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Artículo de método

Generación del primer corazón campo-como progenitores cardiaca y Ventricular como cardiomiocitos desde células madre humanas pluripotentes

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DOI:

10.3791/57688

⸱

19 de junio de 2018

 ,  , 
1Sanford Burnham Prebys Medical Discovery Institute, 2Department of Bioengineering, University of California at San Diego

* These authors contributed equally

En este artículo

Resumen

Aquí describimos un método escalable, con una simple combinación de activina A y mediada por el lentivirus Id1-sobreexpresión, para generar progenitores cardiacos primera de corazón como campo y ventricular como cardiomiocitos desde células madre humanas pluripotentes.

Resumen

La generación de grandes cantidades de progenitores cardiaca derivadas de células madre pluripotentes humanas funcionales y cardiomiocitos de origen de campo de corazón definidos es un requisito previo para celular cardiacas terapias y modelos de enfermedad. Recientemente hemos demostrado que los genes de Id son necesarios y suficientes para especificar los primeros progenitores de campo de corazón durante el desarrollo de vertebrados. Este protocolo de diferenciación aprovecha estos resultados y utiliza Id1 sobreexpresión en combinación con la activina A como potentes señales especifica para producir los primeros progenitores de (FHF-L) de campo como de corazón. Importante, progenitores que resulta distinguen eficientemente (~ 70-90%) en cardiomiocitos ventriculares como. Aquí describimos un método detallado para 1) generar hPSCs overexpressing Id1 y 2) diferenciar cantidades escalables de progenitores de FHF-L cryopreservable y cardiomiocitos ventriculares como.

Introducción

Producción a gran escala de las células madre pluripotent humanas (hPSCs)-derivados progenitores cardíacos y cardiomiocitos es un requisito previo para terapias basadas en células madre1, modelo2,3 y la caracterización rápida de la enfermedad nuevos caminos que regulan diferenciación cardiaca4,5,6 y fisiología7,8. Aunque un número de estudios9,10,11,12,13,14,15 han descrito previamente altamente eficiente protocolos de diferenciación cardiaca de hPSCs, ninguna ha abordado el origen de campo de corazón de cardiomiocitos resultante, a pesar de la identificación de diferencias moleculares entre izquierda (primer campo del corazón) y derecha (segundo campo del corazón) cardiomiocitos ventriculares16 y la existencia de enfermedades cardíacas congénitas corazón campo específico; es decir, corazón izquierdo hipoplásico síndrome17 o arritmogénica displasia ventricular correcta18. Así, la generación de progenitores cardíacos y cardiomiocitos de origen de campo de corazón definidos de hPSCs se está convirtiendo en una necesidad para aumentar su relevancia como terapéuticas y herramientas de modelado de la enfermedad.

Este protocolo se basa en la sobre-expresión constitutiva de Id1, un recientemente identificado5 primer corazón campo especificando localización que en combinación con la activina A, es necesario y suficiente para iniciar la cardiogenesis en hPSCs. En particular, Cunningham et al. (2017) 5 muestran que progenitores Id1-inducida específicamente expresan primer campo del corazón (HCN4, TBX5) pero no segundo marcadores de campo de corazón (SIX2, ISL1) como sufren diferenciación cardiaca. Además, los autores muestran también que desarrollar embriones de ratón transgénico que carece de toda la familia de identificación de los genes (Id1-4), sin formar primer corazón campo cardiaco progenitores, mientras más medial y posterior de progenitores cardíacos ( segundo campo del corazón) puede todavía formar, tal modo sugiriendo que Id proteínas son esenciales para iniciar el primer corazón campo cardiogenesis en vivo. Convenientemente, progenitores Id1-inducida puede ser criopreservados y diferenciarse espontáneamente en cardiomiocitos mostrando ventricular-como características, incluyendo la expresión de marcadores específicos de ventricular (IRX4, MYL2) y ventricular como los potenciales de acción.

Aquí describimos un método simple y escalable para generar primeros progenitores cardiacos (FHF-L) de corazón como campo y cardiomiocitos ventriculares como de hPSCs expresando Id1. Una característica importante de este protocolo es la posibilidad de desacoplar la generación progenitora cardiaca de la producción de cardiomiocitos posterior usando un paso conveniente de criopreservación. En Resumen, este protocolo detalles de las medidas necesarias para (1) generar hPSCs overexpressing Id1, (2) generar progenitores cardiacos FHF-L de hPSCs, (3) progenitores resultantes de criopreservar y (4) reanudar la diferenciación cardiacas progenitoras de FHF-L y generar altamente enriquecido (> 70-90%) superando a cardiomiocitos ventriculares como.

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Protocolo

1. infección y la preparación de Virus Id1

  1. Generar Id1 expresando lentivirus por transferencia Co pCMVDR8.74, pMD2.G y pCDH-EF1-Id1-PGK-PuroR (Addgene: plásmido 107735 #) en las células HEK293T. Recoger partículas virales, filtrar, purificar del sobrenadante y almacenar a-80 ° C como en Kitamura et al. (2003) 19. producir alternativamente, Id1 lentivirus comercialmente enviando pCDH-EF1-Id1-PGK-PuroR a un proveedor de productores de lentivirus.
    PRECAUCIÓN: Siga lentivirales normativas y protocolos de operación estándar.
    Nota: Importante: título de virus óptima debe estar por lo menos 108 109 Transducing unidades/mL (TU/mL).
  2. Antes de la infección, aplicar un pocillo de una placa bien 96 con 50 μl de reactivo de la capa, típicamente una mezcla de proteína gelatinosa secretada por células de sarcoma de ratón de Engelbreth-Holm-Swarm (véase Tabla de materiales).
  3. Disociar el bien de las células de vástago pluripotent cultivado en una placa bien 6 añadiendo 1 mL de PBS sin Ca2 + y Mg2 + y con 0,5 mM de EDTA.
    Nota: Tiempo de disociación varía de 3 a 10 min. Cuando más del 80% de las células son separado de la parte inferior de la placa, proceder al siguiente paso.
  4. Recoger la suspensión celular con pipeta estéril en tubo de centrífuga de plástico de 15 mL.
  5. Neutralizar el reactivo de disociación con 5 mL de PBS que contenga Ca2 + y Mg2 +.
  6. Pellet de células por centrifugación (200 x g durante 3 min).
  7. Eliminar el sobrenadante y chasquear suavemente el tubo para desalojar la pelotilla.
  8. Resuspenda las células en 1 mL de medio de células madre.
  9. Contar las células usando un contador de células automatizado siguiendo las instrucciones del proveedor.
  10. Células viables de placa 20.000 por cubierto bien (placa de 96 pocillos) en 50 μl de células madre medios suplementados con 2 inhibidor de camino de RHO/ROCK μm (ver tablas 1 y 2).
  11. Después de 24 h, monitor para el accesorio de celular y reemplazar medios con 100 μl célula de vástago medios suplementada con 2 μm RHO/ROCK vía inhibidor y bromuro de hexadimethrine de 6 ng/mL (ver cuadros 1 y 2), una h antes de la infección lentivirales.
    Nota: Las células deben estar firmemente sujetas en la parte inferior de la placa.
  12. Descongelar el Id1-lentivirus en hielo.
  13. Agregar 3 μl de lentivirus purificada por pozo (título del virus debe estar entre 108 109 TU/mL) y luego transferir la placa a incubadora de cultivo celular (37 ° C, 5% CO2, 20% O2).
  14. infección post-viral 24 h, añadir 100 μl de células frescas de medios a las células infectadas.
  15. infección post lentivirales de 48 h, reemplazar virus que contienen los medios de comunicación con 200 μL de células frescas medios suplementados con 1 puromicina μg/mL.
  16. Actualizar los medios de comunicación diariamente con 200 μL de células madre medios suplementados con 1 puromicina μg/mL.
  17. Cuando las culturas llegan a 80% de confluencia, disociar las células con 200 μL de PBS sin Ca2 + y Mg2 + + 0,5 mM EDTA (para un pozo de una placa de 96 pocillos).
  18. Recoger la suspensión de células en un tubo de centrífuga.
  19. Neutralizar el reactivo de disociación con 5 mL de PBS que contenga Ca2 + y Mg2 +.
  20. Pellet de células por centrifugación (200 x g durante 3 min).
  21. Eliminar el sobrenadante y chasquear suavemente el tubo para desalojar la pelotilla.
  22. Resuspenda las células en 1 mL de células madre medios suplementados con 2 inhibidor de camino de RHO/ROCK μm.
  23. Transferencia de todas las células (1 mL) a un revestido de una placa de 12 pozos.
  24. Después de 24 h, monitor para la fijación de células a los medios bien y reemplazar con 1 mL de medios de comunicación de la célula de vástago complementado con inhibidor de la vía de 2 μm RHO/ROCK y bromuro de hexadimethrine de 6 ng/mL, una h antes de la transducción de señales.
  25. Descongelar el Id1-lentivirus en hielo.
  26. Añadir 5 μl de virus purificado por pozo (placa de 12 pozos).
  27. infección post lentivirales de 24 h, reemplazar virus que contienen los medios de comunicación con 1 mL de medio fresco células complementado con 3 puromicina μg/mL.
  28. 48 horas post infección lentivirales, reemplazar virus que contienen los medios de comunicación con 1 mL de células frescas medios suplementados con 6 puromicina μg/mL.
  29. Cuando las culturas llegan a 80% de confluencia, disociar las células con 500 μl de PBS sin Ca2 + y Mg2 + y con 0,5 mM EDTA (para un pozo de una placa de 12 pozos).
  30. Transferencia de la mitad (250 μL) de la suspensión celular en un pozo de un reactivo de capa cubierta placa de 6 pozos que contienen 2 mL de células madre medios suplementados con 2 inhibidor de camino de RHO/ROCK μm.
  31. Use la otra mitad (250 μL) de la muestra para la extracción de RNA y qRT-PCR para determinar lentivirales mediada Id1 niveles de expresión, como en Colas et al. (2012) 4.
    Nota: Importante: si niveles de expresión de mRNA de Id1 están menores que 0.005 veces de niveles de expresión de la GAPDH (ver tabla 3 para imprimaciones de qRT-PCR), repita el proceso de infección descrita hasta superan los niveles de la expresión de Id1 el umbral.

2. hPSCsId1 mantenimiento

  1. HPSCsId1 en placas de pocillos 6 revestidas de la cultura y crezca en 3 mL por pocillo de la célula de vástago medios suplementada con 6 puromicina μg/mL.
  2. Cuando hPSCsId1 llegar a 80% de confluencia, las células de paso como agregados (1:6 split ratio) con reactivo de disociación enzima libre siguiendo las instrucciones del proveedor y crecen en 3 mL por pocillo de la célula de vástago medios suplementada con 6 puromicina μg/mL.

3. preparación de hPSCsId1 para la diferenciación

  1. Cubrir una placa de 12 pozos con 500 μl por pocillo del reactivo de capa.
  2. Cuando hPSCsId1 alcanzar 90% confluencia disociar las células añadiendo 1 mL de PBS sin Ca2 + y Mg2 + y con 0,5 mM EDTA bien durante 5 – 10 minutos Compruebe proceso disociación cada minuto, y una vez que el 80% de las células son disociado de la placa , proceder al siguiente paso.
  3. Recoger la suspensión de células en un tubo de centrífuga.
  4. Neutralizar el reactivo de disociación con 5 mL de PBS que contenga Ca2 + y Mg2 +.
  5. Pellet de células por centrifugación (200 x g durante 3 min).
  6. Eliminar el sobrenadante y chasquear suavemente el tubo para desalojar la pelotilla.
  7. Resuspenda las células en 2 mL de células madre medios suplementados con 2 inhibidor de camino de RHO/ROCK μm.
  8. Contar las células usando un contador de células automatizado.
  9. Células de la placa 300.000 por bien en 1 mL de células madre medios suplementados con 2 μm RHO/ROCK vía inhibidor y 6 puromicina μg/mL y placa de transferencia en incubadora de cultivo de tejidos.
  10. Actualizar los medios de comunicación diariamente con 2 mL de células madre medios suplementados con puromicina μg/mL 6 culturas hasta el 90% de confluencia. En este punto, iniciar la diferenciación cardiaca (siguiente paso).

4. diferenciación de hPSCsId1 en primer corazón campo-como progenitores cardiacos (CPs FHF-L)

  1. Para el formato de placa de 12 pozos, iniciar la diferenciación (día 0) mediante la sustitución de los medios de comunicación de la célula de vástago con 1,5 mL de medio de inducción (tabla 1) complementado con activina (100 ng/mL) (ver tabla 2 para recomienda volúmenes y Activin A concentraciones de placa diferentes formatos).
  2. El día 1 (24 h después de iniciada la diferenciación), sustituir los medios de comunicación con 2 mL de medio de inducción sin activina A (por pozo de una placa de 12 pozos).
  3. El día 3, sustituir los medios de comunicación con 2 mL de medio de inducción sin activina A (por pozo de una placa de 12 pozos).
  4. El día 5, recoger L FHF CPs para la criopreservación (siguiente paso).
    Nota: Importante: criopreservación se prefiere en este punto, ya que permite desacoplar la generación cardiacas progenitoras de cardiomiocitos posteriores lotes gran producción y Biobanco de células. Tenga en cuenta que como alternativa, día 5 CPs de FHF-L puede pasar a una placa recién revestida al continuar la diferenciación, por favor, consulte los pasos 5.1 – 5.5 a CPs passFHF-L y luego proceder a paso 6.5 para la diferenciación.

5. crioconservación de FHF-L CPs

  1. Aspirar todos los medios de los pozos que contienen día 5 L FHF CPs y rápidamente agregue 1 mL de caliente (37 ° C) 1 x reactivo de disociación que contiene la enzima (véase Tabla de materiales). Coloque la placa en la incubadora de cultivo de tejidos.
  2. Después de 1 minuto, agitar la placa en la incubadora de un lado a otro.
  3. Después de 2 minutos (tiempo total), extraiga la placa de la incubadora y añadir 1 mL de 10% FBS medios.
  4. Suavemente pipetear las células arriba y abajo con una pipeta de 5 mL para facilitar el desprendimiento de células de la placa.
  5. Recoger la suspensión de células a las células de tubo y de pellets de una centrífuga por centrifugación a 200 x g durante 3 min
  6. Resuspenda el precipitado de células en 2 mL de reactivo de criopreservación.
  7. Contar las células usando un contador de células automatizado.
  8. Añadir reactivo de criopreservación (véase Tabla de materiales) en un volumen suficiente para criopreservar las células de concentración deseada (normalmente 5-10 x 106 células/mL).
  9. Transferir las células a frascos de criopreservación y colocar los frascos en refrigeración dispositivo (1 ° C/min) y coloque el dispositivo de enfriamiento en el congelador de-80 ° C durante la noche.
  10. Después de 24 h, transferencia viales congelados en nitrógeno líquido para el almacenamiento a largo plazo.
    Nota: El protocolo se puede detener aquí.

6. FHF-L CP diferenciación en cardiomiocitos ventriculares como

  1. Transferencia frascos de día 5 L FHF CPs congelado de almacenamiento de nitrógeno líquido en recipiente de hielo seco.
  2. Colocar frascos en baño de agua de 37 ° C durante 2 a 3 minutos, hasta que la suspensión celular es descongelado por completo.
    Nota: Importante: el proceso de descongelación es sensible al tiempo. Exponer los medios de criopreservación de las células de una cantidad excesiva de tiempo (es decir, 10 min) disminuirá la viabilidad de las células.
  3. Transferir las células a 15 o 50 mL tubo de centrífuga, dependiendo del número de viales descongelados.
  4. Dispense gota a gota (5 gotas cada 30 segundos) precalentado (37 ° C) cardiogénico los medios de comunicación (tabla 1) a la solución de la célula. Continúe este proceso hasta una media de criopreservación de 1:3: cociente de medios cardiogénico es alcanzado. En este punto, aumentar la tasa de adición de medios cardiogénico hasta un 1:10 medios de criopreservación: relación medios cardiogénico se alcanza.
    Nota: Importante: cambios de osmolaridad rápido aumentará la muerte celular durante el proceso de descongelación; por lo tanto, adición gota a gota de medios cardiogénicas como se describe anteriormente es altamente recomendable.
  5. Centrifugar las células suspensión y pellet celular por centrifugación (200 x g durante 3 min).
  6. Eliminar el sobrenadante y flick suavemente el tubo de la centrífuga para remover el sedimento celulares.
  7. Resuspender las células con cardiogénicas medios suplementados con 2 inhibidor de camino de RHO/ROCK μm.
    Nota: Viabilidad de las células puede variar de deshielo al deshielo y, en general, > 65% viabilidad predice galjanoplastia de buena eficiencia.
  8. Diluido concentrado suspensión celular con cardiogénicas medios suplementados con 2 inhibidor de vía RHO/ROCK de μm para obtener la concentración deseada de la célula para placas (ver tabla 2 para placa diferentes formatos).
    Nota: Importante: tenga en cuenta que eficiencia diferenciación cardiaca puede disminuir si se siembran las células demasiado escaso.
  9. Células de la semilla en la placa.
  10. Mantenga la placa en la campana de cultivo de tejidos por 20 min antes de transferirla a incubadora de cultivo de tejidos.
  11. El día 6 de diferenciación, monitor accesorio celular.
    Nota: Progenitores cardiacos son congelados el día 5 de la diferenciación. 24 h después de descongelar las células sería el día 6 de la diferenciación.
    Nota: Es común la presencia de células (muertas) flotantes.
  12. En el día 7, Aspire el 50% de los medios de comunicación y sustituir por una cantidad igual de fresca media cardiogénico.
    Nota: La adición de inhibidor de la RHO/ROCK camino a los medios de comunicación cardiogénico no es necesaria, después de este punto.
  13. Reemplazar el 50% de los medios de comunicación con medios cardiogénicas cada otro día.
  14. Nota espontánea a aparece entre el día 11 y 13.
  15. El día 15, cuantificar la eficiencia cardiaca diferenciación por inmunofluorescencia usando DAPI (tinción de núcleo) y ACTC1 (marcador cardíaco de pan).

7. aprobación y mantenimiento de los cardiomiocitos ventriculares como

Nota: Día 14 – 16, debe obtenerse una capa monomolecular de contraer espontáneamente cardiomiocitos ventriculares como. En este punto, se sugiere disociar y volver a cardiomiocitos con el fin de homogeneizar la cultura y evitar que las células de extracción de la placa de la placa.

  1. Aspirar todos los medios de los pozos y rápidamente agregar 1 mL de precalentado (37 ° C) 1 x reactivo de disociación que contiene la enzima.
    Nota: 1 x volúmenes de reactivo de disociación que contiene la enzima varían dependiendo del formato de la placa, pero debe cubrir completamente la parte inferior de la superficie del pozo.
  2. Transferir la placa a una incubadora de cultivo de tejidos.
  3. Agite suavemente la placa de lado a lado cada 2 min dentro de la incubadora para acelerar el proceso de separación.
  4. Después de 5 – 15 min, 80% a 100% de las células son separado de la parte inferior de la placa, retire la placa de la incubadora e inhibir 1 x actividad de reactivo de disociación que contiene enzima mediante la adición de un volumen igual de medio de 10% FBS.
    Nota: Tiempo de incubación con la disociación que contiene enzima de x 1 para este proceso varía de lote a lote.
  5. Recoger la suspensión celular a un tubo de centrífuga.
  6. Mezcle la suspensión celular con pipeta y conteo de las células usando un contador de células automatizado.
  7. Diluir la suspensión celular de concentración de células deseada (véase tabla 2 para placa diferentes formatos) con los medios de mantenimiento suplementados con 2 inhibidor de camino de RHO/ROCK μm.
  8. Después de la siembra los cardiomiocitos en la placa, distribuya las células y permite a las células a conectar durante 10 – 20 min antes de transferir la placa a incubadora de cultivo de tejidos.
  9. 24 horas después de volver a platear, seguimiento de recuperación y adjunto de la celular.
    Nota: Es común la presencia de células (muertas) flotantes. 48 – 72 h después de volver a la galjanoplastia, cardiomiocitos deben reanudar la contracción espontánea.
  10. Para mantener la cultura de cardiomiocitos, reemplazar el 50% de los medios de comunicación con los medios de mantenimiento cada dos días hasta la utilización de cardiomiocitos ventriculares como para experimentos posteriores.

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Resultados

Generación de hPSCs Id1 líneas de
hPSCs están infectados por un lentivirus mediar Id1 sobreexpresión (figura 1A). Una vez que se generan hPSCId1 , expresión del transgen se cuantifica por qRT-PCR (figura 1B). HPSCId1 líneas expresan mRNA Id1 en niveles mayores que 0.005 veces el de GAPDH sólo ...

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Discusión

Para diferenciaciones exitosas, asegúrese de seguir de cerca las instrucciones mencionadas anteriormente. Además, aquí se destacan los parámetros fundamentales que influyen fuertemente en los resultados de la diferenciación. Antes de iniciar una diferenciación, deben observarse los siguientes tres parámetros morfológicos: una morfología del tallo de hPSCsId1, una alta compactación celular y una confluencia alta (> 90%) de la cultura en el día 0. En ese sentido, mejor se crean condiciones de diferenciación ópti...

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Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Agradecemos a los miembros del laboratorio de Colas para discusiones útiles y crítica del manuscrito. Este estudio fue apoyado por NIH/NIEHS R44ES023521-02 y CIRM DISC2-10110 otorga al Dr. Colas.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Anticuerpo ACTC1SigmaA7811
Activina ATecnologías de células madreHu Recom Activina A
Antibiótico Antimicótico (Anti)Thermo Fisher Scientific15240062
B27 sin insulinaThermo Fisher ScientificA1895601
Suplemento de B27 sin vitamina AThermo Fisher Scientific
anticuerpo CDH5R& D SystemsAF938
CryoStor CS10Stem Cell Technologies7930Reactivo de criopreservación
DMEM alta glucosaMediatech10-013-CV 
DPBS con Ca & MgCorning21-030-CV
EDTAThermo Fisher Scientific15575-038
FBSVWR89510-186
Kit de potencial de membrana FluoVolt   Thermo Fisher ScientificF10488Para la adquisición del potencial de acción óptica, consulte McKeithan et al. 2017
KnockOut Serum ReplacementGibco10828010
Matrigel, Corning ReducedCorning356231Coating reagent
mTeSR1 media kitStem Cell Technologies5850
PBS sin Ca & mgcorning21-040-CV
penicilina-estreptomicinagibco
puromicina Acros227422500
ReLeSRStem Cell Technologies5872Reactivo de disociación sin enzimas
RPMI 1640Thermo Fisher Scientific11875-093
Anticuerpo TAGLNAbcamab14106
TiazovivinaStem Cell Technologies72254Inhibidor de la vía RHO/ROCK
TrypLE ExpressThermo Fisher Scientific12605 -0101X reactivo de disociación que contiene enzimas
Tyrodes paquetes de mezcla de solución   SigmaT2145-10X1L(para la adquisición del potencial de acción óptica, consulte McKeithan et al. 2017)
Suplemento de B27 Thermo Fisher Scientific 17504044 12587001

Referencias

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