Optimizado el ensayo de rayado para In Vitro pruebas de migración de la célula con una cámara óptica automatizada

Summary

Aquí describimos un procedimiento para probar la migración la célula en vitro con un microscopio de cámara óptica automatizada. El ensayo de rayado ha sido ampliamente utilizado donde el cierre de la raya es seguido por un período determinado. El microscopio óptico permite la detección confiable y barata de migración de la célula.

Abstract

Migración celular es un proceso importante que influye en muchos aspectos de la salud, como la cicatrización de heridas y el cáncer, y por lo tanto, es crucial para el desarrollo de métodos para el estudio de la migración. El ensayo de rayado ha sido el método más común de en vitro para probar compuestos con propiedades anti y pro migration debido a su bajo costo y simple procedimiento. Sin embargo, un problema a menudo informado del ensayo es la acumulación de células en el borde de la raya. Además, para obtener datos de lo análisis, imágenes de diferente exposición deben tomarse durante un período de tiempo en el mismo lugar exacto para comparar los movimientos de la migración. Programas de análisis diferentes pueden utilizarse para describir el cierre scratch, pero son intensivas en mano de obra, inexacto y las fuerzas de los ciclos de cambios de temperatura. En este estudio, demostramos un método optimizado para probar el efecto de la migración, por ejemplo con las proteínas que ocurren naturalmente humanos y bovinos lactoferrina y su péptido N-terminal Lactoferricin en la línea de células epiteliales HaCaT. Una optimización crucial es lavar y rayar en PBS, que elimina la mencionada acumulación de células en el borde. Esto podría explicarse por la eliminación de cationes, que han demostrado tener un efecto en la conexión de la célula de queratinocitos. Para asegurar la detección real de la migración, previo tratamiento con mitomicina C, un inhibidor de la síntesis de ADN, fue agregado al Protocolo. Finalmente, demostramos la automatizado óptica cámara, que elimina los ciclos de temperatura excesiva, mano de obra con el análisis de cierre scratch, mejora en la reproducibilidad y garantizando el análisis de secciones idénticas de cero con el tiempo.

Introduction

La migración es un proceso importante que influye en varios aspectos fisiológicos. En la cicatrización de heridas, migración facilita la re-epitelización de la piel. En las heridas no cicatrizan, como heridas crónicas, bacterias oportunistas causan infección de la herida, y las heridas abiertas son ideales para el crecimiento de bacterias y formación de biofilm^1,2. Biofilm es una de las causas del desarrollo de bacterias resistentes, que es una de las mayores amenazas a nuestra sociedad moderna³. En la curación de la herida, las células inmunitarias no pueden penetrar el biofilm. En el ....

Protocol

El montaje experimental no tiene ninguna restricción ética y jurídica y se llevó a cabo de acuerdo con la Universidad de Roskilde. Una visión general del montaje experimental se aprecia en la figura 1 y los mecanismos de la cámara óptica en la figura 2.

1. preparación

1. Realizar todos los pasos en un banco de flujo laminar estéril limpiar la banca y todos los equipos con etanol al 70% antes del inicio del experimento.
2. Coloque la cámara óptica en una incubadora convencional a 37 ° C con 5% CO₂ para garantizar las condiciones óptimas para las células.

Results

HaCaT es una línea de celular de queratinocitos, uno de los tipos celulares más abundantes en la piel. Cuando se produce una herida, las células de la piel comienzan a proliferar y migrar más al lecho de la herida para cerrar la herida (figura 3). Ambos procesos son, por lo tanto, de suma importancia para la curación adecuada.

La cámara óptica puede seguir ambos procesos en tiempo real. Para la migr.......

Discussion

La importancia de la migración en los estudios del desarrollo, la cicatrización de heridas, Inmunología y cáncer ha llevado a varios métodos para estudiar la migración. La migración puede ser una expresión de la expansión o el cierre de la brecha por las células. Se prueba más a menudo posible cierre del cero, que es más fácil crecer las células en una monocapa y luego hacer un rasguño que el crecimiento de las células en forma específica⁸. Nuestro estudio demuestra un método optimizado para rayar.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
oCelloScope	BioSense Solution ApS		Cámara óptica
UniExplorer software	BioSense Solution ApS		(8.0.0.7144 (RL3))
Célula			donada por el Hospital Bispebjerg
DMEM (1x) + GlutaMAX	Gibco	31966-021	Medio para HaCaT
FBS	Gibco	10270	Suero fetal bovino
PBS	Gibco	D837	Sin Mg+ y Ca2+
Pencillin-Estreptomicina	Sigma	P0781	Antibióticos
Tripsina (10x)	Sigma	T3924
Mitomicina C	Tocris	3258	Inhibe la proliferación Placa
microtitulación	Greiner Bio-one	677 180
Incubadora	Panasonic		37° C, 5% CO2
Hemocitómetro	Assistent		Tü rk (0.1 mm)
Pipeta	Accu-Jet pro