Este protocolo describe el labyrinthectomy quirúrgica de una rata, que es un método útil para el estudio del sistema vestibular.
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Artículo de método
Labyrinthectomy quirúrgica de la rata para el estudio del sistema Vestibular
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Resumen
Resumen
Para estudiar el sistema vestibular o el proceso de compensación vestibular, se han desarrollado varios métodos para causar daño vestibular, que incluye labyrinthectomy quirúrgica o química y la neurectomía vestibular. Labyrinthectomy quirúrgica es un método relativamente simple, confiable y rápido. Aquí, describimos la técnica quirúrgica para rata labyrinthectomy. Bajo anestesia general se realiza una incisión postauricular para exponer el canal auditivo externo y la membrana timpánica, después de que la membrana timpánica y los huesecillos se quitan sin estribo. La arteria del estribo, que está situada entre el estribo y la ventana oval, es una estructura vulnerable y debe ser preservada para obtener un campo quirúrgico claro. A la ventana del vestíbulo se realiza un orificio con una broca de taladro de 2,1 mm superior al del estribo. Entonces, 100% de etanol es inyectado a través de este orificio y aspira varias veces. Meticulosa disección bajo un microscopio y un esmerado control de sangrado son esenciales para obtener resultados fiables. Los síntomas de la pérdida vestibular, como nistagmo, inclinación de cabeza y un movimiento de balanceo, se observan inmediatamente después de la cirugía. La prueba rotarod o rotación de la silla puede utilizarse en forma objetiva y cuantitativamente evaluar la función vestibular.
Introducción
El órgano vestibular es esencial para el control del equilibrio y el ojo. Una función vestibular normal depende simétricas señales aferentes de los órganos vestibulares en los dos oídos internos. Hipofunción vestibular o pérdida induce mareo, nistagmo y desequilibrio postural. Después de daño agudo, la función vestibular se recupera espontáneamente en varios días, un proceso conocido como compensación vestibular1,2. La compensación vestibular de déficit estático es un proceso de recuperación relacionados con el desequilibrio de la actividad espontánea de reposo entre los núcleos vestibulares ipsolaterales y contralaterales. La compensación vestibular de déficit dinámico se logra principalmente a través de sustitución sensorial y de comportamiento (usando entradas visuales o somatosensoriales)3. Estos procesos son atractivos para los estudios de plasticidad neuronal4,5.
Se han desarrollado una serie de métodos para estudiar el sistema vestibular y los mecanismos que sustentan la plasticidad neuronal durante la compensación vestibular, labyrinthectomy química y quirúrgica como neurectomía vestibular5,6 ,7,8. Neurectomía vestibular es la manera de inducir pérdida vestibular completa, pero es un procedimiento más invasivo y difícil y puede inducir daño cerebral8,9. Este método requiere mayor habilidad quirúrgica y toma más tiempo que labyrinthectomy. Labyrinthectomy química incluyendo gentamicina, arsanilate y tetracaína, es más fácil y puede producir resultados confiables10,11,12. Sin embargo, también puede dañar la cóclea y pérdida vestibular puede desarrollar con el tiempo11. Además, los efectos de las sustancias químicas en el cerebro, que deben preservarse para la evaluación precisa, son claros. Labyrinthectomy quirúrgico introdujo por primera vez en estudios en animales en 184215 y primero fue divulgado en la rata en 193616. Esta técnica se ha utilizado desde entonces en muchos animales estudios5,17,18,19. Labyrinthectomy quirúrgica es un método específico, fiable y relativamente sencilla. 13 , 14 por otra parte, los síntomas de daño vestibular se observan inmediatamente después de la cirugía. Aquí, Describimos nuestra técnica quirúrgica para la rata labyrinthectomy.
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Protocolo
Este estudio fue realizado conforme a cuidado institucional del Animal y uso Comité de Seúl Universidad Hospital Nacional (14-0148-C1A1), que está acreditado por la Asociación para la evaluación y la acreditación de laboratorio Animal Care Internacional.
Nota: Los experimentos fueron realizados en ratas macho Sprague-Dawley (SD) de 7-8 semanas de edad (200/250 g). Cada animal se aclimata a las condiciones del laboratorio durante 1 semana antes del inicio del experimento. Los animales fueron alojados en una sala de control de temperatura y humedad con una constante de 12-h:12-h luz: oscuridad del ciclo con libre acceso al alimento y al agua.
1. Labyrinthectomy
- Cubrir los instrumentos quirúrgicos autoclave con un paño estéril. Desinfectar la zona de corte con etanol al 70%. Utilice un paño estéril y mantener las condiciones estériles durante la cirugía.
- Una bata, mascarilla (a cubierta de la nariz y la boca), cap (para cubrir la cabeza) y un par de guantes estériles. Los instrumentos quirúrgicos sólo deben entrar en contacto con superficies estériles.
- Inyectar anestésico tiletamina-zolazepam (40 mg/kg de peso corporal) por vía intramuscular en el muslo medial o por vía intraperitoneal y xilacina (10 mg/kg de peso corporal) por vía intramuscular o por vía intraperitoneal.
Nota: Otros modos de la anestesia general, incluyendo la inhalación isoflurano, también pueden ser utilizados. - Colocar la rata en una cubierta térmica de colchón (establecido inicialmente a 42 ° C). Aplique ungüento oftálmico lubricante en ambos ojos de la rata para evitar la sequedad del ojo bajo anestesia.
- Colocar la rata en su lado derecho. Afeitarse la piel en el área quirúrgica con cortar el pelo. Desinfectar el sitio con etanol al 70%.
- Inyectar por vía subcutánea el clorhidrato de lidocaína 1% en el área retroauricular izquierda.
- Usando una hoja de bisturí #15, hacer una incisión ~5.0 cm retroauricular. Separar el músculo y la fascia para exponer el canal auditivo externo con tijeras de Iris (figura 1A). Abrir ligeramente el conducto auditivo externo utilizando la hoja #15 o las tijeras de Iris (figura 1B). Ampliamente exponer la membrana timpánica (figura 2A).
- Bajo el microscopio (7.5 X o 12.5 X), retire la membrana timpánica y los huesecillos con la excepción del del estribo, utilizando las pinzas. Soltar los músculos en el canto lambdoidal con hoja #15 o las tijeras de Iris (figura 2B).
- Usando un taladro a baja velocidad (< 3000 rpm) con fresas de diamante (2.1 o 1,4 mm), perforar el hueso de la bulla timpánica alrededor del punto de salida del nervio facial (Figura 3A). Identificar la arteria estapédica. Tenga cuidado para no dañar la arteria stapedial durante el proceso de perforación.
- Seguir perforando el vestíbulo superior de la arteria stapedial y exponen la ventana redonda y el huesuda del canal semicircular lateral. Abra el canal semicircular lateral cerca de la ampolla. Continuar en el plano del canal semicircular lateral de perforación y perforar la ampolla del canal semicircular superior.
- Aspire el contenido del portal usando una aguja 18 G o 22 G. Inyectar y aspirar de 1 cm3 de etanol al 100% 3 x.
- Cerca de los músculos y la piel en dos capas con suturas interrumpidas simples.
- No descuide un animal hasta que ha recuperado la conciencia suficiente para mantener el recumbency esternal. Mantener la rata caliente hasta que despierta con una almohadilla eléctrica o una lámpara de calor. Después de despertar, mover la rata en una jaula individual en una sala con las condiciones ambientales generalmente.
- Administrar antibióticos (p. ej., cefazolina 20 mg/kg, trimetoprima-sulfonamida 100 μl por vía subcutánea, o penicilina 300.000 IU) según sea necesario en el día 1; un analgésico (no un opioide; por ejemplo, Metacam Carprofen 2 mg/kg 5 mg/kg por vía subcutánea) también se puede dar.
2. simulacro de cirugía
- Para la cirugía simulada como control, realizar los mismos procedimientos quirúrgicos y post quirúrgicos (según la sección 1), incluyendo la exposición del canal auditivo externo y la membrana timpánica (paso 1.7), la eliminación de la membrana timpánica y los huesecillos y la la separación de los músculos en la lambdoidal ridge (paso 1,8), pero no abra el canal semicircular o inyectar etanol.
3. comprobar la pérdida de la función Vestibular
Nota: La pérdida de la función vestibular puede ser evaluada usando cualquiera de los dos pruebas de la función vestibular o comportamiento. 13 , 17 , 18 pruebas conductuales incluyen la evaluación de la asimetría postural y nistagmo.
- Identificar asimetría postural que incluye espontáneo o evocado barril-balanceo, cayendo a la izquierda, o moverse mientras que se inclina hacia el lado lesionado18. Ver Video 1.
- Identificar nistagmo mediante una inspección visual de los movimientos oculares voluntarios. Cuando no existe nistagmo espontáneo en el estado de reposo, soplo aire suavemente sobre la cabeza de los animales18. Ver Video 2.
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Resultados
El éxito de la cirugía fue validado por pruebas de comportamiento. Todos los animales exhibieron el comportamiento típico de una pérdida unilateral de la función vestibular. Barril-balanceo espontáneo fue evidente inmediatamente después de la cirugía, siendo evocada por un soplo de aire sobre la cabeza o un ligero toque al cuerpo en la fase de recuperación temprana (Video 1). 3 d después de la cirugía, los animales mueve alrededor que se inclina hacia el lado lesionado co...
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Discusión
Esta técnica es un método útil para crear pérdida de la función vestibular brusca, permanente y completa. Esto podría utilizarse para estudiar patologías vestibulares, como la neuritis vestibular, tumor acústico y la enfermedad de Meniere. Muchos estudios han utilizado esta técnica para estudiar la plasticidad neuronal de los núcleos vestibulares o el proceso central relacionados con5,17,18,19....
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Esta investigación fue apoyada por una donación de Corea salud tecnología R & D proyectos a través de la Corea salud industria desarrollo Institute (KHIDI), financiado por el Ministerio de salud y bienestar, República de Corea (número: HI15C2651).
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| ASPIRADOR KB-012 | KOH BONG & CO., LTD. | KB-012 | Aspirador médico |
| Cuchilla: #15 | Fine Science Tools | #10015-00 | Cuchillas para mangos de bisturí #7, #15 Fresas |
| acero al carbono | Fine Science Tools | #19007-05 diámetro del | eje: 2,3 mm, longitud: 44 mm, paquete de 10 fresas |
| Carl Zeiss Surgical GmbH | Carl Zeiss | #6627100863 | Microscopio quirúrgico |
| Dumont #3c | Fine Science Tools | #11231-20 | Punta estándar 0,17 x 0,10 mm, 11 cm |
| Dumont #5SF | Fine Science Tools | #11252-00 | |
| Dumont #7B | Fine Science Tools | #11270-20 | Dentado 0,17 x 0,10 mm, 11 cm |
| Extra Fine Bonn: recto | Fine Science Tools | #14084-08 | Tijeras de iris, las más adecuadas para la microdisección con gran aumento |
| Tijeras de iris fino: rectas | Fine Science Herramientas | #14094-11 | Hecho de acero inoxidable martensítico, combinado con molibdeno y vanadio |
| Finger Loop Ear Punch | Fine Science Tools | #24212-01 | 1 mm. Proporciona estabilidad y control para los investigadores que utilizan el sistema de numeración |
| Hartman | Fine Science Tools | #13002-10 Ancho de | punta: 1 cm, dentada, 10 cm |
| Mango de bisturí corto #7 | Solid Fine Science Tools | #10003-12 | #7 Cauterizador corto de 12 cm |
| recipientes pequeños | Fine Science Tools | #18000-03 Punta de | repuesto, bisturí recto, mantiene el sangrado al mínimo y, por lo tanto, proporciona un campo quirúrgico libre de pinzas y hemostáticos |
| Strong 207S | SAESHIN | 207S | Potente par a baja velocidad, disponible con control de velocidad o de pie de encendido/apagado |
| Tubos de succión | JEUNGDO B& P CO., LTD. | H-1927-8 | Frazier, 18 cm |
| VICRYL | ETHICON | W9570T | Sutura quirúrgica estéril sintética absorbible |
| Weitlaner-Locktite | Fine Science Tools | #17012-13 | Extensión máxima: 4,5 cm, 2 x 3 dientes romos, 11 cm |
| Zoletil | Virbac, Francia | Tiletamina-zolazepam | |
| Rompun | Bayer | Xylazine | |
| Rimadyl | Pfizer | Carprofeno | |
| Septra | Pfizer | Trimetoprim-sulfonamida |
Referencias
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