一种新型的腱绦缝合技术，采用组织工程胶原蛋白移植物修复大肌腱缺损

Summary

在本文中，我们提出了一种 体外 和 原位 方案，通过用工程胶原移植物填充高达1.5厘米的肌腱间隙来修复该肌腱间隙。这是通过开发一种改良的缝合技术来承担机械负荷，直到移植物成熟到宿主组织中来实现的。

Abstract

使用肌腱移植物对大肌腱缺损进行手术治疗具有挑战性，因为可以很容易地识别和使用供体的部位数量有限。目前，这个间隙充满了肌腱自体，同种异体，异种或人工移植物，但由于规模的原因，确保它们的临床方法不一定可以转化为动物。为了评估新的生物材料或研究由1型胶原蛋白组成的肌腱移植物，我们开发了一种改良的缝合技术，以帮助保持工程肌腱与肌腱末端对齐。这些移植物的机械性能不如天然肌腱。为了将工程肌腱纳入临床相关的负荷修复模型，采用了一种策略来卸载组织工程肌腱移植物，并允许工程肌腱 在体内 成熟和整合，直到形成机械上健全的新肌腱。我们使用结合1型胶原组织工程肌腱构建体来描述这种技术。

Introduction

肌腱断裂可能是由于外在因素引起的，例如创伤性撕裂伤或肌腱负荷过重。由于施加在肌腱修复上的外部拉力，大多数肌腱修复技术不可避免地会形成间隙。目前，肌腱缺陷/间隙由自身、同种异体、异种或人工移植物填充，但它们的可用性是有限的，供体部位是发病的来源。

从天然聚合物（如胶原蛋白）制造肌腱移植物的组织工程方法具有生物相容性的独特优势，可以提供重要的细胞外基质（ECM）成分，促进细胞整合。然而，由于缺乏原纤维对准，工程肌腱（ET）的机械性能不如天然肌腱。为了增加较弱胶原蛋白的机械性能，已经使用了许多方法，例如真空下的物理交联，紫外线辐射和脱水热处理^1。此外，通过与核黄素的化学交联，酶法和非酶法在体外增加了胶原蛋白的密度和杨氏模量^2、3。然而，通过添加交联剂，胶原蛋白的生物相容性受到损害，因为研究表明机械性能发生了33%的变化，细胞活力损失了40%3，4，5 。对准和机械强度的逐渐累积可以通过循环载荷⁶获得;然而，这可以有效地获得in vivo^7。

为了使ET在体内整合并获得强度而无需化学改变，一种方法是使用稳定缝合技术将较弱的结构固定到位。大多数肌腱修复依靠缝合设计将肌腱末端固定在一起;因此，对这些现有技术的修改可以提供逻辑解^8，9。

直到20世纪80年代，2股修复被广泛使用，但最近的外科文献描述了在修复^{10，11中使用4股，6}股甚至8股。1985年，Savage描述了具有6个锚点的6股缝合技术，并且比使用4股¹²的Bunnell缝合技术要强得多。此外，在尸体和原位模型中，8股修复比其他链强43%，但这些修复并未被广泛实施，因为在技术上很难准确再现修复13，14，15，16。因此，更多的核心缝合线与修复肌腱的生物力学特性的比例增加有关。然而，缝合点周围细胞活力丧失，过度缝合造成的创伤可能会损害肌腱，这可能会损害肌腱愈合¹⁷。缝合技术应提供平衡且相对无弹性的强几何修复，以尽量减少修复后的肌腱间隙。此外，缝合线的位置及其结必须有策略地放置，以便它们不会干扰滑动，血液供应和愈合，直到获得足够的强度积累^10，18。

为了确定在肌腱断裂之间确保较弱的ET移植物或其他移植物材料的可行性，我们开发了一种新颖的缝合技术，可以卸载移植物，使其成熟并逐渐整合到体内的宿主组织中 。

Protocol

注意：实验设计和伦理批准是从UCL机构审查委员会（IRB）获得的。所有实验均根据内政部的规定和1986年动物（科学程序）法的指导方针以及欧洲指令2010/63 / EU（2013）的修订立法进行。兔子由指定的兽医（NVS）定期检查，并由指定的动物护理和福利官员（NACWO）在一天内检查两次（根据内政部的指导方针和规定）。在他们被安乐死之前，他们没有表现出任何疼痛的迹象。

1. 组织工程肌腱（ET）移植物的制备

1. 要制造胶原蛋白水凝胶，加入4mL大鼠尾胶原蛋白1型单体胶原蛋白溶液（2.15mg / mL在0.6%乙酸中，总蛋白的0.2%w / v）和500μL10x最小必需培养基。通过滴定5 M和1M氢氧化钠并加入500μLDulbecco的改性鹰培养基（DMEM）来中和它。
2. 将5 mL该溶液倒入定制的矩形金属模具（33 mm ×22 mm ×10 mm，120 g重量）（图1）。将模具在37°C和5%CO₂的CO₂培养箱中保存15分钟，以允许基质组装^19。

2. 嫁接物的制作

1. 聚合后，从模具中取出胶原水凝胶，放入标准塑料压缩组件（图2^A）19。
2. 将胶原蛋白水凝胶置于两片50μm尼龙网片之间，并施加120g的静态载荷（总表面积7.4cm^2，相当于1.6 kPa的压力）5分钟，以从水凝胶中除去间隙液（图2A）。使用四层滤纸吸收水凝胶中排出的流体。
3. 使用四层彼此叠加的压缩凝胶（图2B）并切成15毫米的片段（图2C）来制造ET。
   注：实验中使用了16-25周龄的新西兰白兔。
4. 用肌内注射（i.m）剂量的催眠药（0.3mg / mL）镇静动物，并通过施用过量的戊巴比妥来安乐死。
5. 安乐死后立即修剪两条后腿的头发。然后用20号手术刀片，在下胫腓骨区域周围做一个9厘米的切口，以暴露胫骨后（TP）肌腱。
6. 使用相同大小的手术刀片，切除平均长度为70毫米的拉平TP肌腱，并在实验过程中保持PBS湿润，以避免干燥。

3. 开发新型腱鞘技术

注：缝合线（见 材料表）是不可吸收的，由聚丙烯的等同立构晶体立体异构体制成，聚丙烯是一种合成的线性聚烯烃。核心联锁缝合线主要由3-0组成，外周缝合线为6-0。这是所有实验中使用的两种主要缝合线。

1. 用手术刀片切除中点的TP肌腱。从肌腱中间切除15毫米的肌腱段，并用ET胶原移植物代替它（图2D）。将3-0缝合线与天然肌腱末端近端互锁（图3A）。
2. 将3-0的核心缝合线传递到整个移植物长度上方，并联锁远离切割端。
3. 通过耦合两个肌腱末端，用6-0和围绕外围的连续运行缝合线将ET的两端固定到原生肌腱上（图3B）。这样做是为了通过将张力施加在原生肌腱²⁰上，可以轻松地在缝合线上移动移植物。
4. 如上所述固定缝合线后，手动确保缝合线上的张力适当，并且整个缝合线没有松弛。

Representative Results

我们使用由I型胶原蛋白制成的胶原蛋白移植物，因为这是肌腱中发现的主要蛋白质。它几乎占肌腱中总胶原蛋白的95%;因此，胶原蛋白在体内表现出模仿肌腱的所有理想特性^21，22。

在这项研究中，从大鼠尾腱中提取使用的I型胶原蛋白并溶解在乙酸（2.15mg / mL）中。为了聚合这种胶原蛋白，它在 体外 用氢氧化钠中和，形成非交联各向异性的胶原原纤维。该水凝胶含有98%的液体，并且可以在制造过程中 在 20分钟内模拟体内活组织²³。然而，这种水凝胶在机械上是弱的;因此，为了提高机械性能，我们开发了一种通过称为"塑料压缩"的技术快速压缩胶原蛋白水凝胶的方法，其中压缩程度与顶部的应用重量成正比，并从流体离开表面释放的流体^（FLS）19。

这种移植物的螺旋滚动增加了它的机械性能^19，但移植物仍然明显弱于原生肌腱。为了解决这个问题，我们开发了一种新的改良缝合技术，通过将缝合点放置在不是在断裂肌腱的边缘，而是在近端和远端。因此，修复的强度在于缝合线和缝合点，而不是机械上较弱的肌腱移植物。

为了证明所开发的新型缝合技术的功能，切除了拉平TP肌腱。用15毫米长的肌腱移植物填充间隙，用6-0缝线固定，并将3-0个互锁缝合线放置在70毫米处作为负载屏障（图3A）。修复的平均断裂强度为50.62±8.17 N，明显<高于对照凯斯勒修复的12.49±1.62 N（图4A）。因此，核心缝合线长度及其远离肌腱末端的互锁显着影响肌腱的阻力和在较高幅度力^24，25下失效的修复。

这种阻力在控制修复中不足，导致早期修复失败和肌腱应变失败超过20%。然而，这是一种生理异常，因为体内的肌腱永远不会受到20%的压力，因为没有足够的空间让肌腱伸展那么多;因此，为了测试缝合技术在体内模型中的可行性，我们原位进行了修复，并计算出平均断裂强度为24.60±3.92 N，明显高于控制平均断裂强度13.98±2.26 N（图4B）。

图1：中和胶原蛋白水凝胶（pH 7.4）（粉红色）铸在不锈钢模具中。 将凝胶留在37°C的CO₂ 培养箱中20分钟，以发生纤维发生。比例尺显示在底部。 请点击此处查看此图的放大版本。

图2：塑料压缩过程。（A） 胶原蛋白水凝胶放置在尼龙网之间，施加恒定的静载荷为120克。沥干的液体被四层滤纸吸收。箭头显示凝胶的离开表面的流体（FLS）。 （B） 四层压缩胶原蛋白片沿轴滚动形成"工程肌腱"（ET）。 （C）ET 的部分被切成15毫米的片段以模仿肌腱。 （D） 通过切除胫骨后肌腱的15mm段，在天然肌腱（NT）中产生肌腱缺损，并且用ET填充缺损。此面板是从以前的工作^{修改而来的 26}. 请点击此处查看此图的放大版本。

图3：（A） 用ET填充肌腱缺陷并用6-0缝合线固定，并在30mm区域的移植物上方进行3-0联锁四线缝合技术。块箭头显示缝合线的起点，空白箭头显示缝合线的终点。此面板是从以前的工作^{修改而来的 26}. （B） 在拉皮内模型（原位）的空间内进行开发缝合技术的可行性。 请点击此处查看此图的放大版本。

图4：机械强度。（A）修复的机械测试输出和（B）原位机械测试输出（误差条=SD;*p<0.05，单因子方差分析与Bonferroni校正）。此面板是从以前的工作^{修改而来的 26}.请点击此处查看此图的放大版本。

Discussion

在这项研究中，组织工程I型胶原移植物被选为肌腱移植物，因为胶原蛋白是一种天然聚合物，并用作各种组织工程应用的生物材料^27，28。 此外，胶原蛋白占肌腱干质量的60%，其中95%是1型胶原蛋白21，29，30，31，32。 为了成功植入，移植物的机械性能应理想地与天然肌腱³³相匹配;然而，以目前的工程技术，ET（4.41 N）的机械性能明显不如天然肌腱（NT）（261.08^N）33。有人提出，这是由于原生肌腱中胶原原纤维的高度组织化的分层排列，这仍然是设计和匹配其机械性能的挑战³⁴。我们试图通过对胶原水凝胶³³施加静态压缩来增加ET基质的密度;然而，肌腱获得其力量的建筑复杂性更加复杂。积累机械强度的方法可以说是在体内获得的最好方法，其中宿主生物过程可以作用于细胞外基质的重塑。因此，在本研究中，采用了另一种策略来修改当前的缝合技术作为肌腱修复后;修复的肌腱移植物的机械强度完全取决于缝合技术^8，9。因此，通过修改现有的缝合技术，我们可以卸载工程肌腱移植物，直到细胞和ECM诱导的重塑作为一种新方法发生。

迄今为止，有各种缝合技术可用于修复肌腱，但没有一个是黄金标准;然而，改良的凯斯勒缝合技术被广泛用于修复肌腱，因为它对肌腱的阻塞和损伤较小^35，36。据报道，当用6股Savage技术缝合时，羔羊的屈肌指骨深部肌腱具有51.3 N的断裂强度，但是当使用改进的Kessler缝合技术时，断裂强度为69.0 N⁷。然而，在这项研究中，当用ET填充15mm的肌腱间隙并用改良的Kessler缝合技术修复时，修复在早期阶段失败，断裂强度为12.49 N（图4）。这种低值使得该技术在临床上无关紧要。De Wit等人在猪屈肌修复肌腱模型中报告了类似的发现，表明与十字修复相比，Kessler修复在缝合断裂时失败15%，其中间隙减少87%，缝合拉出时修复失败^38。因此，需要另一种强力缝合技术，该技术可以将机械上较弱的ET固定到位。

通过使用在ET的整个长度和对侧肌腱上方使用四个核心缝合线，开发了一种新的改良缝合技术。这些缝合线在距离每个肌腱端一定距离处联锁到缝合材料本身上。这主要是因为据报道，将缝合线打结放在所有缝合线上的相等距离和相等的负载分配张力会增加其机械性能³⁹。平衡修复也可以通过保持连续缝合线，并错开修复以允许在修复站点⁴⁰处压缩来实现。

本研究采用3-0缝合线进行外联缝合，认为兔TP肌腱的长度、宽度和厚度分别为62.4 mm、5 mm和1.5 mm。使用6-0缝合线将ET固定到位。尽管我们已经尝试了其他可吸收的缝合材料，但由于它们在 体内⁴¹的一段时间内会变弱，因此不合适。选择聚丙烯缝合线的主要原因是因为它们是单丝且不可吸收，并且在负载下不会引起结构或张力修饰⁴²。我们测试了从2-0到7-0的所有缝合线，但发现3-0和6-0是我们实验的理想候选者 ²⁶。

使用4股修复的主要原因是避免对断裂的肌腱末端造成过度损伤，因为据报道，肌腱中的正常手术缝合导致无细胞区域^的形成43。据推测，这是由于细胞从施加在肌腱上的压缩载荷中移出，并且通常这些细胞会受到拉伸载荷¹⁷。这种细胞远离缝合线的迁移可能导致基质的减弱，因为缺乏细胞来维持和更新基质，这可能导致早期肌腱衰竭¹⁷。我们可以使用更多的缝合线，其生物力学强度（离体）是4链缝合线11，12，44，45的两倍;然而，这些修复并未被广泛实践，其临床局限性目前正在评估13，14，15，16。

缝合线结的位置很重要，但有论据支持和反对将缝合线外化。在外表面上缝合线可能会卡住肌腱滑轮等结构并减少滑动。在一项研究中，将缝合结放置在内部的区域表明，与Kessler修复相比，滑动阻力降低，Kessler修复在⁴⁶外部具有缝合结 。在犬模型中进行的研究得出结论，在较高幅度的力下，与位于修复内部的缝合结相比，位于修复外部并远离肌腱末端的缝合结较少^47，48。然而，内化结可能会减少愈合肌腱的接触面。还需要考虑的是，组织损伤是由缝合针刺穿肌腱引起的，并且更多的通过与增加的肌腱创伤有关⁴⁹。

为了确保肌腱间隙之间的ET，沿着肌腱边缘和ET进行⁵⁰次缝合的标准。这样做是因为需要足够坚固的外周缝合线，以便在愈合的初始阶段将ET固定到位，直到细胞和ECM诱导的重塑可能发生⁵⁰。主要问题是NT和ET的机械性能的变化，尽管ET是应力屏蔽的，但这可能导致早期的间隙形成。另一方面，应用更安全的技术如水平床垫纤维内缝合线51，Halsted连续水平床垫缝合线^52，53，十字绣附着修复技术54，55，56，57或运行锁缝合线^58，59 会破裂ET，因为它是脆弱的。因此，我们选择运行缝合线作为外围缝合技术，该技术简单且在所有方向上保持ET完好无损。

从组织工程的角度来看，我们需要研究这种方法是否可用于填充大于1.5厘米的肌腱间隙。为了在人体临床试验中使用这种移植物，我们需要进一步研究对胶原蛋白异源源的免疫反应，尽管这可以通过开发临床级胶原蛋白来实现。本文中描述的方案建立了在猪拉皮尼模型中可用解剖空间内开发的缝合技术的可行性。这种发达的缝合技术具有远离断裂肌腱末端的近端和远端等距的缝合点，因此工程肌腱移植物可以卸载。因此，它可以成熟并融入 体内。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Rat tail type 1 Collagen	First Link, Birmingham, UK	60-30-810
prolene sutures 6-0	Ethicon Ltd, Edinburgh, U.K.	EP8726H
prolene sutures 3-0	Ethicon Ltd, Edinburgh, U.K.	D8911
Whatman filter paper	SIGMA-ALDRICH	WHA10010155
Gibco DMEM, high glucose	Thermo Fisher Scientific	11574486
Nylon mesh	Plastok (Meshes and Filtration) Ltd.	NA