Aquí describimos un método escalable, con una simple combinación de activina A y mediada por el lentivirus Id1-sobreexpresión, para generar progenitores cardiacos primera de corazón como campo y ventricular como cardiomiocitos desde células madre humanas pluripotentes.
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Artículo de método
Generación del primer corazón campo-como progenitores cardiaca y Ventricular como cardiomiocitos desde células madre humanas pluripotentes
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Resumen
Resumen
La generación de grandes cantidades de progenitores cardiaca derivadas de células madre pluripotentes humanas funcionales y cardiomiocitos de origen de campo de corazón definidos es un requisito previo para celular cardiacas terapias y modelos de enfermedad. Recientemente hemos demostrado que los genes de Id son necesarios y suficientes para especificar los primeros progenitores de campo de corazón durante el desarrollo de vertebrados. Este protocolo de diferenciación aprovecha estos resultados y utiliza Id1 sobreexpresión en combinación con la activina A como potentes señales especifica para producir los primeros progenitores de (FHF-L) de campo como de corazón. Importante, progenitores que resulta distinguen eficientemente (~ 70-90%) en cardiomiocitos ventriculares como. Aquí describimos un método detallado para 1) generar hPSCs overexpressing Id1 y 2) diferenciar cantidades escalables de progenitores de FHF-L cryopreservable y cardiomiocitos ventriculares como.
Introducción
Producción a gran escala de las células madre pluripotent humanas (hPSCs)-derivados progenitores cardíacos y cardiomiocitos es un requisito previo para terapias basadas en células madre1, modelo2,3 y la caracterización rápida de la enfermedad nuevos caminos que regulan diferenciación cardiaca4,5,6 y fisiología7,8. Aunque un número de estudios9,10,11<....
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Protocolo
1. infección y la preparación de Virus Id1
- Generar Id1 expresando lentivirus por transferencia Co pCMVDR8.74, pMD2.G y pCDH-EF1-Id1-PGK-PuroR (Addgene: plásmido 107735 #) en las células HEK293T. Recoger partículas virales, filtrar, purificar del sobrenadante y almacenar a-80 ° C como en Kitamura et al. (2003) 19. producir alternativamente, Id1 lentivirus comercialmente enviando pCDH-EF1-Id1-PGK-PuroR a un proveedor de productores de lentivirus.
PRECAUCIÓN: Siga lentivirales normativas y protocolos de operación estándar.
Nota: Importante: título de virus óptima debe estar por lo menos 108 109 Transd....
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Resultados
Generación de hPSCs Id1 líneas de
hPSCs están infectados por un lentivirus mediar Id1 sobreexpresión (figura 1A). Una vez que se generan hPSCId1 , expresión del transgen se cuantifica por qRT-PCR (figura 1B). HPSCId1 líneas expresan mRNA Id1 en niveles mayores que 0.005 veces el de GAPDH sólo .......
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Discusión
Para diferenciaciones exitosas, asegúrese de seguir de cerca las instrucciones mencionadas anteriormente. Además, aquí se destacan los parámetros fundamentales que influyen fuertemente en los resultados de la diferenciación. Antes de iniciar una diferenciación, deben observarse los siguientes tres parámetros morfológicos: una morfología del tallo de hPSCsId1, una alta compactación celular y una confluencia alta (> 90%) de la cultura en el día 0. En ese sentido, mejor se crean condiciones de diferenciación ópti.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Agradecemos a los miembros del laboratorio de Colas para discusiones útiles y crítica del manuscrito. Este estudio fue apoyado por NIH/NIEHS R44ES023521-02 y CIRM DISC2-10110 otorga al Dr. Colas.
....Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Anticuerpo ACTC1 | Sigma | A7811 | |
| Activina A | Tecnologías de células madre | Hu Recom Activina A | |
| Antibiótico Antimicótico (Anti) | Thermo Fisher Scientific | 15240062 | |
| B27 sin insulina | Thermo Fisher Scientific | A1895601 | |
| Suplemento de B27 sin vitamina A | Thermo Fisher Scientific | ||
| anticuerpo CDH5 | R& D Systems | AF938 | |
| CryoStor CS10 | Stem Cell Technologies | 7930 | Reactivo de criopreservación |
| DMEM alta glucosa | Mediatech | 10-013-CV | |
| DPBS con Ca & Mg | Corning | 21-030-CV | |
| EDTA | Thermo Fisher Scientific | 15575-038 | |
| FBS | VWR | 89510-186 | |
| Kit de potencial de membrana FluoVolt | Thermo Fisher Scientific | F10488 | Para la adquisición del potencial de acción óptica, consulte McKeithan et al. 2017 |
| KnockOut Serum Replacement | Gibco | 10828010 | |
| Matrigel, Corning Reduced | Corning | 356231 | Coating reagent |
| mTeSR1 media kit | Stem Cell Technologies | 5850 | |
| PBS sin Ca & mg | corning | 21-040-CV | |
| penicilina-estreptomicina | gibco | ||
| puromicina | Acros | 227422500 | |
| ReLeSR | Stem Cell Technologies | 5872 | Reactivo de disociación sin enzimas |
| RPMI 1640 | Thermo Fisher Scientific | 11875-093 | |
| Anticuerpo TAGLN | Abcam | ab14106 | |
| Tiazovivina | Stem Cell Technologies | 72254 | Inhibidor de la vía RHO/ROCK |
| TrypLE Express | Thermo Fisher Scientific | 12605 -010 | 1X reactivo de disociación que contiene enzimas |
| Tyrodes paquetes de mezcla de solución | Sigma | T2145-10X1L | (para la adquisición del potencial de acción óptica, consulte McKeithan et al. 2017) |
Referencias
- Chong, J. J., et al. Human embryonic-stem-cell-derived cardiomyocytes regenerate non-human primate hearts. Nature. 510, 273-277 (2014).
- Kodo, K., et al. iPSC-derived cardiomyocytes reveal abnormal TGF-....
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Reimpresiones y permisos
