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Variedad de glicanos impresos: Una técnica sensible para el análisis del repertorio de circulación de los anticuerpos anti-hidratos de carbono en pequeños animales

DOI:

10.3791/57662

⸱

February 14th, 2019

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Infectious Pathology and Transplantation Division, Bellvitge Biomedical Research Institute (IDIBELL), 2Shemyakin-Ovchinnikov Institute of Bioorganic Chemistry (IBCh), Russian Academy of Sciences, 3Semiotik LLC, 4Auckland University of Technology, 5Intensive Care Department, Bellvitge University Hospital

* These authors contributed equally

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este trabajo muestra el potencial de la tecnología de glicanos impreso array (PGA) para el análisis de la circulación de los anticuerpos anti-hidratos de carbono en pequeños animales.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

El repertorio de anticuerpos anti-hidratos de carbono de un determinado individuo de circulación a menudo se asocia con su estado inmunológico. No sólo la condición inmune individual determina el éxito en la lucha contra las señales de amenaza potenciales internos y externos, sino también la existencia de un patrón particular de circulación de anticuerpos anti-glicanos (y su variación nivel serológico) podría ser un importante marcador de la aparición y progresión de determinadas condiciones patológicas. Aquí, describimos una metodología basada en impreso Glycan matriz PGA que ofrece la oportunidad de medir cientos de glicanos objetivos con muy alta sensibilidad; utilizando una cantidad mínima de muestra, que es un común animales presentes cuando pequeña restricción (ratas, ratones, hamster, etc.) se utilizan como modelos para abordar aspectos de enfermedades humanas. Como un ejemplo representativo de este enfoque, mostramos los resultados obtenidos en el análisis del repertorio de anticuerpos naturales anti-glicanos en ratones BALB/c. Demostramos que cada ratón BALB/c en el estudio, a pesar de ser genéticamente idéntica y mantenido en las mismas condiciones, desarrolla un patrón particular de anticuerpos naturales anti-hidratos de carbono. Este trabajo pretende ampliar el uso de la tecnología de la PGA para investigar repertorio (particularidades) y los niveles de circulación de los anticuerpos anti-hidratos de carbono, tanto en la salud y durante cualquier condición patológica.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los anticuerpos desempeñan un papel central en nuestra defensa contra los invasores patógenos neutralizando directamente virus1,2 y bacterias2,3, activando el sistema del complemento4,5 y la mejora de la fagocitosis6. Además, son elementos esenciales en cáncer focalización y eliminación de las células malignas7y homeostasis mantenimiento8,9.

Trastornos del sistema inmune pueden resultar en enfermedades autoinmunes e inflamatorias cáncer de10 y11. Todas estas condiciones patológicas idealmente exigen un pronto diagnóstico para un tratamiento eficaz. En el caso de enfermedades autoinmunes, la presencia serológica de autoanticuerpos en la mayoría de los casos es un predictor para el diagnóstico de autoinmunidad10,12. Estos anticuerpos reaccionan con la superficie celular y extracelular autoantigens y, a menudo presentes durante muchos años antes de la presentación de enfermedad autoinmune10,12. Cáncer y deficiencias inmunes se diagnostican también con exámenes de sangre que sea medir el nivel de elementos inmunes como anticuerpos, o su actividad funcional11.

La identificación del repertorio de anticuerpos y sus niveles serológicos circulantes son fundamentales para establecer un pronóstico y evaluar la progresión de todas las condiciones patológicas. Previamente hemos demostrado el potencial de la técnica de la PGA para el análisis de la circulación de los anticuerpos en especies de animales13–16, minimizando el uso de grandes volúmenes de muestras serológicas, evitando el problema de asociada a anticuerpos de reactividad cruzada17 y perfiles de alto rendimiento que permite de un amplio repertorio de anticuerpos15.

Inmunoensayos basados en glicanos son principalmente condicionados, entre otros factores, por el origen y la producción de hidratos de carbono, que determinan la afinidad y Unión de ligandos15,18,19,20 ,21. Inmunoensayos basados en glicanos pueden ser desarrollados en suspensión (microesferas)15,21,22 , o en las superficies plana activado15,21,22, 23,24. Los últimos son ELISA (la más convencional de estos métodos) y PGA. No hay muchos datos que comparan estas metodologías en la misma configuración experimental15,25,26,27. Anteriormente hemos comparado la eficacia y la selectividad de estos inmunoensayos para anticuerpos anti-glicanos de perfil en las muestras de plasma humano individual15. Algunos anticuerpos como aquellos dirigidos a grupo de sangre anti-A/B, todos los inmunoensayos pueden detectar con significación estadística y correlacionó positivamente con los demás15,18,21. Mientras tanto, los anticuerpos anti-P1 se detectaron principalmente por PGA con mayor poder discriminativo y no había correlación en las determinaciones de los diferentes inmunoensayos basados en glycan15,18, 21. estas diferencias entre métodos se relaciona principalmente con el antígeno anticuerpo relación y glicanos orientación15. Arreglos de discos de ELISA y la suspensión son más susceptibles a Unión inespecífica que PGA porque hay un exceso de antígeno por anticuerpos en estos métodos15. Además, la orientación de glicanos en la PGA es más restringida que en arreglos de discos de ELISA y suspensión15. ELISA es conveniente cuando el estudio incluye un panel limitado de glicanos. Junto con arreglos de discos de suspensión, ELISA ofrece amplia flexibilidad con respecto a la reconfiguración de ensayo. PGA es excepcional conveniente para descubrimiento enfoques15,18,21,28. A pesar de estas claras ventajas y desventajas, los tres mencionados inmunoensayos podrían utilizarse para estudiar diferentes aspectos de las interacciones del anticuerpo-glicanos. El objetivo final del estudio es que guiará la selección de la metodología más adecuada.

El presente trabajo pretende ampliar el uso de la tecnología de la PGA para el análisis del repertorio de circulación de los anticuerpos anti-glicanos en pequeños animales. Como un resultado representativo, presentamos aquí un protocolo detallado para evaluar el repertorio de anticuerpos naturales anti-hidratos de carbono en ratones BALB/c adultos por PGA.

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Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Glycochips de producción

  1. Preparación de microarray
    1. Imprimir los glicanos (50 mM) y polisacáridos (10 μg/mL) en fosfato 300 mM solución salina tamponada (PBS, pH 8,5) en 6 repeticiones en portaobjetos de vidrio N-hydroxysuccinimide derivatizada, utilizando sin contacto arrayer robótica (gota volumen ~ 900 pL). Cada diapositiva contiene 4 bloques de sub conjuntos (figura 1A, en colores) repetidas 6 veces. Cada solo arreglo de discos secundario está formado por 112 puntos de glicanos diferentes, incluidos los controles (8 filas × 14 columnas) (figura 1B).
      Nota: Se proporciona información relacionada con glicanos en el complementario tabla 1. La biblioteca de glicanos utilizada para impresión de microchips es el resultado de un esfuerzo sintético a largo plazo del equipo IBCh. ejemplos de síntesis se describen en publicaciones relacionadas29,30,31,32,33,34,35,36 ,37,38. La biblioteca de glicanos incluye antígenos de grupo sanguíneo y algunos de los más con frecuencia ocurrir oligosacáridos terminales, así como motivos principales de mamíferos N - y O-linked glicoproteínas y glicolípidos, antígenos de hidratos de carbono asociados a tumor, y polisacáridos de las bacterias patógenas.
    2. Incubar los portaobjetos en cuadro de humedad (humedad relativa de ~ 70%) a temperatura ambiente (25 ° C) durante 1 hora.
    3. Bloqueo de microarrays: Incube los portaobjetos durante 1,5 horas con solución amortiguadora de bloqueo a temperatura ambiente (100 m m el ácido bórico, etanolamina 25 mM, de 0.2% (v/v) Tween-20 en agua ultrapura).
    4. Lave el glycochip con agua ultrapura y seque por el aire.
  2. Control de calidad Glycochip
    1. Analizar dos microarrays de cada lote utilizando solución de 1mg/mL de la preparación de complejos de inmunoglobulina (CIP, que contiene IgG, IgM e IgA), 10 μg/mL de solución de inmunoglobulinas de antihumano de cabra biotinilado como un anticuerpo secundario (IgM + IgG + IgA), seguido de 1 μg/mL solución de conjugado estreptavidina fluorescentes correspondientes (mediante el protocolo descrito a continuación, consulte el paso 2).
    2. Explorar y analizar el glycochips (vea el paso 3, análisis de glicanos matriz).
    3. Utilice lotes de microarray con chip intra y inter correlación superior a 0.9.

2. glicanos matriz técnica

  1. Preparar las siguientes soluciones acuosas (en agua ultrapura) y almacenar a temperatura ambiente (25 ° C):
    • Tampón de 1: 1% (p/v) albúmina de suero bovino (BSA) en PBS, 1% Tween-20 (v/v) y 0,01% (p/v) NaN3
    • Tampón de 2: 1% (p/v) BSA en PBS, 0,1% Tween-20 (v/v) y 0,01% (p/v) NaN3.
    • Tampón-3: 0,1% (v/v) Tween-20 en PBS.
    • Buffer-4: 0.001% (v/v) Tween-20 en PBS.
  2. Glycochip y muestra la preparación de
    1. Poner la caja de almacenaje con las diapositivas sobre la mesa hasta que alcancen temperatura ambiente (25 ° C).
      Nota: Use guantes de látex sin polvo. El glycochip debe ser manipulado por la parte inferior de la diapositiva de cristal, donde se encuentra el código de barras. El código de barras le ayudará a identificar el lado derecho, evitando el contacto con la superficie donde se imprimen los glicanos.
    2. Abra la caja, tome la glycochip y colocar en la cámara de incubación (25 ° C), ya acondicionada con papel filtro húmedo para mantener humedad constante dentro de la cámara.
    3. Mientras tanto, diluir el suero de ratones con Buffer-1 (1:20) en tubos de 1,5 mL. Homogeneizar la solución de suero (5 s) con un mezclador de tipo vórtex.
      Nota: El volumen necesario para cubrir totalmente una superficie glycochip solo es de aproximadamente 1 mL.
    4. Después de la homogeneización, incubar el suero diluido a 37 ° C durante 10 min en un baño de agua para evitar la agregación de la inmunoglobulina. Centrifugar los tubos durante 3 minutos a 10.000 x g y 25 ° C, recoger el sobrenadante y desechar cualquier material precipitado.
    5. Lugar la glycochip cuidadosamente en la cámara de incubación. Incubar por 15 min a 25 ° C con 1 mL de tampón-3 para eliminar cualquier material residual en la superficie de la glycochip de.
    6. Sostenga el glycochip en posición vertical y lavar con algunas gotas de Buffer-3 con una pipeta Pasteur plástica. Retire con cuidado el búfer de la superficie de glycochip utilizando papel de filtro.
  3. Reacción: anticuerpos enlace
    1. Lugar la glycochip en la cámara de incubación. Se separó la muestra de suero diluido sobre la superficie de glycochip con una micropipeta. Incubar con agitación orbital (30 rpm) a 37 ° C por 1,5 h. Asegúrese de que toda área seca de la superficie glycochip está cubierta por la muestra de suero diluido con la punta de la pipeta.
    2. Quitar cualquier muestra de exceso y sumerja la glycochip durante 5 minutos en tampón de 3 a 25 ° C. Luego, mueve el glycochip a un recipiente con Buffer-4 (5 min) y finalmente lave (5 min) glycochip con agua ultrapura. Centrifugue el glycochip durante 1 min a 175 x g y 25 ° C para extraer el líquido.
  4. Detección: anticuerpo secundario
    1. Lugar la glycochip en la cámara de incubación. Extender por la superficie glycochip una solución (5 μg/mL) de cabra anti-ratón (IgG + IgM) conjugado con biotina en el Buffer 2. Incubar con agitación orbital (30 rpm) a 37 ° C durante 1 hora.
    2. Eliminar la fracción no unida y repita los pasos de lavado.
    3. Después de la centrifugación, incubar el glycochip en oscuridad a 25 ° C por 45 min (30 rpm) con 2 μg/mL de la solución correspondiente de streptavidina marcado con fluorocromo (en Buffer-2).
    4. En la oscuridad, eliminar la fracción no unida y repita los pasos de lavado.
    5. Seque el glycochip por el aire.
      Nota: Glycochip debe analizarse tan pronto como sea posible. Pero si es imposible escanear inmediatamente después de la tinción, los glycochips pueden almacenarse en un lugar fresco y seco en la oscuridad.

3. Análisis de glicanos matriz

  1. Análisis de la matriz
    1. Deje el glycochip sobre la mesa hasta que alcance la temperatura ambiente en oscuridad. Al mismo tiempo, encienda el escáner de diapositivas y el láser (longitud de onda de excitación de 633 nm).
    2. Sujetando el microarray, deslice el glycochip en la ranura hasta que toque la parte posterior.
    3. Escanear el glycochip ("exploración fácil ejecución") y guardar la exploración como un ". Archivo TIFF".
  2. Cuantificación de la matriz
    1. Cuantificar la matriz mediante un sistema de análisis ScanArray. Abrir imágenes, escaneadas previamente haciendo clic en "Archivo" en el "grupo de configuración y archivo" en la ventana principal (figura 1B-D)
    2. Cargar la plantilla de archivo de matriz correspondiente en formato GAL (disposición de glycans impresa sobre el portaobjetos de cristal) (figura 1).
    3. Ajustar plantilla GAL alineando cuidadosamente la matriz (rejillas) con los puntos de la imagen e iniciar la cuantificación (figura 1).
    4. Seleccione los parámetros de cuantificación:
      • Tipo de cuantificación: Quant fácil de ejecutar.
      • Método de cuantificación: fija el círculo de
      • Auto encontrar puntos: Desmarque todas las opciones
      • Método de normalización: Huevos (diagrama de dispersión localmente ponderada suavizado).
    5. Guardar los datos cuantificados como ". Archivo CSV"(figura 1). Transferir estos datos a un archivo común de la hoja de cálculo con Microsoft Excel u otra aplicación apropiada.
    6. Utilizar el rango intercuartil (IQR) como el método principal de la estadístico: cálculo de la mediana (cuartil 2) de todas las señales para cada ligando y la desviación intercuartil (percentiles 75 y 25, o cuartiles superiores e inferiores Q3 y Q1, respectivamente).
    7. Realizar exploración interactiva de datos mediante una aplicación de explorador de Clustering jerárquico.
    8. Usar parámetros de clustering: ligamiento promedio (UPGMA) y distancia Euclídea como similitud la distancia medida. Realizar clustering jerárquico por filas sin normalización.

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Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aquí, presentamos un resumen de resultados representativos obtenidos de la cuantificación del repertorio de anticuerpos naturales anti-glicanos en una población de ratones BALB/c 20. El glycochips utilizado en este estudio contenía 419 glycan diferentes estructuras. La mayoría glycans se sintetizaron como -CH2CH2CH2NH2 espaciador-armados O-glucósidos, en varios casos como -CH2CH2NH2 o - NHCOCH2

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Discussion

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Glycan microarrays se han convertido en herramientas indispensables para el estudio de las interacciones proteína-glicanos40. El presente trabajo describe un protocolo basado en la tecnología de la PGA para estudiar el repertorio de la circulación de anticuerpos anti-hidratos de carbono en ratones BALB/c. PGA ofrece la posibilidad a un gran número de pantalla de glycans biológico desconocido, es un descubrimiento excepcionalmente conveniente herramienta13,

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Disclosures

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Nailya Khasbiullinay Alexey Nokel son empleados de Semiotik LLC, que es el proveedor de glycochips utilizado en este estudio.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este trabajo fue apoyado por el "Fondo de Investigaciones Sanitarias" (FIS) otorgar PI13/01098 del Instituto de Salud Carlos III, Ministerio de sanidad. DB-G resultó beneficiado desde una posición de investigación postdoctoral financiada por la Unión Europea séptimo programa marco (FP7/2007-2013) bajo 603049 de acuerdo de subvención (TRANSLINK). Trabajo de NK, NS y NB fue apoyado por beca #14-50-00131 de Fundación de la ciencia rusa. DB-G quiere expresar su agradecimiento a Marta Broto, J. Pablo Salvador y Ana Sanchis de excelente asistencia técnica y Alexander Rakitko para asistencia en el análisis estadístico. Con el apoyo de la "Pla de Doctorats industriales de la Secretaria d'Universitats i Recerca del Departament empresa i Coneixement de la Generalitat de Catalunya (número 2018 DI 021). Damos las gracias a programa de CERCA / Generalitat de Catalunya para apoyo institucional.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
fuerte< / fuerte >
cabra biotinilada anti-humanoIgs Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EE. UU. Ref. #: 31782
cabra biotinilada anti-ratón IgM + IgGThermo Fisher ScientificRef. #: 31807
Equipment
Robotic Arrayer sciFLEXARRAYER S5 Scienion AG, Berlín, Alemaniahttp://www.scienion.com/products/sciflexarrayer/
Bandeja de tinción (cámara de incubación de portaobjetos)Simport, Beloeil, QC, CanadáRef. #: Centrífuga M920-2
Eppendorf, Hamburgo, Alemania  Ref. #: 5810 R
PipetasGilson, Middleton, WI, USAhttp://www.gilson.com/en/Pipette/
Escáner de portaobjetos PerkinElmer, Waltham, MA, EE. UU.ScanArray GX Plus 
Incubadora de agitaciónCole-Parmer, Staffordshire, Reino UnidoRef. #: SI50
Biological samples
BALB/c ratones suerosEste documentoN/ A
Complex Immunoglobulin Preparation (CIP)Immuno-Gem, Moscú, Rusiahttp://www.biomedservice.ru/price/goods/1/17531
Fuertes, Reactivos y Glicanos 
Glycan libraryInstitute of Bioorganic Chemistry (IBCh), Moscú, RusiaN/ A Albúmina
(BSA)Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, Ref. #: A9418
EtanolaminaSigma-AldrichRef. #: 411000
Tween-20Merck Chemicals & Ciencias de la Vida S.A., Madrid, EspañaRef. #: 655204
Solución salina tamponada con fosfato (PBS)VWR International Eurolab S.L, Barcelona, EspañaRef. #: E404
Azida sódicaSigma-AldrichRef. #: S2002
Estreptavidina Alexa Fluor 555 conjugado Thermo Fisher ScientificRef. #: S21381
Estreptavidina Cy5 conjugadaGE Healthcare, Little Chalfont, Buckinghamshire, Reino UnidoRef. #: PA45001
Materials
N-hidroxisuccinimida derivatizada portaobjetos de vidrio H Schott-Nexterion, Jena, AlemaniaRef. #: 1070936
Papel de filtro Whatman Sigma-AldrichRef. #: WHA10347509
tubos de 1,5 mLEppendorf Ref. #: 0030120086
Software y algoritmos
ScanArray Express Microarray Sistema de análisis de microarraysPerkinElmerhttp://www.per
kinelmer.com/microarray
aplicación Hierarchical Clustering ExplorerUniversidad de Maryland, MD, EE. UUhttp://www.cs.umd.edu/hcil/hce/
sérica bovina .

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