La prueba de infección de planta: Spray y mediada por la herida la inoculación con el patógeno de planta Magnaporthe Grisea

Resumen

Aquí, presentamos un protocolo para prueba de virulencia de la planta con el patógeno de la planta grisea de Magnaporthe. Este informe contribuirá a la proyección a gran escala de los patotipos de aislamientos de hongos y servir como un excelente punto de partida para la comprensión de los mecanismos resistentes de las plantas durante la reproducción molecular.

Resumen

Las plantas poseen un potente sistema para defenderse de posibles amenazas por hongos patógenos. Plantas agrícola importantes, sin embargo, las medidas actuales para combatir estos patógenos han demostrado ser demasiado conservadoras, y por lo tanto, no suficientemente eficaz y puede potencialmente riesgos ambientales. Por lo tanto, es extremadamente necesario identificar los factores de resistencia del hospedante para ayudar a controlar enfermedades de las plantas naturalmente a través de la identificación de germoplasma resistente, el aislamiento y caracterización de genes de resistencia y la reproducción molecular de cultivares resistentes. En este sentido, es necesario establecer un método de inoculación precisa, rápida y a gran escala para criar y desarrollar los genes de resistencia de la planta. El arroz explosión patógeno hongo Magnaporthe grisea causas enfermedad severa síntomas y pérdidas de rendimiento. Recientemente, M. grisea ha emergido como un organismo modelo para estudiar los mecanismos de las interacciones planta-hongo patógeno. Por lo tanto, se presenta el desarrollo de un método de prueba de virulencia de planta que es específico para M. grisea. Este método proporciona para spray de inoculación con una suspensión conidial e hirió a inoculación con cubos de micelio o gotas de la suspensión conidial. El paso clave del método de inoculación hiriente para hojas de arroz separado es hacer heridas en las hojas de la planta, que evita cualquier interferencia causada por resistencia a la penetración host. Este spray/hiriendo a protocolo contribuye a la proyección rápida, precisa y en gran escala de los patotipos de aislamientos de M. grisea . Este integrado y método de infección sistemática planta servirá como un excelente punto de partida para obtener una perspectiva amplia de temas en Fitopatología.

Introducción

Ráfaga del arroz, causada por M. grisea, es una de las más graves enfermedades de variedades de arroz en todo el mundo^1,2. El proceso por el cual M. grisea infecta plantas hospederas incluye una producción de conidios y accesorio de la superficie, una germinación de conidias y formación de apresorio, una formación de la peg de penetración y diferenciación de la hifa infecciosas, y una enfermedad ³. todas estas etapas son comunes en muchos otros hongos patógenos de plantas, y, de hecho, un bloqueo de cualquier sola etapa previene la infección de plantas hospederas. Debido a su importancia económica y maleabilidad genética, M. grisea surgió como un organismo modelo para estudiar los mecanismos de la planta-hongo patógeno interacciones^1,4. Por lo tanto, estudiar las bases moleculares de estas etapas de desarrollo de M. grisea ayudarán a dilucidar los mecanismos moleculares subyacentes la patogenicidad de hongos y la identificación de genes diana de candidato para la proyección y diseño de la novela fungicidas⁵.

Informes recientes sobre la infección de M. grisea se han centrado en los mecanismos moleculares de las etapas de la penetración, sobre todo la conidiation, la formación de apresorio, las clavijas de la penetración y el crecimiento infeccioso^{3, 6}. por lo tanto, es esencial desarrollar un protocolo detallado para probar infección de M. grisea . Adjunto, presentamos un método detallado para una prueba de infección que utiliza análisis de infección mediada por el aerosol con una suspensión conidial y la inoculación de heridas con tapones miceliales de M. grisea. En este informe, el protocolo se centra en el cultivo de cepas, la preparación de la solución conidiation para la fumigación y la micelial mediada por el enchufe de la inoculación de plantas con M. grisea. Estos pasos se describen en detalle más adelante y una vista esquemática que muestra el flujo de trabajo del método y una lesión típica se muestran en las figuras 1 y 2, respectivamente.

Protocolo

1. aerosol de inoculación con una suspensión de conidios de M. grisea

1. Cultura fungicida para M.grisea
   1. Preparar el medio de cultivo agar (OTA) de avena tomate cepas fúngicas.
   2. Pesan 30-50 g de harina de avena, añadir a 800 mL de agua destilada/desionizada (ddH₂O) y hervir la mezcla durante 30 minutos en la olla eléctrica.
   3. Filtrar el jugo de avena hervida en el vaso a través de un trozo de Gasa.
   4. Agregar 150 mL de jugo de tomate y 20 g de agar para el filtrado en el vaso de precipitados y agregar ddH₂O hasta 1.000 mL.
2. Preparación de materiales experimentales
   1. Empapar unas 50 semillas de cultivares de arroz (Oryza sativa) Lijiangxintuan-heigu (LTH) en Dec₂O para 3 d o remoje unas 50 semillas de cebada (Hordeum vulgare cv oro promesa) ddH₂O aproximadamente 1 d.
   2. Envolver las semillas de arroz o cebada en una gasa húmeda y germinar en papel de filtro humedecido en cerca de 30 platos de Petri con un diámetro de 10 cm x 10 cm a 28 ° C. El tiempo de germinación de semilla de arroz es alrededor de 2-3 d, el tiempo de germinación de semilla de cebada es alrededor d 2. La humedad relativa en el invernadero es aproximadamente 70%.
   3. Planta las plantas de semillero del arroz o de cebada en macetas utilizando encapsulamiento suelo esterilizado y el riego y luego cubrirlas con una capa de aislante de vermiculita.
   4. Coloque las plantas en un invernadero adecuado o crecimiento gabinete a 25 ° C por aproximadamente 1 ~ 2 semanas.
   5. Cortar 3 capas de papel de filtro en los círculos con tijera quirúrgica estéril (cada círculo debe tener un diámetro de 8 cm) y colocar sobre placas de plástico estériles de 100 mm.
   6. Añadir ddH₂O a cada plato para remojar el papel de filtro.
   7. Asegúrese de que el papel de filtro esté completamente húmedo pero sin agua adicional.
   8. Eliminar cualquier exceso de agua con una bomba de vacío.
   9. Coloque 2 mondadientes estériles en la placa de cultivo para el arroz/cebada hojas; espacio los escarbadientes ~ 2-3 cm de separación.
   10. Recoger las hojas del arroz 2 semanas después de la siembra las semillas o tomar las hojas de la cebada 7 d después de la siembra de las semillas.
   11. Con 4 a 6 hojas plántulas de arroz/cebada, corte la parte inferior del tallo en ~ 5 cm de la tapa y recoger las hojas.
3. Protocolo de inoculación de aerosol
   1. La cultura la cepa fúngica en las placas de la OTA en una incubadora termostática (25 ° C) d ~ 4.
   2. Añadir 2 mL de ddH₂O usando un 0.5 - pipeta de 5 mL en cada placa de 4 días de edad.
   3. Con un asa de inoculación, raspar el micelio de la cepa de tipo salvaje de M. grisea y la cepa mutante en restos de micelio.
   4. Recoger los restos de micelio y transferirlo a una placa nueva de OTA. Tomar la ruina del micelio y el golpe seco en la mesa de trabajo limpia.
   5. Cubra la placa con 3 capas de gasa para asegurar la humedad necesaria para el crecimiento de los conidios en un invernadero a 25 ° C en el día (14 h) y a 23 ° C en la noche (10 h) durante 24-48 h.
   6. Añadir 2 mL de ddH₂O a cada plato y raspar suavemente los conidios con torundas de algodón estériles, seguidas de una filtración a través de 2 capas de papel de lente. Tenga cuidado de no rayar la superficie del medio de cultivo.
   7. Transferir la suspensión de conidios en un nuevo tubo de 50 mL con una pipeta de 100-1.000 μl.
   8. Centrifugar durante 5 minutos a un mínimo de 5.000 x g a 25 ° C.
   9. Quite el sobrenadante y resuspender el precipitado para dar 2 x 10⁴ conidios por mL en un 0,025% (v/v) solución de Tween-20. La solución de Tween-20 es generalmente alrededor 10-20 mL.
   10. Verter la suspensión de esporas en un rociador de mano.
   11. Esterilización aproximadamente 10 mL de la suspensión conidial en las hojas de arroz de las plántulas de 2 semanas de edad arroz o cebada hojas de plántulas de cebada 7 días de edad e incúbelos a 25 ° C en una cámara oscura, húmeda de ~ 24 h. aerosol las plantas control con 0,025% (v/v) solución de Tween-20.
   12. Transferir las hojas en otra cámara húmeda bajo luz fluorescente a 25 ° C para un fotoperíodo de 12 h.
   13. Registrar los síntomas de la enfermedad a los 5 días después de la inoculación. Examinar las hojas de arroz enfermas/cebada ~ 6 cm de longitud. La evaluación estándar está según el sistema de puntuación para la resistencia de la explosión del Instituto Internacional de investigación de arroz (IRRI). Los detalles del sistema de puntuación para la resistencia de la explosión se muestran en la tabla 1.
   14. Fotografiar las hojas para evaluar la infección de las cepas probadas. La infección fue determinada por el número de lesiones por 3,6 cm².

2. herida de inoculación con cubos de micelio o gotas de la suspensión Conidial de M. grisea

1. Utilizando una aguja anatómica, rasque tres heridas largo 2-3 cm en las venas principales de las hojas de arroz/cebada individual; Tenga cuidado de no para penetrar en las hojas.
2. Poner las hojas raspadas en palillos de dientes y un 0,02% (v/v) solución de Tween-20 en las hojas para formar una capa de gotitas de aerosol.
3. Cortar un enchufe micelial de 0,5 x 0,5 cm para cada cepa de M. grisea (cepas del tipo salvaje, mutante, complemento y otras cepas de prueba) de una placa OTA.
4. Poner los tapones miceliales o gotas de 25 μl de la suspensión conidial en los heridos deja e incubar las hojas a 25 ° C en cámara húmeda durante 3-8 días.
5. Examinar las lesiones en inoculación tras 5-7 días. El método de examen es el mismo como lo fue para el método de inoculación del aerosol (ver paso 1.3.13).
6. Examinar las hojas de arroz enfermas/cebada ~ 6 cm de longitud y fotografiarlos para evaluar la infección de las cepas probadas. La infección fue determinada por el número de lesiones por 3,6 cm².

Resultados

El flujo de trabajo para la técnica se muestra en la figura 1. Los ensayos de infección de la planta fueron realizados en 14 días de edad susceptibles de arroz (o. sativa cv CO-39) o las hojas de cebada de 7 días de edad susceptible (H. vulgare cv oro promesa)^7,8,9. Para comprobar una infección en las hojas de arroz, una suspensión conidial (1.0 x 1...

Discusión

Genes de resistencia a la enfermedad de planta juegan un papel esencial en la prevención de infecciones por patógenos, incluyendo hongos patógenos^1,12. Ráfaga del arroz se ha utilizado como modelo para comprender la naturaleza de las estructuras de población de patógeno y a la identificación de genes de resistencia de planta⁴. Por lo tanto, es necesario examinar el genotipo de resistencia a la enfermedad y avirulencia genotipos de las prin...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Papel de filtro	de la marca GE Healthcare (Suecia)
tubo de 50 ml	CORNING(Amercia)	430290
Centrífuga	Eppendorf(Amercia)	5804R
Plato de cultivo	Thermofisher(Amercia)	150326
pipeta de 0,5-5 mL	Eppendorf
Pipeta de 100-1000 uL	Eppendorf	4920000083
Bomba de vacío	Leybold	D25B
Aguja de disección	FST	26000-35
Incubadora	MEMMERT	PYX313
Anillo de inoculación	Greiner Bio One	731175

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