Un método Simple y Reproducible para preparar muestras de membrana de microvasos de cerebro recién aislado de rata

Summary

Aquí, se describe un método para el aislamiento de microvasos de cerebro de rata y para la preparación de las muestras de la membrana. Este protocolo tiene la ventaja clara de producir enriquecido microvessel muestras con proteínas aceptable rendimiento de animales individuales. Muestras pueden utilizarse para análisis de proteína sólida en el endotelio microvascular cerebral.

Abstract

La barrera blood - brain (BBB) es un tejido de barrera dinámica que responde a varios estímulos fisiopatológicos y farmacológicos. Tales cambios resultantes de estos estímulos pueden grandemente modular la entrega de la droga al cerebro y, por extensión, causan grandes desafíos en el tratamiento del sistema nervioso central (SNC) enfermedades. Muchos cambios BBB que afectan a la farmacoterapia, involucran proteínas que son localizadas y expresadas en el nivel de las células endoteliales. De hecho, tales conocimientos sobre fisiología BBB en salud y enfermedad ha despertado considerable interés en el estudio de estas proteínas de membrana. Desde un punto de vista de investigación de ciencia básica, esto implica un requisito para un método simple pero robusto y reproducible para el aislamiento de los microvasos del tejido de cerebro de animales experimentales. Para preparar muestras de membrana de microvasos recién aislados, es imprescindible que preparaciones de muestra enriquecidas en células endoteliales pero limitadas en presencia de otros tipos de la célula de la unidad neurovascular (astrocitos, microglía y neuronas, pericitos). Un beneficio adicional es la capacidad para preparar muestras de animales individuales con el fin de captar la verdadera variabilidad de expresión de proteínas en una población experimental. En este manuscrito, se proporcionan detalles con respecto a un método que se utiliza para aislamiento de microvasos de cerebro de rata y preparación de muestras de la membrana. Enriquecimiento de microvasos, de muestras derivadas, se logra con cuatro pasos de centrifugación donde dextrano está incluido en el tampón de muestra. Este protocolo puede ser adaptado fácilmente por otros laboratorios para sus aplicaciones específicas. Muestras generadas de este protocolo se han demostrado para producir datos experimentales sólidos de los experimentos de análisis de proteína que pueden ayudar grandemente a la comprensión de las respuestas BBB a estímulos fisiológicos, fisiopatológicos y farmacológicos.

Introduction

La barrera blood - brain (BBB) existe en la interfase entre el sistema nervioso central (SNC) y la circulación sistémica y juega un papel esencial en el mantenimiento de la homeostasis cerebral. Específicamente, las funciones BBB a precisamente control soluto concentraciones en el líquido extracelular cerebral y suministrar eficientemente los nutrientes requeridos para satisfacer las demandas metabólicas considerable del CNS¹por tejido cerebral. Estas funciones implican que el BBB, que existe principalmente en el nivel de la célula endotelial microvascular, debe poseer mecanismos discretos que permiten algunas sustancias a parénquima cerebral a....

Protocol

Todos los procedimientos descritos a continuación han sido aprobados por un cuidado institucional del Animal y el Comité uso (IACUC) y se ajustan a la investigación Animal e institutos nacionales de salud (NIH): directrices de experimentos (llegar) En Vivo . El flujo de procedimientos para el protocolo se muestra en la figura 1.

1. preparación para el procedimiento

1. Preparar el buffer del microvessel de cerebro (BMB). Inicie pesando 54,66 g D-mannitol, 1,90 g EGTA y base de 2-amino-2-(hydroxymethyl)-1,3-propanediol (es decir, Tris) 1,46 g en un vaso limpio. Añadir 1,0 L de agua desionizada. Me....

Results

El flujo experimental para el aislamiento de microvasos de cerebro de rata y para la preparación de las muestras de membrana de microvasos se muestra en la figura 1. Utilizando el procedimiento presentado aquí, se demostró acertado aislamiento de microvasos intacto del cerebro de la rata (figura 2A). Estos buques fueron obtenidos después de la centrifugación con dextrano e inmediatamente antes de comenzar la ultracentrifugación p.......

Discussion

En este artículo, se describe un método simple y eficaz de preparación de muestras de proteínas de membrana de microvasos recién aisladas de tejido cerebral de rata. Varios enfoques para aislamiento de microvasos de cerebro de rata o generación de las preparaciones de membrana de microvasculatura aislada se han divulgado en la literatura^{13,20,21,22 , 24}. Si bi.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cóctel de inhibidores de proteasas	Sigma-Aldrich	#P8340	Componente del tampón de microvasos cerebrales
D-manitol	Sigma-Aldrich	#M4125	Componente del tampón de microvasos cerebrales
EGTA	Sigma-Aldrich	#E3889	Componente del tampón de microvasos cerebrales
Trizma Base	Sigma-Aldrich	#T1503	Componente del tampón de microvasos cerebrales
Dextrano (MW 75,000)	Spectrum Chemical Mftg Corp	#DE125	Dextrano utilizado en pasos de centrifugación para separar microvasos del parénquima
cerebral Zetamina	MWI Animal Health	#501072	Anestésico general
Xilacina	Western Medical Supply	#5530	Anestésico general
Solución salina al 0,9%	Western Medical Supply	N/A	Anestésico general diluyente
Papel de filtro (12,5 cm de diámetro)	VWR	#28320-100	Se utiliza para la extracción de meninges del tejido cerebral
Tubos de centrífuga	Sarstedt	#60.540.386	Tubos desechables utilizados para los pasos de centrifugación de dextrano
Pierce™ Ensayo Coomassie Plus (Bradford)	ThermoFisher Scientific	#23236	Medición de la concentración de proteínas en preparaciones de membrana
Wheaton Overhead Power Homogenezer	DWK Life Sciences	#903475	Necesario para la homogeneización de muestras
10,0 ml de mortero de vidrio trituradora de tejidos	DWK Life Sciences	#358039	Necesario para la homogeneización de muestras
Ácido clorhídrico	Sigma-Aldrich	#H1758	Necesario para el ajuste del pH de los tampones
Albúmina sérica bovina	ThermoFisher Scientific	#23210	Estándar de proteínas para el ensayo Bradford
Pinzas estándar Fine	Science Tools	#91100-12	Utilizado para la disección del tejido cerebral
Friedman-Pearson Rongeurs	Fine Science Tools	#16020-14	Utilizado para abrir el cráneo para aislar el cerebro
Tubos de centrífuga cónicos de 50 ml	ThermoFisher Scientific	#352070	Se utiliza para la recolección de tejido cerebral después del aislamiento
Vidrio Pasteur Pipets	ThermoFisher Scientific	#13-678-20C	Se utiliza para la aspiración de residuos celulares después de los giros de dextrano
Etanol anhidro	Sigma-Aldrich	#459836	Se utiliza para limpiar el molinillo de tejidos; diluido al 70% con agua
destiladaTubos de ultracentrífuga	Beckman-Coulter	#41121703	Se utilizan para la ultracentrifugación de muestras