Aquí, presentamos un protocolo para la generación de pluripotentes inducidas (iPSCs) de células de fibroblastos derivados pacientes de síndrome de Li-Fraumeni (LFS), diferenciación de iPSCs a través de las células madre mesenquimales (MSCs) y osteoblastos, modelado en vivo tumorigenesis con osteoblastos derivados de paciente LFS.
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Artículo de método
Modelado de Osteosarcoma usando las células de vástago de Pluripotent inducido derivados del paciente el síndrome de Li-Fraumeni
En este artículo
Resumen
Resumen
Síndrome de Li-Fraumeni (LFS) es un desorden autosómico dominante del cáncer hereditario. Pacientes con LFS están predispuestos a varios tipos de tumores, incluyendo osteosarcoma--una de las malignidades no hematológica primarias más frecuentes en la niñez y adolescencia. Por lo tanto, LFS ofrece un modelo ideal para estudiar esta malignidad. Aprovechando metodologías de iPSC, osteosarcoma LFS-asociada se puede modelar con éxito distinguiendo LFS iPSCs paciente a las células madre mesenquimales (MSCs) y luego a osteoblastos, las células de origen de los osteosarcomas. Estos osteoblastos LFS recapitulan propiedades oncogénicas del osteosarcoma, proporcionando un sistema atractivo modelo para delinear la patogenesia del osteosarcoma. Este manuscrito demuestra un protocolo para la generación de iPSCs de fibroblastos pacientes del LFS, diferenciación de iPSCs para MSCs, diferenciación de MSCs y osteoblastos, en vivo tumorigenesis con osteoblastos LFS. Este modelo de enfermedad de iPSC puede ampliarse para identificar biomarcadores potenciales o dianas terapéuticas para el osteosarcoma LFS-asociado.
Introducción
Entre 2006 y 2007, varios resultados de avance de los laboratorios de los doctores Shinya Yamanaka y James A. Thomson condujeron al desarrollo de pluripotentes inducidas (iPSCs) de las células de vástago1,2,3. Por reprogramación de células somáticas con factores transcripcionales definidas forma iPSCs, los investigadores fueron capaces de generar células con características a saber, pluripotencia y auto-renovación, que anteriormente se pensaba que sólo existen en células madre embrionarias humanas (hESCs). iPSCs podría generarse de cualquier individuo o paciente y no tuvo que....
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Protocolo
Este trabajo fue aprobado por la Universidad de Texas Health Science Center en Houston (UTHealth) Comité de Bienestar Animal. Los experimentos se realizan en estricta conformidad con las normas establecidas por el centro de UTHealth para la medicina del Animal de laboratorio y atención (CLAMC) que es acreditado por Asociación Americana para el cuidado de Animal y laboratorio (AAALAC International). Los seres humanos en este estudio caen bajo escenario un ("No temas investigaciones en humanos") como se define en la documentación de NIH SF424. Por lo tanto, no necesita ninguna aprobación por Comité de ética de investigación UTHealth.
1. generac....
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Resultados
Este protocolo presenta los procedimientos incluyendo LFS generación de iPSC, MSC la diferenciación, diferenciación de osteoblastos y en vivo ensayo tumorigenesis con osteoblastos derivados de MSC de LFS.
Esquema para la generación de iPSCs LFS de fibroblastos mediante el uso de un virus de Sendai comercialmente disponible kit de reprogramación se muestra en la figura 1A. Entrega basada en .......
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Discusión
Para lograr una mayor eficiencia de la diferenciación de MSC, varios aspectos son críticos. Uno es la condición de la cultura de iPSCs antes de iniciar la diferenciación de MSC. El protocolo presentado en el manuscrito se basa en estudios previos 9,17. iPSCs deben ser cultivadas en MEFs durante al menos 2 semanas. Mantenimiento de iPSCs en buenas condiciones en MEFs son críticas para las células a conectar en la placa de cubierta de gelatina para la diferenciació.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
R. Z. es apoyado por UTHealth innovación para cáncer prevención formación programa recibió beca de investigación (prevención del cáncer y Research Institute of Texas grant RP160015). J.T. es apoyado por el programa de Ke Lin de la Universidad primera afiliada Hospital de Sun Yat-sen. D. F.L. es el erudito CPRIT en la investigación del cáncer y apoyo de NIH vía independencia Premio R00 CA181496 y CPRIT Premio RR160019.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Artículos de plástico | |||
| 100 mm Plato | Corning | 430107 | |
| 60 mm Plato | Corning | 430166 | |
| 6 pocillos Plato | Falcon | 353046 | |
| 12 pocillos Plato | Falcon | 353043 | |
| 48 pocillos Plato | Falcon | 353078 | |
| 1 mL punta de pipeta | USA Scientific | 1111-2721 | |
| 200 µ L punta de pipeta | USA Scientific | 1111-0706 | |
| 10 µ L punta de pipeta | USA Scientific | 1111-3700 | |
| 5 mL pipeta serológica | SARSTEDT | 86.1253.001 | |
| 10 mL pipeta serológica | SARSTEDT | 86.1254.001 | |
| 25 mL pipeta serológica | SARSTEDT | 86.1685.001 | |
| 50 mL Tubo, PP | SARSTEDT | 62.547.100 | |
| Tubo de 15 mL, PP | SARSTEDT | 62.554.100 | |
| Materiales de cultivo y reactivos | |||
| iPS 2.0 Sendai | Invitrogen | A16517 | Kit comercial de reprogramación de virus Sendai |
| Corning Matriz calificada por hESC Corning | 354277 | Matriz de membrana basal | |
| CF1 MEFs, irradiados | ThermoFisher | A34180 | |
| DMEM | Sigma-Aldrich | D5671 | |
| DMEM/F12 | Corning | 10-090-CV | |
| α MEM | Corning | 10-022-CV | |
| VástagoMACS iPS-Brew XF | Miltenyi Biotec | 130-104-368 | Comercial iPSC medio |
| KnockOut DMEM/F-12 | ThermoFisher | 12660012 | |
| FBS Opti-Gold | GenDEPOT | F0900-050 | |
| Suero KnockOut de repuesto | ThermoFisher | A3181502 | |
| Penicilina-Estreptomicina | Sigma-Aldrich | P4333 | |
| MEM Aminoácidos No Esenciales | Corning | 25-025-CI | |
| Solución de L-Glutamina | Sigma-Aldrich | G7513 | |
| 2-Mercaptoetanol | Sigma-Aldrich | M3148 | |
| FGF Humano-básico (bFGF) | PEPROTECH | 100-18B | |
| Recombinante Humano PDGF-AB | PEPROTECH | 100-00AB | |
| β-glicerofosfato | Sigma-Aldrich | G9422 | |
| Dexametasona | Sigma-Aldrich | A4902 | |
| Ácido ascórbico | Sigma-Aldrich | A5960 | |
| Solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco, 1x (DPBS) | Corning | 21-031-CV | |
| StemMACS Passaging Solution XF | Miltenyi Biotec | 130-104-688 | Solución de |
| desapego comercial Accutatse Solución de desapego de células | Corning | 25-058-CI | Solución de desprendimiento de células |
| Tiazovivina (inhibidor de ROCK) | Calbiochem | 420220 | |
| Solución de tripsina-EDTA al 0,25% | Sigma-Aldrich | T4049 | |
| Colagenasa, Tipo II | ThermoFisher | 17101015 | |
| Anticuerpo NANOG humano | R& Sistema D | AF1997 | |
| OCT4 Anticuerpo (H-134) | Santa Cruz | sc-9081 | |
| Humano/Ratón SSEA-4 Anticuerpo conjugado PE | R& Sistema D | FAB1435P | |
| Alexa Fluor 555 Ratón Anti-Humano TRA-1-81 Antígeno | DB Biosciences | 560123 | |
| Alexa Fluor 488 Burro Anti-Cabra IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 705-545-003 | |
| Alexa Fluor 488 Cabra Anti-Conejo IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 111-545-144 | |
| PE Ratón Anti-Humano CD105 | eBioscience | 12-1057-42 | |
| FITC Ratón Anti-Humano CD44 | DB Biosciences | 555478 | |
| PE Ratón Anti-Humano CD73 | DB Biosciences | 550257 | |
| Ratón PE Anti-Humano CD166 | DB Biosciences | 560903 | |
| FITC Ratón Anti-Humano CD24 | DB Biosciences | 555427 | |
| Suero de Burro | Jackson ImmunoResearch | 017-000-121 | |
| Suero de cabra | Jackson ImmunoResearch | 005-000-121 | |
| Kit de tinción de fosfatasa alcalina II | Stemgent | 00-0055 | |
| Alizarina Red S | Sigma-Aldrich | A5533 | |
| Reactivo TRIzol | ThermoFisher | 15596018 | |
| Cloroformo | ThermoFisher | C298-500 | |
| 2-Propanol | ThermoFisher | A416-4 | |
| Etanol, absoluto, grado de biología molecular | ThermoFisher | BP28184 | |
| DNasa I, libre de ARNasa (1 U/µ L) | ThermoFisher | EN0521 | |
| iScript Kit de síntesis de ADNc | BioRad | 1708891BUN | |
| iQ SYBR Green Supermix | BioRad | 1708884 | |
| Matrigel Matrix Alta concentración (HC), Corning sin rojo fenol | 354262 | Jeringa | |
| punta deslizante de 1 mL, calibre 26 x 5/8 pulgadas | DB Biosciences | 309597 |
Referencias
- Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126 (4), 663-676 (2006).
- Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult h....
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Reimpresiones y permisos
