-QMerck KGaAZ00QSVCUSSin Dnase / Rnasa
NaClTianjin Kemiou Chemical Reagent Co., Ltd10019318Disuelva 8 g de NaCl, 0,2 g de KCl, 1,42 g de Na2HPO3, 0,27 g de KH2PO4 en 1 L de agua purificada. Autoclave a 121 grados; durante 15 min. Use KOH para ajustar el pH a 7.4.
Na2HPO3Xilong Scientific Co., Ltd9009012-01-09Disuelva 8 g de NaCl, 0,2 g de KCl, 1,42 g de Na2HPO3, 0,27 g de KH2PO4 en 1 L de agua purificada. Autoclave a 121 grados; durante 15 min. Use KOH para ajustar el pH a 7.4.
KClXilong Scientific Co., Ltd9009017-01-09Disuelva 8 g de NaCl, 0,2 g de KCl, 1,42 g de Na2HPO3, 0,27 g de KH2PO4 en 1 L de agua purificada. Autoclave a 121 grados; durante 15 min. Use KOH para ajustar el pH a 7.4.
KH2PO4Xilong Scientific Co., Ltd9009019-01-09Disuelva 8 g de NaCl, 0,2 g de KCl, 1,42 g de Na2HPO3, 0,27 g de KH2PO4 en 1 L de agua purificada. Autoclave a 121 grados; durante 15 min. Use KOH para ajustar el pH a 7.4.
KOHXilong Scientific Co., Ltd9009014-01-09Disuelva 8 g de NaCl, 0,2 g de KCl, 1,42 g de Na2HPO3, 0,27 g de KH2PO4 en 1 L de agua purificada. Autoclave a 121 grados; durante 15 min. Use KOH para ajustar el pH a 7.4.
GlycerolSionpharm Chemical Reagent Co., Ltd10010618 Diluido con igual volumen de agua purificada, autoclave a 121 grados durante 15 minutos al
4% de paraformaldehídoSionpharm Chemical Reagent Co., Ltd80096675
25% de glutaraldehídoSionpharm Chemical Reagent Co., Ltd30092436diluido 10 veces con agua purificada para su fijación.
EtanolSionpharm Reactivo Químico Co., Ltd10009218
CloroformoSionpharm Reactivo Químico Co., Ltd10006818
SpctrofotómetroDeNovix Inc.DS-11 +
Trituradora de células de ultrasonidoNingBo Scientz Biotechnology Co., LtdJY96-IIN
CentrífugaHitachi Koki Co., LtdCT15RE
RefrigeradorAucma Co., LtdDW-86L500
Microscopio electrónico de barridoZeissEVO-LS10
FastRNA Pro Green Kit MPBiomedicals#6045-050
Instrumento FastPrep-24MP Biomedicals116005500
Instrumento para PCRSensoQuest GmbH1124310110
QuantStudio 6 FlexThermo Fisher Scientific4485689
SYBR Premix Ex Taq IITakara Biomedical Technology (Beijing) Co., LtdRR820A
PrimeScript RT con borrador deADNgTakara Biomedical Technology (Beijing) Co., LtdRR047A
Procesador de tejidos completamente cerradoLeica Biosystems Nussloch GmbHASP200S
módulo de inclusión de parafina calentadaLeica Biosystems Nussloch GmbHEG1150H
Microtomo rotativo semiautomáticoLeica Biosystems Nussloch GmbHRM2245
Baño de agua para secciones de parafinaLeica Biosystems Nussloch GmbHHI1210
Autostainer XLLeica Biosystems Nussloch GmbHST5010
Agilent 2100Agilent TechnologiesG2939A
Microscopio ópticoOlympusBX51
Kit de reactivos

Referencias

  1. Gottschalk, M., Xu, J., Calzas, C., Segura, M. Streptococcus suis: a new emerging or an old neglected zoonotic pathogen? Future Microbiology. 5, 371-391 (2010).
  2. Goyette-Desjardins, G., Auger, J. P., Xu, J., Segura, M., Gottschalk, M.

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Reimpresiones y permisos

Explorar más artículos

Meningitis por biofilmcélulas planctónicascélulas en estado de biofilmanálisis histopatológicoexpresión de TLR2análisis de citocinasextracción de ARN