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Un método de preparación de muestra eficiente para aumentar carbohidratos señales de iones en espectrometría de masas de desorción/ionización láser asistida por matriz

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DOI:

10.3791/57660

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29 de julio de 2018

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1Genomic Research Center, Academia Sinica, 2Department of Chemistry, National Taiwan University

En este artículo

Resumen

Se demuestra un protocolo para aumentar carbohidratos señales de iones en espectrometría de masas MALDI por reformar estructuras cristalinas durante los procesos de preparación de muestra.

Resumen

Preparación de la muestra es un proceso crítico en el análisis de espectrometría de masas (MS) de hidratos de carbono. Aunque la desorción/ionización del laser asistida por matriz (MALDI) MS es el método de elección en el análisis de hidratos de carbono, reproducibilidad de datos y señal pobre ion de muestras de hidratos de carbono siguen siendo problemas graves. Para el análisis cuantitativo de hidratos de carbono, es necesario un protocolo analítico eficaz proporcionando datos de superior calidad. Este video muestra los protocolos de preparación de muestra para mejorar la intensidad de la señal y minimizar la variación de datos de los carbohidratos en MALDI-MS. Después de secado y cristalización de las gotas de la muestra, la morfología cristalina es reformada por el metanol antes de análisis de espectrometría de masa. La mejora en la señal de hidratos de carbono se examina con MALDI imaging espectrometría de masas (IMS). Resultados experimentales demuestran que la reforma de cristal ajusta estructuras cristalinas y redistribuye analitos de hidratos de carbono. En comparación con el método de preparación de gotas secas en MALDI-MS convencionales, reforma morfologías de cristal de hidratos de carbono con metanol muestra intensidad de señal significativamente mejor, ion imagen distribución y estabilidad de los datos. Puesto que los protocolos demostrados en este documento no implican cambios en la composición de la muestra, que son generalmente aplicables a diversos hidratos de carbono y matrices.

Introducción

Análisis de hidratos de carbono es un tema importante y desafiante. Hidratos de carbono y sus derivados desempeñan papeles importantes en vivir organismos1,2,3. Estas moléculas han complicado las estructuras y son propensas a descomponerse. Muchos de ellos no pueden ser claramente caracterizados debido a las dificultades en la separación y detección. Aunque láser asistida por matriz (MALDI) de desorción/ionización espectrometría de masas (MS) se ha aplicado al análisis de una amplia variedad de biomoléculas, debido a su sensibilidad y resultados comprensibles4, análisis de carbohidratos mediante MALDI-MS continúa para ser un gran desafío debido a la eficiencia de baja ionización de tales moléculas5. Derivatización química es una forma común para mejorar la eficiencia de la ionización de hidratos de carbono6,7, pero estos procedimientos son tiempo y consumo de la muestra. Además, la eficacia de la ionización de carbohidratos derivatizados es todavía más baja que la de las proteínas. Por lo tanto, es necesario el desarrollo de métodos para mejorar la señal de hidratos de carbono en MALDI-MS sin procedimientos complicados.

La aplicación del MALDI-MS para análisis cuantitativo es otro tema difícil. Un problema importante de MALDI-MS es que su sensibilidad y datos de reproducibilidad depende críticamente protocolos de preparación de muestra y parámetros experimentales. En muchos casos, análisis cuantitativo por MALDI-MS no es confiable debido a la morfología heterogénea muestra y distribución de analito. Un ejemplo bien conocido es muestras preparadas con la matriz MALDI (DHB) ácida 2, 5-dihydroxybenzoic. Cuando DHB se cristaliza lentamente bajo ambiente, el grado de incorporación de analito en cristales de la matriz es impredecible, ya que las muestras resultantes muestran morfologías irregulares. Dichas muestras normalmente consisten en grandes cristales aciculares y finos. Cuando DHB es preparado usando un disolvente volátil o una placa de la muestra calentada, un secado rápido resulta en cristales finos más homogéneos y mejor resultados cuantitativos8,9,10. Esta técnica se conoce como "recristalización" de muestras MALDI. La mejora se atribuye a la mejor incorporación de analitos en cristales finos matriz durante el proceso de cristalización rápida. También hemos demostrado que ajustar el ambiente de preparación de la muestra reduce la heterogeneidad de la señal de hidratos de carbono y mejores resultados cuantitativos11,12. Los resultados en estos trabajos sugieren que la morfología de la muestra es un factor crítico en la determinación de calidad de la señal de hidratos de carbono. Para desarrollar una estrategia general para el análisis diario, se requiere un método de reforma muestra eficiente proporcionando carbohidratos mayor sensibilidad.

Sistemáticamente hemos examinado la correlación entre la sensibilidad morfología y carbohidratos muestra en MALDI-MS en un reciente informe13. Los resultados obtenidos utilizando varios carbohidratos importantes y mostrar matrices que el mejor realce de la señal se ha cumplido por recristalización secado muestras MALDI. La morfología de muestras preparadas con el método de la gota seca convencional (DD) es reformada por recristalización rápida con metanol (MeOH). Los protocolos de preparación de la muestra detallada se demuestran aquí. El protocolo consta de tres pasos principales, incluyendo muestra placa preacondicionamiento, deposición de la muestra recristalización y análisis de espectrometría de masas. Los hidratos de carbono utilizados incluyen sialil-lewis (SLeA) y maltoheptaose (MH). DHB se utiliza como una matriz de modelo. Los resultados muestran que los carbohidratos señal intensidad y distribución espacial mejoraron marcado después de la recristalización. Este método puede aplicarse a muestras con otras matrices populares, 2,4,6-trihydroxyacetophenone (THAP) y α- ciano-4-hidroxicinámico el ácido. Este método sirve como un enfoque general que se puede integrar fácilmente en la rutina de laboratorio para el análisis de hidratos de carbono.

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Protocolo

1. preacondicionamiento de la placa de la muestra

  1. Limpieza de la placa de la muestra
    1. Guantes de nitrilo para evitar la contaminación de la placa de la muestra durante la limpieza.
    2. Lave la placa de la muestra con 100,0 mL de una solución de detergente (1.0 mg/mL).
    3. Lave la placa de la muestra con agua destilada-desionizada (DDW).
    4. Enjuague la superficie de la placa de muestra con 30,0 mL de MeOH.
    5. Poner la placa de la muestra en un vaso de precipitados de 600 mL y llenar con DDW hasta la placa de la muestra se sumerge totalmente en agua.
    6. Poner el vaso en un ultrasonido baño (véase tabla de materiales) y someter a ultrasonidos la placa de la muestra durante 15 minutos (200 W, 40 kHz).
    7. Saque la placa de la muestra y descargue gotas de agua con nitrógeno a presión.
    8. Depósito de 0.2 μl de MeOH en el plato de muestra para comprobar si MeOH se disemina a otros lugares.
      Nota: Si MeOH se combina con otros puntos, repita los pasos 1.1.3-1.1.5; Si no es así, proceder al siguiente paso.
  2. Regulación de la temperatura de la cámara de secado
    1. Utilice una cámara de secado bajo condiciones constantes para secar gotas, como se describió anteriormente11,12,13. En particular, utilice el procedimiento detallado que se describe en pasos 2.1-2.5 de Ou, Y. M. et al. 201612. Brevemente:
      1. Purgar la cámara de secado por temperatura de nitrógeno a un flujo constante para mantener un ambiente de baja humedad relativa.
      2. Mantener la muestra placa temperatura constante y regular - (25 ° C) o condiciones de rápido secado (50 ° C), regulada por un bloque de cobre con control de temperatura en la cámara de secado.
  3. Preparación de soluciones de matriz y analito
    1. Preparación de soluciones de matriz
      1. DHB se disuelven en 50% acetonitrilo (ACN): 50% DDW para preparar una solución de 0,1 M.
    2. Preparación de analitos de hidratos de carbono
      1. Disolver SLeA en DDW para preparar una solución de M-4 10.
      2. Disolver el MH en DDW para preparar una solución de 10-4 M.

2. muestra de deposición y recristalización

Nota: Aquí se describen los procedimientos optimizados para el análisis de cantidades pequeñas y regulares de las muestras. Asegúrese de que la temperatura de la placa muestra se estabiliza en la temperatura deseada antes de depositar las soluciones. Si la muestra se extiende sobre un área grande para cubrir otros puntos de la muestra durante la recristalización, preparar una nueva muestra o repita el paso 1.1.

  1. Para el análisis de una pequeña cantidad (0,1 μl) de muestra
    Nota:     se han desarrollado los siguientes pasos para minimizar el consumo de muestra y el tiempo. Es conveniente para el análisis cuantitativo de muestras reales con una cantidad limitada o IMS rápido para análisis de cuantificación.
    1. Mezcla preparada de antemano 0.25 μl de solución DHB y 0.25 μl de SLeA o solución de MH en un tubo de microcentrífuga.
    2. Vórtice la solución mezclada con un mezclador de vórtice para 3 s.
    3. Desactivación de la solución mezclada en una mini centrífuga de 2 s (2000 x g).
    4. Utilice una pipeta para extraer 0.1 μl de la solución premezclada y depositarlo inmediatamente en la placa de la muestra.
      Nota: Al depositar una pequeña cantidad de muestra, No se debe mantener la solución premezclada en la punta de la pipeta por más de 10 s.
    5. Espere a que la muestra a secar. Tiempos de secado típico se enumeran en la tabla 1.
    6. Utilice una pipeta depositar 0.2 μl de MeOH derecha en el lugar de la muestra seca. Se obtendrá la muestra húmeda y seque inmediatamente.
      Nota: Asegurar que el procedimiento de deposición se acaba en 3 s para evitar pérdidas por evaporación significativa de MeOH.
    7. Examinar la muestra con un microscopio. Si las morfologías de cristal no son como se esperaba (ver figura 1 , por ejemplo de los resultados deseados), repita los pasos 2.1.1-2.1.6 para preparar una nueva muestra.
    8. Guantes de nitrilo y cuidadosamente saque la placa de la muestra de la cámara de secado.
  2. Para el análisis de una cantidad regular (1 μl) de muestra
    Nota: Se desarrollan los siguientes pasos para maximizar la homogeneidad de las muestras de carbohidratos típicamente utilizado cantidad de muestra MALDI. El proceso es conveniente para la rutina y análisis cuantitativos. El proceso de recristalización redistribuye las muestras y matrices uniformemente a áreas más grandes.
    1. Mezcle 2,5 μl de solución DHB y 2,5 μl SLeA o solución de MH en un tubo de microcentrífuga.
    2. Vórtice de la solución premezclada con un mezclador de tipo vórtex durante 5 s.
    3. Desactivación de la solución mezclada en una mini centrífuga de 2 s (2000 x g).
    4. Utilice una pipeta para extraer 1,0 μL de la solución premezclada y depositarlo inmediatamente en la placa de la muestra.
      Nota: no uso el restante premezclado solución otra vez después de depositar las muestras.
    5. Espere a que la muestra a secar. Tiempos de secado típico se enumeran en la tabla 1.
    6. Utilice una pipeta depositar 1,5 μl de MeOH derecha en el lugar de la muestra seca. Se obtendrá la muestra húmeda y seque inmediatamente.
      Nota: En casos con temperatura de la placa de alto (50 ° C), el paso de recristalización debe hacerse dentro de 5 s para minimizar la evaporación de MeOH en punta de la pipeta.
    7. Examinar la muestra con un microscopio. Si las morfologías de cristal no son como se esperaba (ver figura 1 , por ejemplo de los resultados deseados), repita los pasos 2.2.1-2.2.6 para preparar una nueva muestra.
    8. Guantes de nitrilo y cuidadosamente saque la placa de la muestra de la cámara de secado.

3. datos de espectrometría de masas de adquisición y análisis

Nota: El análisis se realiza utilizando un espectrómetro tiempo-de-vuelo comercial de masas (Tabla de materiales) equipado con una fuente de iones MALDI. El instrumento es operado por el software de control específico (Tabla de materiales) con energía de retardo y láser de extracción previamente optimizado. Los espectros se registran de modo lineal con una gran gama de m/z = 0 – 1500. El potencial de la placa de la muestra es ±25 keV y cada espectro promedio de 10 disparos de láser. Los usuarios deben realizar optimización del instrumento y análisis de muestras usando software compatible y siga las instrucciones del fabricante del instrumento.

  1. Abra el software de control del instrumento (véase Tabla de materiales).
  2. Inserte la placa de la muestra en el espectrómetro de masas.
  3. Seleccione el método de adquisición de datos previamente optimizado en el software.
  4. Registrar la región de toda la muestra para IMS mediante el software de la proyección de imagen (véase Tabla de materiales).
    Nota: Omita este paso si no haciendo IMS.
  5. Inicio de adquisición de datos en el modo por lotes del software de control.
  6. Trama las imágenes de ion usando el software de imágenes después de completar la adquisición de datos.
  7. Analizar espectros de masas utilizando el software de análisis (véase Tabla de materiales) si los datos se graban sin una imagen de ion.

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Resultados

Imágenes representativas de la SEM de SLeA mezclan con DHB con DD y métodos de la recristalización se muestran en la figura 1. Una morfología típica de DHB, preparado por el método DD es grandes cristales en forma de aguja en el borde y fina estructura cristalina en el centro de puntos de muestra. Las longitudes típicas de tales cristales en forma de aguja son ~ 100 μm. Después de la recristalización por MeOH, la muestra tiene un área más grande cu...

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Discusión

Heterogeneidad de la muestra es que un problema crucial en MALDI-Sra. DD es el más comúnmente utilizado método de preparación de la muestra, pero los cristales resultantes son altamente heterogéneos. Dichas muestras demostración reproductibilidad pobre señal de tiro a tiro y muestra a muestra. Por lo tanto, buscar "puntos" en áreas de la muestra durante la adquisición de datos es un procedimiento común en los experimentos MALDI. Dichas muestras heterogéneas no son adecuadas para la cuantificación en análisis de rutina.

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Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Los autores no tienen ninguna agradecimientos.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
polvoAlconox242985
MetanolMerck106009
AcetonitriloMerck100003
ácido 2,5-dihidroxibenzoico (DHB)Alfa AesarA11459
sialyl-lewis A (SLeA)Sigma-AldrichS1782
MaltoheptaoseSigma-AldrichM7753
Puntas de pipetaMettler Toledo17005091
Tubo de microcentrífugaAxygenMCT-150-C
Equipment
Milli-Q sistema de purificación de aguaMilliporeZMQS6VFT1
Guantes de nitrilo sin polvoMicroflexSU-690
Vaso de precipitados de 600 mLDuran2110648
Limpiador ultrasónicoDeltaDC300H
HigrómetroWisewind5330
Caudalímetro de gas nitrógenoDwyerRMA-6-SSV
Termopares tipo KDigitron311-1670
Mezclador de vórticeScientific Industries  SI-0236
Mini centrífugaSelect BioProductsForce Mini 
PipetaRaininpipet-lite XLS
Microscopio estereoscópicoOlympusSZX16
Cámara de secado de temperatura controlableEste
Ultraflex II TOF/TOF espectrómetro de masasBruker Daltonics
MTP 384 placa de objetivo de acero pulido BCBruker Daltonics8280781
Flexcontrol Versión 3.4Bruker DaltonicsSoftware de control
Fleximaging Versión 2.1Bruker DaltonicsSoftware de imagen
Flexanalysis Versión 3.4Bruker DaltonicsSoftware de análisis
fuerteen laboratorio

Referencias

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